夏天無對坐骨神經(jīng)痛大鼠巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞活性的影響

★ 鄭雪花 鄒劍芬 黃善敏 何才姑 廖凌虹 董衛(wèi)國 錢長暉（.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福州 35022；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點實驗室 福州 35022；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 福州 35022）

坐骨神經(jīng)痛是臨床常見癥狀，由于各種原因?qū)е伦巧窠?jīng)通路及其分布區(qū)失調(diào)。神經(jīng)受壓后局部出現(xiàn)瘀血、水腫，進而引起無菌性的炎性反應(yīng)，產(chǎn)生的傷害性刺激信息引起外周敏化，繼而信息沿神經(jīng)通路傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成中樞敏化，機體出現(xiàn)痛覺異常、痛覺過敏和自發(fā)性疼痛等神經(jīng)功能障礙［1-2］。坐骨神經(jīng)損傷區(qū)的巨噬細胞、脊髓后角的小膠質(zhì)細胞參與疼痛的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)過程［3-4］。

中藥夏天無是罌粟科植物伏生紫堇的干燥塊莖。其具有止痛、活血化瘀和消炎等功效，在臨床上應(yīng)用于改善坐骨神經(jīng)痛［5-7］。前期工作發(fā)現(xiàn)夏天無可改善夾傷后坐骨神經(jīng)運動功能［8］，但其改善坐骨神經(jīng)痛的作用機制并未明確。本項目建立SD大鼠坐骨神經(jīng)痛模型，通過夏天無干預(yù)后研究受損神經(jīng)微環(huán)境變化，關(guān)注損傷區(qū)域的巨噬細胞以及脊髓后角的小膠質(zhì)細胞變化，并分析促炎因子改變情況，初步探討夏天無抑制巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞活性從而改善坐骨神經(jīng)痛的作用機制。

1 材料

1.1 動物

40只清潔級SD雌性大鼠，體質(zhì)量為200～220 g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（閩）2012-0001。實驗動物的各項處理程序，符合福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的有關(guān)動物保護和利用的倫理學(xué)規(guī)定。所有的操作都以盡量減少動物損害為準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

夏天無注射液購于江西天施康中藥股份有限公司（批號：Z36020694）；兔抗IBA1多克隆抗體（Wako，日本）；兔抗CD68多克隆抗體（Abcam，英國）；鼠抗TNF-a單克隆抗體（Santa Cruz，美國）；Alexa 488或568熒光標(biāo)記二抗（Abcam，英國）；防熒光淬滅劑（Vector，美國）；Leica CM 1950恒溫箱冰凍切片機（Leica，德國）；Zeiss Axio Imager A2熒光顯微鏡（Zeiss，德國）。

2 方法

2.1 模型制備及分組

SD大鼠以烏拉坦5 mL/kg行腹腔注射麻醉，于左側(cè)后肢股骨近中段斜切，分離并暴露坐骨神經(jīng)。在其分叉前游離出約0.5 cm，用2根4-0的鉻制羊腸線繞坐骨神經(jīng)主干做疏松的單結(jié)環(huán)扎，羊腸線間距約0.5 mm，單結(jié)剛好能沿神經(jīng)滑動，結(jié)扎線松緊程度以引起小腿肌肉輕微顫動且不影響神經(jīng)血液循環(huán)為宜。術(shù)后無菌生理鹽水沖洗消毒，逐層縫合。術(shù)后動物分籠單獨飼養(yǎng)，供給充足食物和水。術(shù)后3 d內(nèi)注射青霉素0.1 mL/次/d，以防傷口感染。動物行坐骨神經(jīng)痛造模手術(shù)后，隨機分為4組，每組動物均為8只：夏天無7 d組和28 d組，術(shù)后腹腔注射夏天無注射液，分別于術(shù)后7 d和28 d取材；模型7 d組和28 d組，術(shù)后以0.9% 生理鹽水進行注射，分別于術(shù)后7 d和28 d取材。另設(shè)定假手術(shù)組（n=8），其僅暴露坐骨神經(jīng)，不做其它處理。術(shù)后以0.9% 生理鹽水進行注射。每只動物注射次數(shù)為1次/2 d，每次注射0.2 mL/只，至各時間點結(jié)束時，假手術(shù)組于第7 d取材。

