H1N1亞型豬流感病毒HA蛋白225位氨基酸對病毒致病性的影響

楊時鰻，許程志，許榜豐，吳運譜，賈云慧，喬傳玲 ，陳化蘭

H1N1亞型豬流感病毒HA蛋白225位氨基酸對病毒致病性的影響

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，哈爾濱 150069；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，沈陽 110847

【】流感病毒的致病性是由多個基因共同決定的，筆者之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩株具有相似基因特征的H1N1亞型豬流感病毒進(jìn)行HA基因替換以后，病毒對小鼠的致病性發(fā)生了改變。通過確定影響病毒致病性的關(guān)鍵氨基酸位點，為進(jìn)一步揭示流感病毒致病力差異奠定了基礎(chǔ)。對ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，確認(rèn)氨基酸差異位點并設(shè)計定點突變引物，構(gòu)建單點突變的重組病毒并測定其雞胚半數(shù)感染量（EID50）。將拯救的親本病毒、HA單基因替換重組病毒及單點突變重組病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.001和0.1的病毒量分別接種于MDCK和A549細(xì)胞，測定病毒的體外復(fù)制能力；將上述各株病毒以50 μL含106EID50的劑量經(jīng)滴鼻途徑接種BALB/c小鼠，分別采集小鼠的腦、鼻甲、肺、脾、腎等臟器，勻漿處理后接種雞胚分析病毒在小鼠體內(nèi)各臟器的復(fù)制情況；將病毒分別以50 μL含101-106EID50的劑量經(jīng)鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天稱量小鼠體重，當(dāng)小鼠體重下降比率超過25% 時判定為死亡，統(tǒng)計死亡情況，測定病毒的小鼠半數(shù)致死量（MLD50），評估各突變病毒對小鼠的致病性，與親本病毒進(jìn)行分析比較后，獲知決定病毒致病性的關(guān)鍵氨基酸位點。ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4個氨基酸差異位點，分別為4、138、144和225位（H3 Numbering）。經(jīng)過定點突變、病毒拯救及序列測定確認(rèn)，分別獲得含有單個位點突變的重組病毒。通過測定病毒在MDCK和A549細(xì)胞上的復(fù)制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與親本病毒rZD71相比較，突變病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK細(xì)胞的各檢測時間點、及感染A549細(xì)胞24—48 h后，復(fù)制滴度均顯著提高；與rSY130相比較，突變病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK細(xì)胞12—36 h后、及感染A549細(xì)胞36—72 h后，復(fù)制滴度均顯著降低。而4、138、144位點的突變對病毒的復(fù)制影響較小。進(jìn)一步的小鼠感染試驗發(fā)現(xiàn)HA 225位氨基酸的改變顯著影響了病毒對小鼠的致病性，與親本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突變?yōu)镋后，病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不僅在小鼠鼻甲和肺臟內(nèi)檢測到，而且在脾臟和腎臟中也均有一定水平的復(fù)制。HA蛋白225位氨基酸對兩株H1N1 SIV對小鼠的致病性具有重要決定作用，提示在后續(xù)開展的病原學(xué)監(jiān)測中要密切關(guān)注該位點氨基酸的變異情況，為更好地防控動物流感乃至人流感的大流行提供科學(xué)依據(jù)。

