根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度對葡萄葉片PSⅡ活性的影響及恢復情況*

王 浩，李中瀚，徐魯成，王 明，康 慧，姚玉新，杜遠鵬，高 振

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，泰安 271018）

設施栽培是葡萄生產(chǎn)的一種重要的方式，能夠克服自然條件的限制，調(diào)控葡萄生長所需要環(huán)境條件，從而達到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的目的[1-2]。設施栽培雖然可實現(xiàn)調(diào)溫、避雨的目的，但溫度過高成為不可避免的問題[3]，尤其南方地區(qū)日光溫室中廣泛應用限根栽培模式[4]，氣溫過高的同時伴隨著根區(qū)溫度的上升。此問題北方地區(qū)也時有發(fā)生，在山東省泰安地區(qū)（山東農(nóng)業(yè)大學園藝實驗站）日光溫室的限根器中，夏季10 cm 土層的溫度能夠上升到35 ℃，20 cm 和30 cm 的土層溫度也能夠上升到31 ℃。氣溫和根區(qū)溫度的異常升高給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

光合作用是植物最基礎的生命活動之一，對脅迫環(huán)境極為敏感。有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄光合作用最適氣溫為25～35 ℃[5-6]，當超過這一范圍時葡萄葉片光合效率便有所下降。孫勝楠等[7]發(fā)現(xiàn)，在高氣溫環(huán)境中處理的黃瓜幼苗葉片PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、PSⅡ有效量子效率［Y（Ⅱ）］、電子傳遞效率（ETR）均較適宜氣溫顯著降低，在大蔥[8]、三七[9]上也得到了相似的結論。Ding 等[10]發(fā)現(xiàn)，35 ℃的根區(qū)高溫顯著降低了黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量、光合速率以及其相關基因的表達，影響了光合作用的正常進行。普遍認為PSⅡ是光抑制發(fā)生的主要位點，抑制程度取決于光破壞和光修復的速率[11]，如果損傷速率超過修復速率，便會嚴重影響葉片PSⅡ的光能利用效率。然而高等植物在進行光合作用時不可避免地會發(fā)生PSⅡ光破壞，主要是由于PSⅡ反應中心D1 蛋白的破壞、降解和凈損失[12]。為保證光合作用能夠正常進行，植物能對受損傷的PSⅡ進行快速修復[13-14]，主要由以下幾個步驟組成：蛋白的去磷酸化、PSⅡ復合物的分解，D1 蛋白的降解和從頭合成，裝配至PSⅡ復合體上[15]。另外，PSⅡ光抑制與活性氧（ROS）緊密相關，ROS 能夠抑制編碼D1 蛋白基因（PsbA）的轉錄和翻譯，進而抑制逆境脅迫中PSⅡ的修復[16]。

近年來，異常高溫天氣頻繁出現(xiàn)[17]，高氣溫出現(xiàn)的同時往往伴隨著根區(qū)高溫，設施栽培雖然可通過通風、微噴、搭設遮陽網(wǎng)等措施快速降低設施內(nèi)氣溫，但由于土壤比熱容大，升溫和降溫慢[18]，氣溫降低后根區(qū)高溫仍會持續(xù)一段時間。因此，研究根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度對葡萄葉片PSⅡ活性的影響及恢復情況具有重要意義。對葉片進行葉綠素熒光分析是研究脅迫反應的重要手段之一，但目前尚未有對此種環(huán)境條件下的葡萄葉片進行葉綠素熒光分析的報道。本文以巨峰葡萄為試材，利用葉綠素熒光測定分析探討根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度對葡萄葉片PSⅡ活性的影響及恢復情況的影響，為葡萄的種植管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

以1 年生巨峰葡萄（Vitis viniferaL.×V.labruscaL.cv.‘Kyoho’）為試材，種植用雙色盆直徑17 cm、高15 cm，栽培基質(zhì)按蛭石∶草炭∶珍珠巖∶牛糞＝1∶1∶1∶1 的比例進行混合。葡萄苗培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學南校區(qū)園藝實驗站日光溫室，待植株長至10～12 片完全葉時進行脅迫處理。選取長勢一致的植株轉移至人工氣候箱，用LED 冷光源植物燈（型號SP501-N，405 W，上海三澎機電有限公司）進行照光，光照強度設為（800±100） μmol·m-2·s-1。利用水浴鍋（型號HH-4，300 W，國華儀器制造有限公司）對根區(qū)溫度進行控制，用11 號自封袋套住雙色盆，將其置于水浴鍋中，以土壤表面沒入水面之下為標準，用水銀溫度計監(jiān)測土壤表面下5～8 cm 處的溫度。處理前先對自然生長環(huán)境30/25 ℃氣溫/根區(qū)溫度組合中的葉片進行熒光參數(shù)的測定并以此為對照（CK），然后將根區(qū)溫度穩(wěn)定在（35±2）℃，利用人工氣候箱控制空氣溫度，共設置（30±1）℃、（35±1）℃、（40±1）℃ 3 個氣溫梯度，脅迫處理時間均為5 h，分別記為T1、T2、T3。而后在30/35 ℃氣溫/根區(qū)溫度組合下暗恢復3 h，在0 h（R0）、1 h（R1）、2 h（R2）和3 h（R3）分別選擇第5 節(jié)位的完全展開葉進行相關參數(shù)的測定。