2.2 行為學(xué)檢測

2.2.1 Von Frey針刺實驗采用Von Frey絲檢測大鼠雙側(cè)后爪50%縮爪閾值。將大鼠置放于底部為細鋼絲網(wǎng)格的籠中，用不同規(guī)格Von Frey絲垂直皮膚緩慢直刺后足掌部，用力使Von Frey絲彎曲并持續(xù)6～8 s。造模手術(shù)前經(jīng)Von Frey針刺實驗篩選，通過機械痛覺閾值檢測合格后，才納入實驗進程。

2.2.2 熱敏實驗用局部熱刺痛采集大鼠足底對光熱的刺激痛閾值時間，觀察大鼠肢體的感覺功能。設(shè)定溫度為55 ℃，待大鼠靜止時將熱刺痛源置于后肢腳掌，大鼠后肢縮起或出現(xiàn)舔足反應(yīng)時開始記錄時間，超過40 s無反應(yīng)則停止刺激。每只大鼠每只腳掌測試3次。造模手術(shù)前經(jīng)熱敏實驗篩選，通過痛覺閾值檢測合格后，才納入實驗進程。

2.3 組織準(zhǔn)備

在動物實驗各時間結(jié)束點，每組動物以烏拉坦5 mL/kg劑量行腹腔注射，多聚甲醛灌注固定，分離大鼠的左側(cè)坐骨神經(jīng)（以鉻制腸線為中點，剪取約1 cm長度的神經(jīng)段）、脊髓L4-L6節(jié)段。利用冰凍切片機行連續(xù)組織切片，脊髓組織行橫切（厚度為16 μm），坐骨神經(jīng)縱切（厚度為12 μm）。

2.4 Masson染色

取坐骨神經(jīng)標(biāo)本，依次經(jīng)過甲醇 2 min，蘇木精3 min，麗春紅酸性品紅5 min，磷鉬酸2 min，苯胺藍2 min染色后，用甘油封片，鏡檢。

2.5 免疫熒光染色

為了觀察坐骨神經(jīng)受損微環(huán)境的巨噬細胞分布以及脊髓后角的小膠質(zhì)細胞分布情況，取坐骨神經(jīng)或脊髓切片，經(jīng)PBST沖洗后，1% Triton破膜滲透1 h，5%牛血清蛋白（BSA）封閉0.5 h，分別加入1% BSA稀釋的抗CD68、 IBA1或TNF-α的一抗孵育，4 ℃過夜，后加入相應(yīng)二抗孵育2 h，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核2 min，防熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blotting檢測

每組動物麻醉后，分離坐骨神經(jīng)（以鉻制腸線為中點，剪取約1 cm長度的神經(jīng)段）和脊髓左側(cè)后角部位。抽提出來的蛋白先通過二辛可寧酸試驗測蛋白濃度。用12%十二烷基硫酸鈉膠分離蛋白。蛋白隨后轉(zhuǎn)移到PDVF膜，用含有0.5% 吐溫-20的5%牛血清蛋白封閉2 h后，用抗CD68，IBA1或TNF-α的一抗進行4 ℃孵育過夜。接著用HRPconjugated的二抗常溫孵育2 h。免疫蛋白用ECL法檢測。

2.7 測量方法

檢測坐骨神經(jīng)損傷區(qū)的巨噬細胞標(biāo)記物CD68蛋白和TNF-α促炎因子表達，每個標(biāo)本以坐骨神經(jīng)損傷區(qū)中心的方形測量區(qū)域（300 μm×150 μm），分析區(qū)域內(nèi)CD68蛋白、TNF-α促炎因子的單位面積的平均光密度值。檢測脊髓后角小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物IBA1蛋白和TNF-α促炎因子表達，每個標(biāo)本取脊髓后角的3個隨機視野（100 μm×100 μm）作為測量區(qū)域，分析區(qū)域內(nèi)IBA1陽性表達細胞數(shù)值及TNF-α促炎因子表達平均光密度值。

2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Photoshop 7.0軟件進行圖片處理，Image Pro Plus 6.0進行熒光平均光密度值和Western blotting條帶分析，SPSS 20.0軟件統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 機械痛和熱痛閾值比較

神經(jīng)損傷導(dǎo)致動物痛閾值降低。模型組疼痛閾值降低較明顯，夏天無減輕夏天無組動物的機械痛和熱痛敏感程度，在一定程度上改善坐骨神經(jīng)痛。兩組間存在著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。見圖1。