豬流感病毒；HA蛋白；氨基酸；致病性

0 引言

【研究意義】HA和NA蛋白是A型流感病毒的兩種重要糖蛋白，根據(jù)其抗原性和遺傳特性的不同而分為不同的亞型?，F(xiàn)已有16種HA亞型和9種NA亞型的病毒以任何一種可能的組合方式的病毒在禽類體內(nèi)分離到[1-2]。在豬群中主要流行H1N1、H1N2和H3N2 3種亞型的豬流感病毒（swine influenza virus, SIV）[3]，其中H1N1亞型病毒又劃分為經(jīng)典型、類禽型、類人型和2009/H1N1[4]。近些年的流行病學(xué)研究結(jié)果表明，歐亞類禽型H1N1（eurasian avian-like, EA H1N1）亞型流感病毒在我國豬群中的流行極為廣泛[5-6]；也有在犬、水貂中分離到EA H1N1病毒的報道[7-8]；更為重要的是，該類病毒導(dǎo)致了人的零星感染與發(fā)病，更加凸顯了EA H1N1病毒潛在的公共衛(wèi)生威脅[9-10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）蛋白的主要功能是與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞內(nèi)體膜的融合，致使病毒核糖核蛋白釋放進(jìn)入細(xì)胞漿中。在融合之前，HA會被裂解成為兩個以二硫鍵相連的亞單位（HA1和HA2）[11]。由于流感病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合需要HA2氨基末端的介導(dǎo)，因此，HA的可裂解性是流感病毒感染的重要決定因素[12]。HA受體結(jié)合位點也影響著病毒毒力，能與α-2,3-唾液酸受體（α-2,3-SA）或α-2,6-唾液酸受體（α-2,6-SA）結(jié)合，進(jìn)而決定著病毒的宿主范圍和組織嗜性[13]。已有研究報道HA蛋白138位氨基酸和225位氨基酸分別位于HA受體結(jié)合位點的130Loop 和220Loop 中，對流感病毒，尤其是H1、H2和H3亞型病毒的受體結(jié)合特性有重要影響[14-15]。當(dāng)病毒發(fā)生A138S 突變時，可以提高禽流感病毒對哺乳動物的適應(yīng)性和致病能力[16]；當(dāng)發(fā)生G225E 或G225D 突變時，可以提高H1亞型禽流感病毒結(jié)合人源α-2,6 SA 受體的能力[17]。另有研究表明，當(dāng)1918年大流行毒株A/South Carolina/1/18（H1N1）在發(fā)生HA D225G 突變后，病毒在雪貂間的飛沫傳播能力明顯下降[18]。獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室之前通過比較分析兩株EA H1N1 SIV在豚鼠中的傳播能力，發(fā)現(xiàn)病毒HA蛋白225位氨基酸（E或者是G）是決定病毒傳播能力差異的關(guān)鍵氨基酸[19]。近期開展的兩株H1N1 SIV模式病毒（ZD71和SY130）對小鼠致病性的研究中發(fā)現(xiàn)，在單HA基因片段替換后，拯救病毒的致病力與親本病毒相比，出現(xiàn)了反向增強(qiáng)的現(xiàn)象，即原本致病力強(qiáng)的病毒變得更強(qiáng)[20]?！颈狙芯壳腥朦c】為了進(jìn)一步探索究竟是哪些基因影響了病毒對小鼠的致病性，首先需要對兩株模式病毒的HA基因序列進(jìn)行比對，找到其差異氨基酸；進(jìn)而分別以ZD71和SY130兩個模式病毒為背景，利用定點突變和反向遺傳學(xué)技術(shù)，救獲一系列HA蛋白單點突變病毒；測定病毒的體外復(fù)制能力及其對小鼠的致病性，分析突變位點對病毒致病性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過比較分析病毒的體內(nèi)外復(fù)制能力及對小鼠的致病性，確定影響H1N1 SIV對小鼠致病性的關(guān)鍵氨基酸位點，以期進(jìn)一步了解流感病毒致病力差異的分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于2019年1月至12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室完成。

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和實驗動物

雙向表達(dá)質(zhì)粒pHW2000由美國St.Jude兒童醫(yī)院RICHARD WEBBY教授饋贈，MDCK細(xì)胞、A549細(xì)胞、293T細(xì)胞均由動物流感實驗室保存，9—11日齡SPF雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心，9—11日齡非免疫雞胚由哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司提供。6周齡SPF級BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。兩株H1N1亞型SIV A/swine/Liaoning/ZD71/2015（簡稱ZD71）和A/swine/Liaoning/ SY130/2015（簡稱SY130）的反向遺傳系統(tǒng)（rZD71和rSY130）、含有SY130病毒HA基因的單基因替換重組病毒（rZD71-HA）及含有ZD71病毒HA基因的單基因替換重組病毒（rSY130-HA）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室構(gòu)建并保存[20]。

