參苓白術(shù)散對NAFLD大鼠肝細胞PTEN和PI3Kp85α mRNA及其蛋白表達的影響

★ 陸雪萍 黃進 韋靜 梁新安 方顯利 韋芳芳（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院 南寧 530199）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）又稱為非酒精性脂肪肝，是指除酒精和其他明確因素引起的，以肝實質(zhì)細胞變性壞死、炎性細胞浸潤、脂肪貯積等為主要特征的綜合性代謝應(yīng)激性肝臟損傷［1］。NAFLD包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)性肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌［2］。研究表明，NAFLD屬遺傳-環(huán)境-代謝相關(guān)性疾病，其臨床表現(xiàn)除肝功能異常及因疾病發(fā)展而表現(xiàn)出的相應(yīng)癥狀體征之外，還存在如肥胖、高血壓、高血糖、高血脂等代謝異常情況［3-4］。目前，NAFLD發(fā)病率增長迅速且呈低齡化發(fā)展趨勢，是全球最常見的慢性肝病，嚴重危害人類健康［5-7］，已成為肝病組織及相關(guān)學(xué)者研究和防治的熱點。磷酸酶張力蛋白同系物（phosphoatase and tensin homolog，PTEN）是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵負反饋調(diào)節(jié)子，PTEN 水平下降會導(dǎo)致肝脂質(zhì)蓄積，PI3K則介導(dǎo)著機體營養(yǎng)代謝、細胞生長、增值、凋亡等，兩者在NAFLD 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［8-11］。本實驗通過高脂飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，觀察參苓白術(shù)散對NAFLD大鼠肝細胞PTEN和PI3Kp85α mRNA及其蛋白表達的影響，以闡釋參苓白術(shù)散對NAFLD大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002，常規(guī)飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、健脾低劑量組和健脾高劑量組，每組15只。

1.2 實驗用藥與配置

參苓白術(shù)散（廣東一方制藥有限公司中藥配方顆粒劑）：人參15 g，茯苓15 g，白扁豆12 g，薏苡仁9 g，白術(shù)15 g，砂仁6 g，蓮子9 g，山藥15 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。低劑量為人臨床等效劑量，將藥物溶于300 mL溫開水中；高劑量為人臨床等效劑量的3倍用量，將藥物溶于100 mL溫開水中。

1.3 主要試劑

Quant cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京天根生化科技有限公司（貨號：KR103-04）；Real Time PCR熒光定量試劑盒購自Gene Copoeia公司（貨號：QP051）；ACTB購自Cloud-Clone Corp公司（貨號：CAB340Mi22）；PTEN Antibody購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（貨號：Bsm-33319M）；PI3Kp85α Antibody購自南京建成生物生物工程研究所（貨號：KF650）；胎牛血清購自Corning Cellgro公司（貨號：35-081-CV）；IV型膠原酶購自廣州美侖生物科技有限公司（貨號：MB2711）；細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：P8370）。

1.4 模型建立

除正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其他3組均以高脂飼料（以基礎(chǔ)飼料88%，豬油10%，膽固醇1.5%，膽鹽0.5%配置而成）喂養(yǎng)造模。在施以造模因素的同時，按10mL/（kg·bw），健脾低劑量組和健脾高劑量組大鼠予以參苓白術(shù)散灌服，正常組和模型組大鼠灌予以蒸餾水灌服，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 實驗取材與檢測

治療12周后，每組隨機取9只大鼠腹腔麻醉，開腹心臟采血約6 mL制備血清；取相同部位的肝組織，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。各組余下6只大鼠腹腔麻醉后剖腹，游離門靜脈主干并插管固定，迅速注入肝素鈉溶液抗凝，采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶，離心后選擇性貼壁分離肝細胞，并通過流式細胞術(shù)鑒定肝細胞純度。

1.5.1 肝組織病理觀察取距離肝緣1.5 cm處相同部位的肝右葉組織（0.5 cm×0.5 cm）投入分裝好的10%的甲醛溶液中，作常規(guī)HE染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.5.2 血脂的檢測采用全自動生化分析儀對血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等生化指標進行測定。

1.5.3 Real Time Q-PCR檢測基因表達水平參照Trizo操作說明書提取肝細胞總RNA，進行純度鑒定后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。大鼠PTEN、PI3Kp85α和內(nèi)參ACTB的cDNA序列通過GeneBank查找。PTEN上游引物5'-GCGTGCGGATAATGACAAGG-3' ，下游引物5'-TGGAGAGAAGTATCGGTTGGC-3'；PI3Kp85α上游引物5'-ACAAAGCCGAGAACCTATTGC-3'，下游引物5'-TGACTTCGCCATCTACCACTAC-3'；ACTB上游引物5'-TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3'，下游引物5'-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3'。參照PCR試劑盒說明，采用20 μL反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性1 min，變性95℃ 10 s，ACTB 57.5 ℃、PTEN 58 ℃、PI3Kp85α 60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，擴增40個循環(huán)。反應(yīng)完畢，采用Opticon Monitor 3.1軟件分析結(jié)果。

