饑餓及不同餌料對(duì)蛤仔EPA/DHA含量的影響

吳婉婷 ，劉 括，左陸雅 ，梁 騰

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；2.大連上品堂海洋生物有限公司，遼寧 大連 116000）

菲律賓蛤仔（Ruditapes Philippines，以下簡(jiǎn)稱為蛤仔）是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，為世界性養(yǎng)殖貝類[1]，市場(chǎng)潛力巨大。

蛤仔為濾食性貝類，對(duì)適口性食物無(wú)選擇性。影響貝類生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是不飽和脂肪酸，它直接制約貝類的變態(tài)率、幼蟲的生長(zhǎng)率及無(wú)灰分干重指標(biāo)，特別是甾醇的種類和含量對(duì)海洋貝類的生長(zhǎng)發(fā)育有著直接的影響。不飽和脂肪酸對(duì)貝類的攝食效率、消化率有明顯的促進(jìn)作用，尤其是在促進(jìn)貝類幼蟲和稚貝時(shí)期生長(zhǎng)的效果明顯快于成貝[2]。

具備生物活性的不飽和脂肪酸越來(lái)越成為現(xiàn)階段水產(chǎn)動(dòng)物研究的熱點(diǎn)，它具有多種生物功能：能夠使水產(chǎn)養(yǎng)殖的動(dòng)物自身免疫力得到增強(qiáng)，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的抗逆性，減少其死亡率，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況以及其對(duì)飼料的利用效率，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，并且可以對(duì)免疫細(xì)胞及免疫因子的信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、消除自由基、促補(bǔ)體作用以及促進(jìn)細(xì)胞膜流動(dòng)、激活細(xì)胞膜上酶產(chǎn)生生理學(xué)作用。不飽和脂肪酸還是一種免疫增強(qiáng)劑，它的促進(jìn)生長(zhǎng)作用與免疫調(diào)節(jié)作用緊密聯(lián)系在一起[3]。不飽和脂肪酸通過(guò)改善機(jī)體的原有防御體系，減少機(jī)體的免疫反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)攝食和生長(zhǎng)的抑制，降低免疫激活水平，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，即不飽和脂肪酸是動(dòng)物非特異性免疫反應(yīng)得到提升后，以實(shí)現(xiàn)削弱特異免疫反應(yīng)的免疫能力，從而去減少細(xì)胞免疫因子的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到促進(jìn)養(yǎng)殖貝類生長(zhǎng)的目的。

不飽和脂肪酸中的EPA/DHA是維持機(jī)體生活的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蛤仔的EPA/DHA一方面是其維持自身生命活動(dòng)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，另一方面為人類提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，通過(guò)饑餓及不同餌料對(duì)蛤仔EPA/DHA含量影響，旨在闡述蛤仔EPA/DHA的合成能力，為蛤仔的健康養(yǎng)殖業(yè)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取遼寧大連莊河海區(qū)殼型完整、無(wú)損傷的蛤仔作為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)材料運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，充氣換水暫養(yǎng)3 d。隨機(jī)測(cè)量40個(gè)蛤仔的表型性狀。統(tǒng)計(jì)分析得到殼長(zhǎng)、殼高、殼寬及鮮重分別為37.15±4.93 cm，24.04±2.07 cm，15.23±0.90 cm，8.58±1.78 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將選取的100個(gè)健康、活力良好的蛤仔放入40 L塑料水槽內(nèi)充氣培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置饑餓組（1）金藻投喂組（2）鹽藻投喂組（3）金藻和鹽藻投喂組日投餌量為50萬(wàn)cells/mL。每天投餌2次，全量換水1次，換水時(shí)挑除死貝，洗凈水槽。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。實(shí)驗(yàn)的周期為7 d。