1.2 試劑和試劑盒

病毒RNA 提取試劑盒（TIANamp Virus RNA Kit）購自天根生物有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；2×PrimeSTAR MAX Premix DNA 聚合酶購自大連寶生物有限公司；限制性內(nèi)切酶BI以及I 購自NEB公司；同源重組試劑盒ClonExpress?II One Step Cloning Kit 以及質(zhì)粒小提試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；膠回收試劑盒和PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自QAIGEN公司；DNA測序試劑購自Applied Biosystems 公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM3000購自Invitrogen公司；培養(yǎng)基OPTI-MEM、DMEM和F-12K購自Gibco公司。

1.3 含有單點突變重組病毒的拯救

對ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析，針對差異位點設(shè)計點突變引物，以質(zhì)粒pHW-HA為模板，通過PCR構(gòu)建含有HA基因單點突變的質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，中量法提取陽性質(zhì)粒。將突變質(zhì)粒與其相應(yīng)的其他7個質(zhì)粒，各取250ng與250 μL Opti-MEM混勻；另取10 μL脂質(zhì)體與250 μL Opti-MEM混勻，孵育5 min；脂質(zhì)體與質(zhì)粒再次混勻、靜置30 min，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。37℃培養(yǎng)12 h后，棄去轉(zhuǎn)染液，加入2 mL含0.2μg·mL TPCK-胰酶的Opti-MEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)尿囊腔接種于SPF雞胚，200 μL/胚，于37℃培養(yǎng)72 h，測定尿囊液的HA活性（HA效價≥1﹕16判為陽性），收集HA陽性樣品，再次接種SPF雞胚增殖。對救獲病毒進(jìn)行全基因組序列測定，與親本毒株基因序列進(jìn)行比對，確保重組病毒的HA基因僅含有目的位點的突變，其他基因無突變。將病毒分裝、保存于-80℃，用于后續(xù)試驗。

1.4 雞胚半數(shù)感染量（EID50）的測定

將待測病毒（rZD71、rSY130、rZD71-HA、rSY130-HA及其相應(yīng)的點突變病毒，均為F2代）分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取10-5—10-9稀釋度的病毒液接種非免疫雞胚，100 μL/胚，于37℃培養(yǎng)72 h后收取尿囊液測定其HA活性，按照Reed-Muench方法計算EID50。

1.5 病毒的體外復(fù)制特性測定

將1.4中所述各病毒以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.001和0.1的病毒量分別接種于MDCK和A549細(xì)胞，37℃孵育1h后，分別更換為含有1 μg·mL-1的TPCK-胰酶的DMEM培養(yǎng)基及含0.25 μg·mL-1TPCK-胰酶的F-12K培養(yǎng)基，并于感染后12、24、36、48、60和72 h收集感染后上清液，將所獲上清液于-80℃保存?zhèn)溆?。待所有樣品收集完成后，在MDCK細(xì)胞中用終點滴定法測定病毒滴度，以平均log10TCID50/ml±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.6 病毒的體內(nèi)復(fù)制特性測定

為了評價每株病毒在體內(nèi)的復(fù)制能力，分別將病毒以50 μL含106EID50的劑量經(jīng)滴鼻途徑接種BALB/c小鼠，每個病毒感染3只，感染3 d后，將其進(jìn)行安樂死，采集小鼠的腦、鼻甲、肺、脾、腎，勻漿處理后接種非免疫雞胚，測定各臟器內(nèi)的病毒含量。

1.7 病毒的MLD50測定

將病毒分別以50 μL含101—106EID50的劑量經(jīng)鼻腔感染5只BALB/c小鼠，感染后每天稱量小鼠的體重，將體重下降比率超過25%的小鼠實施安樂死，持續(xù)觀察14 d。按照Reed-Muench方法計算MLD50。