1.5.4 Western blot分析肝細胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表達水平按6×106將計數(shù)分離的肝細胞加入1 mL RIPA裂解液中勻漿裂解30 min后移至EP 管離心5 min，取上清液BCA法測定總蛋白濃度，計算含50 μg蛋白的溶液上樣，經(jīng)15% SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS-T漂洗PVDF膜3次每次5 min，分別用對應(yīng)辣根過氧化物酶標記二抗（1∶3000），室溫孵育2 h，取出PVDF膜，TBS-T漂洗3次每次5 min，洗去未結(jié)合的二抗，曝光、顯影、定影。Western blot結(jié)果使用光密度測量計掃描，進行灰度值比較。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，服從正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，并采用單因素方差分析進行組間比較。方差齊時選擇SNK法進行組間兩兩比較，方差不齊時選擇Tamhane's T2法檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)果

正常組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)完整，無氣泡。模型組大鼠肝細胞腫脹，細胞漿呈空泡狀。觀察組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)介于正常組與模型組之間，且健脾高劑量組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)與正常組更為相似。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色×400）

2.2 血脂

模型組與正常組比較，大鼠血清TC、TG 、LDL-C含量顯著升高（P＜0.01），HDL-C含量顯著降低（P＜0.01）；觀察組與模型組比較，大鼠血清TC、TG、LDL-C含量降低（P＜0.05），以健脾高劑量組表現(xiàn)更為顯著（P＜0.05），HDL-C含量顯著升高（P＜0.05）；健脾高劑量組大鼠血清TC、TG含量低于健脾低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂比較（±s，n=9） mmol/L

表1 各組大鼠血脂比較（±s，n=9） mmol/L

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與健脾低劑量組比較，**P＜0.05。

組別 TC TG HDL-C LDL-C正常組 1.16±0.31 0.29±0.04 1.42±0.35 0.49±0.13模型組 3.57±0.82* 0.54±0.11* 1.03±0.23* 2.07±0.68*健脾低劑量組 2.95±0.63# 0.43±0.07# 1.25±0.28# 1.54±0.53#健脾高劑量組 2.16±0.82##**0.37±0.05##**1.38±0.31## 1.38±0.44#

2.3 FCM鑒定肝細胞

低濃度標記峰標志R2的平行線起點左側(cè)為陰性細胞，起點右側(cè)移位紅色峰代表陽性細胞，藍色峰則為IgG陰性對照峰。CK-18抗體檢測肝細胞：在檢測的1×104個細胞中有9 273個細胞表達為CK-18，所占比為92.73%，即肝細胞純度為92.73%。見圖2。

圖2 FCM鑒定肝細胞純度

2.4 肝細胞PTEN和PI3Kp85αmRNA表達

模型組與正常組比較，大鼠肝細胞PTEN mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），PI3Kp85α mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；觀察組與模型組比較，大鼠肝細胞PTEN mRNA表達水平升高（P＜0.05），PI3Kp85α mRNA表達水平降低（P＜0.05），以健脾高劑量組表現(xiàn)更為顯著（P＜0.01）；健脾高劑量組大鼠肝細胞PTEN mRNA表達水平較健脾低劑量組升高（P＜0.05），PI3Kp85αmRNA表達水平較健脾低劑量組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 肝細胞PTEN和PI3Kp85α mRNA相對表達量（±s，n=6）

表2 肝細胞PTEN和PI3Kp85α mRNA相對表達量（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與健脾低劑量組比較，**P＜0.05。

組別 PTEN PI3Kp85α正常組 0.98±0.29 1.15±0.76模型組 0.32±0.11* 6.47±1.73*健脾低劑量組 0.51±0.23# 4.29±1.58#健脾高劑量組 0.79±0.25##** 2.71±1.32##**

2.5 肝細胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表達

模型組與正常組比較，肝細胞PTEN蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），PI3Kp85α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；觀察組與模型組比較，大鼠肝細胞PTEN蛋白表達水平升高（P＜0.05），以健脾高劑量組表現(xiàn)最為顯著（P＜0.01）；且健脾高劑量組大鼠PI3Kp85α蛋白表達水平較模型組降低（P＜0.05）；健脾高劑量組大鼠肝細胞PTEN蛋白表達水平較健脾低劑量組高（P＜0.05），PI3Kp85α蛋白表達水平較健脾低劑量組低（P＜0.05）。見圖3和表3。