1.2.1 氣象色譜法測(cè)定EPA/DHA含量

采用氣象色譜法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組蛤仔的EPA/DHA。

1.2.2 蛤仔脂肪提取

解剖蛤仔，取1～5 g的軟體部（脂肪含量約為100～200 mg）轉(zhuǎn)移至燒瓶中，在燒瓶中加入100 mg的焦性食子酸（十一碳酸和甘油三脂內(nèi)標(biāo)溶液）和沸石。加入2 mL的乙醇（95%）混合均勻。加入10 mL的鹽酸后混合均勻[4]。再把燒瓶轉(zhuǎn)移到70～80°C的水浴。水解40 min，每10 min振蕩燒瓶，在混合水解溶液完成以后，移開燒瓶，冷卻至室溫，加入10 mL的乙醇（95%）混合均勻[5]。

在脂肪的水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移后，用50 mL乙醚沖洗燒瓶，在分液漏斗中倒入乙醚石油醚混合洗滌液，蓋緊瓶塞子搖晃5 min，靜放10 min，醚層提取收集250 mL加入三角瓶按照上面的步驟。再反復(fù)提取1次，在瓶中加入乙醚和石油醚混合洗滌液進(jìn)行洗滌收集250 mL三角瓶中，揮發(fā)溶劑，脂肪殘留提取物。

在250 mL三角瓶提取8 mL 2%的氫氧化鈉溶液，把回流冷凝器連接上，連接后在80℃水浴中回流，回流到油滴消失為止。在15%頂三氟化硼甲醇溶液7 mL回流冷凝器80℃水浴2 min?；亓骼淠饔萌ルx子水沖洗。加熱停止，取出瓶子后迅速冷卻降至室溫，精確取10～30 mL的正庚烷，振蕩2 min，加入飽和NaCl溶液，分層，從上層正庚烷萃取液取出5 mL，轉(zhuǎn)移到30 mL小試管中，加入3～5 g無(wú)水NaSO4震動(dòng)1 min，靜放5 min吸取上層溶液為樣品瓶[6]。

在樣品脂肪提取中應(yīng)注意在第一次檢測(cè)時(shí)，組分不確定的樣品中不要加入內(nèi)標(biāo)物。在內(nèi)標(biāo)物C11的峰位置處觀察是否出現(xiàn)干擾峰，如果存在干擾峰，加內(nèi)標(biāo)檢時(shí)測(cè)的時(shí)候?qū)?nèi)標(biāo)物C11的峰進(jìn)行必要校正[7]。

1.2.3 EPA/DHA含量測(cè)定

色譜測(cè)定的參考條件見表1。

表1 色譜測(cè)定的參考條件

1.2.4 色譜測(cè)定

在氣相色譜儀中注入l0 μL脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)液和各組別脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定這些色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)（峰值高度或面積），及各脂肪酸甲酯色譜相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算出響應(yīng)因子。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用R軟件作圖，并進(jìn)行單因素方差分析及t-test檢驗(yàn)，差異顯著性設(shè)置為P＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)組的EPA含量

不同實(shí)驗(yàn)組的EPA含量比較結(jié)果如圖1、圖2所示。結(jié)果表明，饑餓組、金藻投喂組及鹽藻投喂組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。各實(shí)驗(yàn)組EPA含量由多到少為饑餓組（1）＞金藻投喂組（2）＞鹽藻投喂組（3）。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組EPA含量比較

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組EPA含量方差分析

2.2 不同實(shí)驗(yàn)組的DHA含量比較

不同實(shí)驗(yàn)組的DHA含量比較結(jié)果如圖3、圖4所示。結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組DHA含量由多到少為饑餓組（1）＞金藻投喂組（2）＞鹽藻投喂組（3）。饑餓組與金藻投喂組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）。饑餓組和鹽藻投喂組的DHA含量差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組DHA含量比較

