淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜研究

徐彤彤，林碧珊，劉 青，陳錦霞，肖炯昌，劉 勇，張文芳

(國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

淡竹葉為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的干燥莖葉，一般在5-6月未開花前采割，曬干[1]。其主要化學(xué)成分包括黃酮類、三萜類、甾醇類、酚酸、氨基酸和糖類等[2-4]，具有清熱、瀉火、除煩的作用，是涼茶中經(jīng)常會(huì)用到的一種藥材。目前，《中華人民共和國(guó)藥典》2020版(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)中僅規(guī)定了淡竹葉藥材總灰分和水分的限度，并沒有規(guī)定特征圖譜項(xiàng)，不能整體反映藥材的質(zhì)量信息。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以水為溶媒，在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)化湯劑煎煮方式制得的單味藥水煎液。為了保證中藥配方顆粒使用的安全性、有效性，標(biāo)準(zhǔn)湯劑起到參照物的作用，是評(píng)價(jià)中藥配方顆粒是否與臨床湯劑一致的基準(zhǔn)[5-6]。因此，為了對(duì)中藥配方顆粒進(jìn)行全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制，深入開展標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的研究非常必要。淡竹葉飲片的炮制方法是除去雜質(zhì)后切段，本實(shí)驗(yàn)將藥材切段，按照標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備方法煎煮，與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行比較，建立淡竹葉藥材、標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC 特征圖譜，為淡竹葉中藥配方顆粒的全過(guò)程控制提供參考[7-9]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H-class UPLC高效液相色譜儀(PDA二極管陣列檢測(cè)器，Waters公司)；MS105DU和AL104型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；M-MILLIPORE Synergy UV 型超純水制備儀(MILLIPORE公司)；KQ-500DE型超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

異葒草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：11974-201401)、日當(dāng)藥黃素對(duì)照品(成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DST180202-050)；乙腈和磷酸為色譜純；無(wú)水乙醇為分析純；超純水由MILLIPORE Synergy UV純水儀制備。17批淡竹葉產(chǎn)地信息見表1，根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)指定技術(shù)要求(征求意見稿)》制備淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。

表1 淡竹葉產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters CORTECS T3 (2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為B，洗脫梯度：(0～2 min，10% A；2～3 min，10～16% A；3～7.5 min，16% A；7.5～16 min，16～52% A)；流速為0.25 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取異葒草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg異葒草苷的對(duì)照品溶液。

取日當(dāng)藥黃素對(duì)照品適量，精密稱定，加60%乙醇制成每1 mL含10 μg日當(dāng)藥黃素對(duì)照品溶液。

2.2.2 淡竹葉藥材(飲片)供試品溶液制備 取淡竹葉藥材(飲片)細(xì)粉1 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備 取相當(dāng)于飲片1 g的淡竹葉凍干粉，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量使溶解，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)10 min，取出，放冷，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.3%，相對(duì)峰面積RSD值均小于1.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.3%，相對(duì)峰面積RSD值均小于2.0%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣，以峰2異葒草苷為參照峰，各共有峰所得相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于0.4%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.0%，結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜的建立與分析

取17批淡竹葉藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以平均數(shù)法，選擇時(shí)間窗寬度為0.10，分別生成藥材(飲片)和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜，并生成各自的對(duì)照特征圖譜，結(jié)果見圖1、圖2，并以對(duì)照特征圖譜為參照進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。經(jīng)對(duì)比分析確定淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑有4個(gè)共有峰，發(fā)現(xiàn)淡竹葉藥材(飲片)特征圖譜與標(biāo)準(zhǔn)湯劑基本一致，有4個(gè)共有峰，分別與異葒草苷、日當(dāng)藥黃素對(duì)照溶液色譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定峰2為異葒草苷、峰3為日當(dāng)藥黃素，結(jié)果見圖3。生成的淡竹葉藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖譜，見圖4。在17批樣品圖譜中，異葒草苷峰為多批次中的共有峰，較穩(wěn)定且分離度良好，因此確定異葒草苷為參照峰，分別計(jì)算淡竹葉藥材(飲片)及標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。