表3 肝細胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表達水平比較（±s，n=6）

表3 肝細胞PTEN和PI3Kp85α蛋白表達水平比較（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與健脾低劑量組比較，**P＜0.05。

組別 PTEN PI3Kp85α正常組 0.63±0.18 0.37±0.12模型組 0.18±0.07* 1.14±0.58*健脾低劑量組 0.33±0.12# 0.99±0.37健脾高劑量組 0.48±0.14##** 0.54±0.20#**

圖3 肝細胞PTEN和PI3Kp85α 蛋白表達水平

3 討論

中醫(yī)理論認為，NAFLD的發(fā)生是脾虛濕盛，痰瘀互阻，積漸而成。NAFLD初期治療以疏肝理氣、健脾和胃為主；中后期以健脾益腎、化瘀散結(jié)為主，健脾法貫穿NAFLD 治療的始終［12-13］。參苓白術(shù)散出自我國歷史上第一部由官方主持編撰的成藥典《太平惠民和劑局方》，是健脾益氣，利水滲濕的經(jīng)典方劑。本團隊前期的臨床研究表明，參苓白術(shù)散可改善NAFLD患者的癥狀、體征，具有護肝、改善血脂異常及減輕肝臟脂肪變性等作用［14］，但其具體的作用機制尚未明確。

PTEN所編碼的PTEN蛋白具有強大的磷酸酶活性，可通過其脂質(zhì)磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依賴于磷酸酶的生物活性，影響肝細胞胰島素敏感性及糖代謝［15］。NAFLD與肥胖及糖尿病密切相關(guān)，目前“二次打擊”理論認為，NAFLD的發(fā)展包括兩個階段，第一次打擊胰島素抵抗是引起NAFLD的關(guān)鍵致病因子，第二次打擊涉及脂肪組織分泌的游離脂肪酸、脂肪因子等多因素的共同參與［16-18］。Sun H J等［19］研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除肝臟PTEN和SAV1雙基因可加速小鼠NAFLD的發(fā)病。Han J等［20］研究表明，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠PTEN表達顯著降低。同時，靜脈注射PTEN抑制劑可以誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，提示PTEN在NAFLD的纖維化過程中起重要作用。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基（p85）和催化亞基（p110）組成的異源二聚體。其中p110亞基又可被細分為3種（p110α、p110β和p110δ），而p85亞基則可被分為五種（p85α、p85β、p55γ、p55α和p50α）。在眾多亞基中，p85α調(diào)節(jié)亞基和p110α催化亞基最為重要，對于這兩種亞基的研究也最為清楚。過度表達p85亞基能夠競爭性抑制p85-p110二聚體與胰島素體底物1（IRS-1）的結(jié)合，從而抑制PI3K的活性［21-22］。研究表明，抑制PI3Kp85α蛋白的表達，可顯著改善NAFLD大鼠胰島素抵抗，降低血脂、肝功及改善肝組織病理［23］。

本研究通過喂養(yǎng)高脂飼料成功建立了NAFLD大鼠模型，模型組較正常組比較，大鼠TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，肝細胞PTEN mRNA及其蛋白表達水平降低，PI3Kp85α mRNA及其蛋白表達水平升高，提示NAFLD的發(fā)生發(fā)展可能與PTEN mRNA及其蛋白表達水平下調(diào)及PI3Kp85α mRNA及其蛋白表達水平上調(diào)有關(guān)。進一步推測PTEN/PI3Kp85α信號通路激活，可上調(diào)TC、TG合成，過多的脂質(zhì)沉積于臟臟導(dǎo)致NAFLD的形成。

同時，本研究對NAFLD大鼠分別給予高劑量和低劑量參苓白術(shù)散治療，結(jié)果顯示參苓白術(shù)散可改善NAFLD大鼠肝組織病理變化，降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，提高血清HDL-C含量，不同程度升高NAFLD大鼠肝細胞PTEN mRNA及其蛋白表達水平，降低PI3Kp85α mRNA及其蛋白表達水平，以高劑量參苓白術(shù)散的效果最為顯著，提示PTEN/PI3Kp85α信號通路可能是參苓白術(shù)散抗NAFLD的有效作用靶點。本研究揭示，參苓白術(shù)散可能是通過抑制NAFLD大鼠肝細胞PTEN/PI3Kp85α信號通路激活，使TC、TG合成減少，發(fā)揮防治NAFLD的藥理作用。