1.8 HA蛋白225位氨基酸的進(jìn)化分析

從Influenza Research Database 數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址www.fludb.org，截止時間為2020年12月28日）中下載分離自我國的H1N1亞型SIV HA序列1 032條，按照時間順序?qū)Ψ蛛x毒株進(jìn)行劃分，采用UGENE軟件MAFFT算法進(jìn)行比對，分析HA 225 位氨基酸的進(jìn)化情況。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件對病毒在細(xì)胞上的復(fù)制滴度及感染小鼠后組織中的病毒滴度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（Two-way ANOVA法）及作圖。＜0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病毒ZD71和SY130 HA蛋白氨基酸比對分析

經(jīng)比較序列分析發(fā)現(xiàn)ZD7和SY130這兩株病毒在HA蛋白上共有4個氨基酸差異位點，分別為4、138、144和225位（H3 Numbering）（表1）。

2.2 定點突變病毒的救獲及病毒EID50的測定

以ZD71和SY130病毒為骨架，拯救的單點突變病毒分別命名為rZD71-HA/V4A、rZD71-HA/A138S、rZD71-HA/T144A、rZD71-HA/G225E；rSY130-HA/A4V、rSY130-HA/S138A、rSY130-HA/A144T、rSY130-HA/ E225G。對1.1中所述各病毒及所有點突變病毒進(jìn)行EID50的測定（表2）。

表1 ZD71 and SY130 病毒HA 蛋白氨基酸差異位點

表2 突變病毒的EID50測定

2.3 病毒體外復(fù)制水平的測定

利用MDCK和A549兩種細(xì)胞分別測定了病毒的復(fù)制動力學(xué)，結(jié)果在MDCK細(xì)胞上，親本病毒rZD71在感染后12—72 h的各檢測時間點的病毒復(fù)制滴度范圍為3.0—8.72 log10EID50/mL，而單點突變病毒rZD71-HA/G225E的病毒復(fù)制滴度范圍為4.72—9.22log10EID50/mL，經(jīng)比較每個時間點的病毒滴度發(fā)現(xiàn)突變病毒rZD71-HA/G225E的復(fù)制滴度均顯著高于rZD71病毒（＜0.05至＜0.0001）（圖1-A）；在A549細(xì)胞上，同樣發(fā)現(xiàn)當(dāng)HA蛋白225位氨基酸的單點突變導(dǎo)致病毒rZD71-HA/G225E在感染24—48 h后的復(fù)制滴度均顯著高于rZD71病毒（＜0.01、0.0001）（圖1-B）。同樣，通過與親本病毒rSY130相比較，發(fā)現(xiàn)在感染MDCK細(xì)胞12—36 h及感染A549細(xì)胞36—72 h后，單點突變病毒rSY130-HA/ E225G的復(fù)制水平均明顯降低（圖1-C、D）。而病毒HA蛋白4、138和144位點的氨基酸突變對相應(yīng)的單點突變病毒在MDCK和A549細(xì)胞上的復(fù)制水平的影響均相對較?。▓D1-A—D）。

2.4 病毒體內(nèi)復(fù)制能力的比較

以106EID50的病毒劑量感染BALB/c小鼠，3d后，測定小鼠各臟器的病毒含量。結(jié)果在小鼠鼻甲和肺臟中，親本病毒rZD71的檢出滴度分別為6.08和7.58log10EID50/mL，單點突變病毒rZD71-HA/G225E的檢出滴度分別為6.67和7.92log10EID50/mL；而病毒rZD71-HA/G225E在小鼠的脾臟和腎臟中也均檢測到，滴度分別為2.0和0.92log10EID50/mL（圖2）。與親本病毒rSY130相比，單點突變病毒rSY130-HA/ E225G在各臟器中的復(fù)制滴度均未見發(fā)生明顯變化（圖2）。

*：P＜0.05; **：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

*：P＜0.05; **：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

2.5 病毒MLD50的測定

為了進(jìn)一步了解HA蛋白225位氨基酸是否為決定病毒對小鼠致病力的關(guān)鍵氨基酸，分別測定了rZD71、rZD71-HA、rZD71-HA/G225E、rSY130、rSY130-HA和rSY130-HA/E225G合計6株病毒的MLD50。結(jié)果rZD71病毒的MLD50為4.32 log10EID50（圖3-A），而rZD71-HA和rZD71-HA/G225E病毒MLD50的測定結(jié)果均為3.0log10EID50（圖3-B、C）；而rSY130、rSY130-HA和rSY130-HA/E225G病毒的MLD50均高于6.5 log10EID50（圖3-D—F）。表明HA蛋白225位氨基酸的突變，導(dǎo)致單點突變病毒rZD71-HA/G225E對小鼠的致病力增強(qiáng)，MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0log10EID50。