圖1 17批淡竹葉藥材(飲片)UPLC特征圖譜

圖2 17批淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜

表2 淡竹葉藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜分析

圖3 淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液與對(duì)照品溶液的UPLC色譜

2.5 相關(guān)性分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，計(jì)算17批淡竹葉藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度，結(jié)果見表3。淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的4個(gè)共有特征峰在淡竹葉藥材(飲片)中均有顯示，表明在經(jīng)過(guò)水提、固液分離、濃縮、干燥后制得的標(biāo)準(zhǔn)湯劑中沒有新峰產(chǎn)生，也沒有共有峰丟失，表明在制備過(guò)程中可追溯。17批藥材(飲片)特征圖譜與生成對(duì)照特征圖譜相似度為0.876～0.996，標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與生成對(duì)照特征圖譜相似度為0.884～0.990，結(jié)果表明淡竹葉藥材(飲片)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分基本一致，整體具有相似性，以峰2異葒草苷峰為參照峰，分別計(jì)算淡竹葉藥材(飲片)和標(biāo)準(zhǔn)湯劑各共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)峰面積值基本相符，各成分得到了有效的轉(zhuǎn)移[10-11]，但不同批次共有峰相對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差值波動(dòng)較大，藥材(飲片)各共有峰相對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于39%，說(shuō)明不同產(chǎn)地、不同批次藥材質(zhì)量參差不齊，各成分峰面積相差較大，這可能與產(chǎn)地、氣候、運(yùn)輸、貯存條件等因素有關(guān)。

表3 17批淡竹葉藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度

圖4 淡竹葉藥材(飲片)(B)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑(A)對(duì)照特征圖譜

2.6 特征圖譜的應(yīng)用

淡竹葉在我國(guó)分布范圍廣泛，目前關(guān)于不同產(chǎn)地淡竹葉藥材鑒別的研究文獻(xiàn)較少，大多數(shù)研究都是通過(guò)性狀鑒別區(qū)分淡竹葉與混偽品。通過(guò)研究不同產(chǎn)地淡竹葉藥材特征圖譜發(fā)現(xiàn)，其中一批藥材按《中國(guó)藥典》檢驗(yàn)合格，制備成淡竹葉水煎液后測(cè)定特征圖譜，發(fā)現(xiàn)峰4丟失，結(jié)果見圖5。表明此方法可用于淡竹葉與混偽品的鑒別，能從藥材源頭上得到控制。

圖5 淡竹葉與偽品色譜

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)梯度洗脫條件、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、柱溫、流速等系統(tǒng)適應(yīng)性條件進(jìn)行了考察，通過(guò)PAD檢測(cè)器對(duì)供試品色譜在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，在350 nm波長(zhǎng)下色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰信息較豐富，故選擇350 nm作為該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)供試品溶液制備方法進(jìn)行考察，分別考察了提取溶劑(甲醇、50%甲醇、30%乙醇、60%乙醇、水)、提取方式(回流、超聲)、提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min)，結(jié)果表明在超聲提取10 min、60%乙醇為溶劑時(shí)提取效果最佳。

淡竹葉標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜與藥材(飲片)特征圖譜相似度較高，表明其化學(xué)成分基本一致，能夠充分反映出從藥材(飲片)到標(biāo)準(zhǔn)湯劑過(guò)程中化學(xué)成分可追溯。17批藥材(飲片)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑均有4個(gè)共有峰，其特征圖譜相似度分別在0.876～0.996、0.884～0.990，化學(xué)成分相關(guān)性良好。傳統(tǒng)飲片的服用方式一般為水煎服，通過(guò)特征圖譜可以反映中藥飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的傳遞性。本研究建立的超高效液相色譜法，大幅縮短了分析時(shí)間，降低了成本，提高了效率，通過(guò)特征圖譜共有峰，可區(qū)分淡竹葉混偽品，也為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)，為淡竹葉中藥配方顆粒的全過(guò)程控制提供了方法。