圖1 機械痛和熱痛閾值比較

3.2 動物坐骨神經(jīng)標(biāo)本觀察及Masson染色結(jié)果

模型7 d組、夏天無7 d組均出現(xiàn)神經(jīng)纖維潰變、斷裂，膠原纖維增多，炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。與夏天無7 d組相比，模型7 d組損傷區(qū)結(jié)構(gòu)更紊亂，神經(jīng)纖維間隙的炎性細胞增多。模型28 d組、夏天無28 d組炎性細胞浸潤減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組損傷區(qū)神經(jīng)纖維仍呈現(xiàn)潰變、腫脹等現(xiàn)象，神經(jīng)纖維間或神經(jīng)外膜的炎性細胞較明顯。標(biāo)本觀察可見術(shù)后的模型組、夏天無組均出現(xiàn)不同程度的腫脹。但相對于夏天無組，模型組的神經(jīng)損傷區(qū)腫脹更加明顯。Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)齊整連續(xù)，周邊結(jié)締組織成分少，神經(jīng)外膜少見炎性細胞。模型組和夏天無組均出現(xiàn)神經(jīng)纖維潰變、膠原纖維增多和炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。與夏天無組相比，模型組損傷區(qū)結(jié)構(gòu)更紊亂，神經(jīng)纖維間隙的炎性細胞增多，膠原纖維成分更無序、粗大、致密，在神經(jīng)外膜處出現(xiàn)更多的炎性細胞。見圖2。

圖2 動物坐骨神經(jīng)標(biāo)本觀察及Masson染色結(jié)果

3.3 受損神經(jīng)的CD68陽性表達的巨噬細胞檢測結(jié)果

假手術(shù)組CD68標(biāo)記的巨噬細胞少見。模型7 d組、夏天無7 d組均出現(xiàn)巨噬細胞浸潤。與夏天無7 d組相比，模型7 d組損傷區(qū)巨噬細胞數(shù)量更多，在神經(jīng)外膜處巨噬細胞明顯增多。模型28 d組、夏天無28 d組巨噬細胞浸潤減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組在損傷區(qū)神經(jīng)外膜處仍有較多巨噬細胞存在。假手術(shù)組巨噬細胞數(shù)量少。模型7 d組在損傷區(qū)的巨噬細胞CD68表達增強，巨噬細胞數(shù)量明顯增加，尤其在神經(jīng)外膜多見。模型28 d組可見巨噬細胞數(shù)量有所減少，但神經(jīng)外膜仍見較多巨噬細胞。與同時間段的模型組比較，夏天無組巨噬細胞數(shù)量明顯減少。各組間存在著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。損傷區(qū)的CD68蛋白的Western blotting檢測結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果趨勢相符（P＜0.05），進一步說明夏天無減少巨噬細胞在損傷區(qū)的浸潤。見圖3。

圖3 受損神經(jīng)的CD68陽性表達的巨噬細胞檢測結(jié)果

3.4 各組脊髓后角小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物IBA1的檢測結(jié)果

假手術(shù)組的脊髓后角IBA1標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞數(shù)量少，胞體小、突起細長。模型7 d組、夏天無7 d組均出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞增多現(xiàn)象。與夏天無7 d組相比，模型7 d組脊髓后角的小膠質(zhì)細胞增多明顯，細胞縮短、突起變粗。模型28 d組、夏天無28 d組小膠質(zhì)細胞數(shù)量有所減少。與夏天無28 d組相比，模型28 d組小膠質(zhì)細胞較多。假手術(shù)組的脊髓后角IBA1標(biāo)記的小膠質(zhì)細胞數(shù)量少，胞體小，突起細長。模型組IBA1陽性表達增強，強于同時間段的夏天無組，小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，細胞形體變粗，突起縮短。組間IBA1陽性表達小膠質(zhì)細胞數(shù)量存在著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。脊髓后角的IBA1蛋白的Western blotting檢測結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果趨勢相符（P＜0.05），進一步說明夏天無能抑制坐骨神經(jīng)損傷后的脊髓后角小膠質(zhì)細胞的應(yīng)答。見圖4。