2.6 H1N1亞型SIV HA蛋白225位氨基酸的分析

在1 032株H1N1亞型SIV國內(nèi)分離株中HA蛋白225位出現(xiàn)過G、E、D、N、K 等5種氨基酸，呈現(xiàn)多樣性（圖4）。2000年前國內(nèi)分離株中，225G的出現(xiàn)頻率為57.0% （142/249），未發(fā)現(xiàn)225E。2001—2010年間，225G出現(xiàn)頻率減少，為17.9%（81/452）；225E出現(xiàn)頻率增加，為52.4% （237/452）。2011—2020年間，225G的出現(xiàn)頻率持續(xù)減少，為15.4% （51/331）；225E的出現(xiàn)頻率進(jìn)一步增加，達(dá)到74.9%（248/331）。

圖3 病毒MLD50的測定

*：“X”代表氨基酸D、K、N “X”denotes amino acid D, K, or N

3 討論

流感病毒的致病性是由病毒的多個蛋白共同決定的，截至目前，已相繼在PB2[21-22]、PB1[23]、PA[24]、HA[19, 25]、NP[26]及NS1[27]等多種蛋白上鑒定出一系列決定病毒致病性的關(guān)鍵氨基酸位點。HA蛋白作為流感病毒的囊膜糖蛋白之一，是病毒入侵宿主細(xì)胞的“鑰匙”[28]。在本研究中，為了進(jìn)一步探索前期研究過程中發(fā)現(xiàn)的一個現(xiàn)象，也就是為什么單單是HA基因的替換，導(dǎo)致了病毒致病性發(fā)生了一種不尋常的改變，究竟又是哪些位點的氨基酸決定了病毒對小鼠致病性的改變。通過序列分析，發(fā)現(xiàn)ZD71和SY130兩株病毒在HA蛋白上共有4個位點氨基酸的差異，因此，分別以這兩株病毒為骨架，拯救出8株分別含有單點突變的重組病毒。通過比較這些病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制能力及對小鼠的致病性，發(fā)現(xiàn)HA蛋白G225E的突變能夠使rZD71-HA/G225E病毒體內(nèi)外復(fù)制能力及其對小鼠的致病力增強(qiáng)，表明HA蛋白225位氨基酸是導(dǎo)致兩株病毒對小鼠致病力差異的關(guān)鍵位點。

病毒的復(fù)制能力是影響流感病毒致病性及其在哺乳動物間傳播的重要因素[26, 29-30]。本研究首先評價了親本毒株、HA單基因替換病毒及單點突變病毒在MDCK和A549 細(xì)胞上的復(fù)制能力。結(jié)果表明，225 位氨基酸位點的突變可以顯著影響病毒的體外復(fù)制能力，當(dāng)發(fā)生G225E突變時，與親本病毒rZD71相比，rZD71-HA/G225E的復(fù)制能力顯著提高；當(dāng)在rSY130背景下引入HA E225G的突變后，病毒rSY130-HA/ E225G的復(fù)制能力顯著降低。這一結(jié)果表明流感病毒HA蛋白225位氨基酸對病毒的復(fù)制能力具有重要的決定作用，是導(dǎo)致病毒對小鼠致病力差異的主要原因。

通過對我國H1N1亞型SIV分離毒株HA蛋白225位氨基酸序列的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)225G和225E在近20年來分離的毒株中同時存在，且225E出現(xiàn)的頻率逐漸增高而成為主導(dǎo)。WANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)HA蛋白225位氨基酸的種類對EA H1N1 SIV的組裝和出芽效率具有重要的決定作用，G225E的突變能夠增強(qiáng)病毒的組裝與出芽效率，提高病毒的復(fù)制能力，進(jìn)而導(dǎo)致病毒的致病性及病毒在豚鼠之間的傳播能力增強(qiáng)。本研究的結(jié)果進(jìn)一步提示要在今后的監(jiān)測中密切關(guān)注該位點氨基酸的變異情況，充分做好病毒致病性相關(guān)的風(fēng)險評估。