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組DHA含量方差分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以蛤仔為材料，測(cè)定分析饑餓處理、投喂金藻、投喂鹽藻，實(shí)驗(yàn)組的蛤仔EPA/DHA含量，結(jié)果表明，饑餓組、金藻投喂組及鹽藻投喂組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。以往研究報(bào)道表明，投喂處在浮游幼蟲階段的貝類，金藻投喂的效果比硅藻投喂的效果更好。金藻對(duì)稚貝的變態(tài)發(fā)育有明顯作用。原因可能是由于處于不同生長(zhǎng)階段的貝類所需要的營(yíng)養(yǎng)有所不同，所以不同生長(zhǎng)階段的貝類對(duì)餌料的需要就會(huì)存在不同。王慶志等[8]選取了健康的大連魁蚶稚貝，在溫度23.5～24.0℃和鹽度29.5～30.0環(huán)境條件下，用小球藻，牟氏角毛藻，等邊金藻，新月菱形藻這4種單細(xì)胞藻類單獨(dú)投喂和組合投喂魁蚶的稚貝，并觀察24 h以后單獨(dú)投喂和組合投喂兩種方式對(duì)魁蚶稚貝存活生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)投喂時(shí)，等邊金藻組喂養(yǎng)的稚貝生長(zhǎng)最快，小球藻組投喂的稚貝生長(zhǎng)最慢。然而組合投喂組（其他3種單細(xì)胞藻與等邊金藻混合（1∶1））中，稚貝的殼長(zhǎng)和特定生長(zhǎng)率都高于其他組的稚貝[3]。其中與小球藻組合投喂的效果最好。李文波等[9]在2012年進(jìn)行了不同的餌料對(duì)西施舌稚貝的生長(zhǎng)和消化酶的活性影響的研究，得出結(jié)果餌料是幼蟲變態(tài)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是幼蟲培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。隨著西雅舌人工育苗的規(guī)?；a(chǎn)，單細(xì)胞藻餌料的日常供應(yīng)成為一種挑戰(zhàn)。在2011年，馬斌等[10]通過(guò)比較8種常見的餌料微藻單獨(dú)和組合投喂對(duì)縊蟶稚貝的生長(zhǎng)影響，篩選出了適合縊蟶稚貝的餌料最優(yōu)的組合，結(jié)果表明，單獨(dú)投喂時(shí)金藻跟角毛藻最佳，在混合投喂時(shí)，存在一些單獨(dú)投喂效果不理想的微藻品種，這些微藻品種就可以在優(yōu)質(zhì)餌料不足的時(shí)候作為補(bǔ)充。

饑餓組與金藻投喂組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）；饑餓組和喂養(yǎng)有顯著性差異的DHA含量（P＜0.05）；投喂金藻組與鹽藻組 DHA含量差異顯著（P＜0.05）。研究表明，金藻中sfa，mufa，pufa含量都高于杜氏鹽藻[11]。在本實(shí)驗(yàn)中金藻組蛤仔的EPA/DHA含量高于鹽藻組蛤仔EPA/DHA含量。說(shuō)明蛤仔可以在體內(nèi)自身合成EPA和DHA[12]。

本研究表明短時(shí)間饑餓可以提高蛤仔體內(nèi)的DHA含量，不同餌料對(duì)蛤仔EPA和DHA的合成有顯著影響。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少數(shù)生物之一。它們具有巨大的開發(fā)利用潛力。微藻脂肪酸的組成與其種類和品種有關(guān)系，同時(shí)也受環(huán)境因素影響。溫度、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)周期、光照等等都可以導(dǎo)致EPA和DHA的含量變化，從而影響了微藻脂肪酸的組成。

4 結(jié)論

（1）本實(shí)驗(yàn)以蛤仔為材料，通過(guò)饑餓處理、投喂金藻、鹽藻，測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組的蛤仔EPA含量。結(jié)果表明，饑餓組、投喂金藻組及投喂鹽藻組的蛤仔EPA含量差異顯著（P＜0.05）。

（2）饑餓組與金藻喂養(yǎng)組DHA含量差異不顯著（P＞0.05）；饑餓組和投喂杜氏鹽藻含量有顯著性差異（P＜0.05）；金藻投喂組與鹽藻投喂組 DHA含量差異顯著（P＜0.05）。研究表明，金藻中EPA和DHA含量都高于鹽藻。說(shuō)明蛤仔可以在體內(nèi)自身合成EPA和DHA。

（3）本研究表明短時(shí)間饑餓可以提高蛤仔體內(nèi)的DHA含量，不同餌料對(duì)蛤仔EPA和DHA的合成有顯著影響。金藻中含有的EPA/DHA前體較多，蛤仔可能具有合成EPA/DHA含量的效果。在自然界中，海洋微藻是能合成EPA和DHA的少數(shù)生物之一。