圖4 各組脊髓后角小膠質(zhì)細胞標(biāo)記物IBA1的檢測結(jié)果

3.5 各組坐骨神經(jīng)損傷區(qū)促炎因子TNF-α的檢測結(jié)果

免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α在假手術(shù)組表達較弱，坐骨神經(jīng)損傷后TNF-α表達增強。相比較于模型組，夏天無組的TNF-α表達無論在受損神經(jīng)和脊髓后角都明顯減少（P＜0.05）。免疫印跡結(jié)果提示在術(shù)后7 d，夏天無組比相應(yīng)的模型組的TNF-α表達明顯減少，但術(shù)后28 d，兩組的TNF-α表達水平相似。見圖5。

圖5 各組坐骨神經(jīng)損傷區(qū)促炎因子TNF-α的檢測結(jié)果

4 討論

中醫(yī)學(xué)通常認為坐骨神經(jīng)痛是“痹癥”，通常由于受壓、外傷等因素致氣血運行受阻，導(dǎo)致瘀血阻滯于局部區(qū)域，脈絡(luò)不通而產(chǎn)生疼痛［9-10］。在本實驗中，坐骨神經(jīng)結(jié)扎能夠引起坐骨神經(jīng)痛，在實驗中發(fā)現(xiàn)動物行為學(xué)得到改善。夏天無干預(yù)后，機械痛敏和熱痛敏程度得到緩解，說明夏天無具有改善坐骨神經(jīng)痛的作用。

由于坐骨神經(jīng)痛模型大鼠的坐骨神經(jīng)受損，其內(nèi)的血管通透性增加，局部組織水腫明顯?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》《景岳全書》等中醫(yī)經(jīng)典理論指出氣血失調(diào)是周圍神經(jīng)損傷的重要病機，提出“血氣不和，百病乃變化而生”“痹者閉也，為氣血為邪所閉，不得通行而病也”等觀點。這些觀點闡述了周圍神經(jīng)損傷“痹癥”的病機在于氣血運行不暢，由于氣血不和，引起淤結(jié)，經(jīng)脈失養(yǎng)，神經(jīng)受壓，出現(xiàn)肌體疼痛等感覺功能障礙。一些文獻研究也指出周圍神經(jīng)損傷病機多為“經(jīng)絡(luò)不通、經(jīng)氣不續(xù)、氣虛血滯”等［11-12］。實驗發(fā)現(xiàn)無論損傷后7 d或28 d均可見到夏天無干預(yù)后受損神經(jīng)消腫明顯，體現(xiàn)夏天無具有消腫和化瘀的治療效果。

實驗發(fā)現(xiàn)夏天無組的受損神經(jīng)處的無菌炎性反應(yīng)不明顯，炎性細胞少，CD68陽性表達的巨噬細胞數(shù)量減少。由于炎癥反應(yīng)能夠加重神經(jīng)損傷程度。損傷處的巨噬細胞增多，其分泌物質(zhì)能夠引起神經(jīng)水腫和神經(jīng)內(nèi)環(huán)境紊亂等變化［13-15］。由于周圍神經(jīng)損傷牽涉到中樞神經(jīng)系統(tǒng)投射區(qū)域的應(yīng)答變化。脊髓后角的“靜止”的小膠質(zhì)細胞迅速進入“激活”狀態(tài)。文獻研究認為小膠質(zhì)細胞的活化與神經(jīng)病理性疼痛存在著重要的聯(lián)系［16-17］。在實驗中，發(fā)現(xiàn)脊髓后角的小膠質(zhì)細胞應(yīng)答發(fā)生明顯改變。神經(jīng)損傷導(dǎo)致IBA1陽性表達的小膠質(zhì)細胞活化，其突起縮短，胞體變粗，細胞數(shù)量明顯增多，在夏天無干預(yù)后，小膠質(zhì)細胞的應(yīng)答，無論是數(shù)量或形態(tài)的改變都減緩。通過促炎因子的檢測，發(fā)現(xiàn)夏天無干預(yù)后，受損神經(jīng)和脊髓后角的促炎因子TNF-α表達減少。促炎因子釋放減少，能夠減少傷害刺激，減緩疼痛。已有文獻也提及夏天無對炎性滲出、炎性介質(zhì)釋放、肉芽組織增生等有抑制作用，在骨關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等方面具有療效［18-19］。

推測由于夏天無有消腫、化瘀、消炎等功效，能夠減少膠原纖維等增生、減少巨噬細胞的趨化或遷移，改善脊髓后角的小膠質(zhì)細胞的應(yīng)答狀態(tài)，減少促炎因子的釋放，從而使坐骨神經(jīng)微環(huán)境得到一定的改善，起到改善坐骨神經(jīng)痛的作用。