4 結(jié)論

進(jìn)一步確定了HA蛋白225位氨基酸對病毒的致病性具有重要的決定作用，當(dāng)病毒獲得HA蛋白G225E的突變以后，對小鼠致病性增強(qiáng)。提示在今后的流感病原學(xué)監(jiān)測中要密切關(guān)注該位點氨基酸的變異情況，為更好地防控動物流感乃至人流感的大流行提供科學(xué)依據(jù)。

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Amino Acid of 225 in the HA Protein Affects the Pathogenicities of H1N1 Subtype Swine Influenza Viruses

YANG ShiMan1, XU ChengZhi1, XU BangFeng1, WU YunPu2, JIA YunHui1, QIAO ChuanLing1, CHEN HuaLan1

1Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin 150069;2Laboratory Animal Center, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847

【】The pathogenicities of influenza viruses are determined by multiple viral genes. The results of our previous study indicated that hemagglutinin (HA) gene substitutions of the two genetically similar H1N1 swine influenza viruses altered their pathogenicities in mice. This study aimed to further identify the key amino acids affecting viral pathogenicity. 【】After analyzing the amino acid differences of HA protein between the two H1N1 viruses, the reassortant viruses bearing the single amino acid mutations were constructed using the site-directed mutagenesis primers, and their EID50values were determined. To determine the growth of the parental, reassortant and mutant viruses, MDCK cells and A549 cells were infected with the indicated viruses at a multiplicity of infection (MOI) of 0.001 and 0.1, respectively. The BALB/c mice was further intranasally (i.n.) inoculated with 106EID50of each virus, and three mice were euthanized at 3 days post-infection (dpi).The organs, including brain, nasal turbinate, lung, kidney and spleen, were collected from the mice and titrated in eggs to evaluate the viral replication abilities in vivo. The MLD50values of the indicated viruses were determined by inoculating i.n. groups of five mice with 101-106EID50of viruses. The body weight was measured daily for 14 dpi, and the mice that lost more than 25% of their original weight were euthanized for humane reasons. 【】The HA proteins of the ZD71 and SY130 viruses differed at four amino acids at positions 4, 138, 144, and 225 (H3 numbering). Four reassortants were rescued, followed by whole-genome sequencing to ensure the absence of unwanted mutations. The viral replication abilities of the reassortant viruses (rZD71-HA/G225E and rSY130-HA/E225G) were significantly affected in MDCK, as well as in A549 cells, when G225E and E225G substitutions were introduced into the rZD71 and rSY130 virus, respectively.In contrast, the mutations of the other three amino acids had little effect on viral replication. Further mouse infection experiments also demonstrated that amino acid substitutions at site 225 of HA protein significantly affected the viral pathogenicities in mice. In particular, the substitution G225E increased the pathogenicity of rZD71-HA/G225E virus, with the MLD50value of rZD71-HA/G225E virus decreasing from 4.32 log10EID50to 3.0 log10EID50, compared with that of rZD71 virus. And the virus replicated well not only in the nasal turbinate and lung, but also in the spleen and kidney. 【】A single amino acid at position 225 in the HA protein significantlyaffects the viral replication capacity and virulence of these two H1N1 swine influenza viruses. It is suggested that close monitoring for this residue should be paid in the future virological surveillance, so as to provide a scientific basis for better prevention and control of animal influenza, and even human influenza pandemic.

swine influenza virus; HA protein; amino acid; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.016

2020-12-31；

2021-03-30

國家自然科學(xué)基金面上項目（31872472）

楊時鰻，Tel：0451-51051684；E-mail：ysm196033@163.com。許程志，Tel：0451-51051684；E-mail：xucz1994@163.com。楊時鰻和許程志為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者喬傳玲，Tel：0451-51051686；E-mail：qiaochuanling@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）