1.2 快速葉綠素熒光誘導曲線的測定

用連續(xù)激發(fā)式熒光儀（Handy PEA，Hansatech，英國）對不同處理后的葡萄葉片充分暗適應30 min后測定快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP 曲線），OJIP 曲線由3 000 μmol·m-2·s-1紅光誘導，測定時間為1 s。從OJIP 曲線中可以得到以下參數(shù)。Fo：（20～50 μs）最小熒光；Fk：K 點（0.3 ms）的熒光；Fj：2 ms 時J 點的熒光；Fi：30 ms 時I 點的熒光；Fm：0.3～2 s 時的最大熒光。

依據(jù)JIP-text 得到的OJIP 曲線，可獲得如下參數(shù)[19-20]。PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）＝φPo＝TRo/ABS＝［1－（Fo/Fm）］；J 點的相對可變熒光（Vj）＝（Fj－Fo）/（Fm/Fo）；單位面積內(nèi)有活性的反應中心的數(shù)量（RC/CSm）＝Fm·φPo·（Vj/Mo）；捕獲激子將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA的其他電子受體的概率（φEo）＝ETo/TRo＝（1－Vj）；單位面積吸收的光能（ABS/CSm）≈Fm；單位面積捕獲的光能（TRo/CSm）＝φPo·（ABS/CSm）；單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額（ETo/CSm）＝φEo·（ABS/CSm）；單位反應中心吸收的光能（ABS/RC）＝Mo·（1/Vj）·（1/φPo）；單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量（ETo/RC）＝Mo·（1/Vj）·φEo；單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量（TRo/RC）＝Mo·（1/Vj）；用（Fm－Fo）進行標準化后K 點相對可變熒光的變化（Wk）＝（Ft－Fo）/（Fm－Fo）。

1.3 葉綠素熒光淬滅參數(shù)的測定

使用Dual-PAM-100 葉綠素熒光儀（Walz，德國）進行飽和脈沖分析，在測量之前將植株于原處理環(huán)境中暗適應30 min。測定暗適應后最小熒光（Fo）和PSⅡ最大熒光產(chǎn)量（Fm）以及P700 中最大氧化量子產(chǎn)量（Pm）。然后打開光化光測定誘導曲線，光照強度設定為471 μmol·m-2·s-1，每30s 打開1次飽和脈沖（10 000 μmol·m-2·s-1）對熒光參數(shù)進行測定，記錄不同光化光強度下熒光參數(shù)及光曲線擬合參數(shù)的變化。參照儀器使用說明手冊以及Kramer 等[21]的方法分析不同葉綠素熒光參數(shù)，Y（Ⅱ）＝（Fm′－Fs）/Fm′：PSⅡ的有效量子效率；Y（NO）＝1/［NPQ＋1＋qL（Fm/Fo－1）：非調(diào)節(jié)能量耗散的量子產(chǎn)率；Y（NPQ）＝1－Y（Ⅱ）－1/［NPQ＋1＋qL（Fm/Fo－1）］：調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)率；qP＝（Fm′－Fs）/（Fm′－Fo′）：光化學淬滅，由于光誘導碳同化酶的活化和氣孔的開放，使得電子從PSⅡ向外傳遞的速率加快而引起的熒光猝滅；1－qP：PSⅡ次級電子受體QA氧化還原狀態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2019 處理數(shù)據(jù)和作圖，用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及多重比較。數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理對葡萄葉片快速葉綠素熒光動力學曲線（OJIP）的影響

OJIP 曲線能反映多種關于PSⅡ的光化學信息，因此熒光檢測分析技術被廣泛地應用到PSⅡ活性的檢驗上[22-23]。如圖1-A 所示，脅迫處理后T1、T2仍保持著典型的OJIP 曲線形狀，而T3 處理則失去了典型的形狀。T1、T2、T3 處理相較于CK P 點（0.3～2 s）最大熒光產(chǎn)量（maximal fluorescence，F(xiàn)m）均明顯下降，表明葉片單位面積吸收光能的能力顯著降低，而T3 處理O 點初始熒光（initial fluorescence，F(xiàn)o）強度相較于CK 明顯升高，O 點熒光是暗適應后的光合機構全部PSⅡ中心完全開放時的熒光強度，反映了PSⅡ天線色素受激發(fā)后的電子密度，F(xiàn)o明顯升高表明反應中心和天線色素可能發(fā)生了解離。

圖1 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理對原始快速葉綠素熒光誘導曲線（A）和標準化快速葉綠素熒光誘導曲線（B）的影響

為了更加直觀地展現(xiàn)出不同處理之間的差異，對原始的OJIP 曲線進行Vt＝（Ft－Fo）/（Fm－Fo）標準化處理后得到相對熒光變化曲線。從圖1-B 可知，與CK 相比，T1、T2 處理K 點（0.3 ms）、J 點（2 ms）有較為明顯的升高，但不及T3 處理K 點、J 點上升明顯，表明根區(qū)高溫下3 個處理放氧復合體（OEC）均受到了一定的損傷，天線色素捕獲的光能進入電子傳遞鏈的比例顯著降低，其中T3 處理損傷最為明顯。

2.2 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理及3 h 暗恢復對葡萄葉片快速葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響

與CK 相比，處理后葡萄葉片各參數(shù)均表現(xiàn)出明顯的變化，其中T3 處理各參數(shù)變化最為明顯，T1 處理變化幅度最小（圖2）。各處理葉片F(xiàn)v/Fm相較于CK 均有所下降，其中T3 處理下降幅度最大，下降了18.2%，T1、T2 處理分別降低了5.5%、5.0%；RC/CSm也表現(xiàn)出相同的變化趨勢，T1、T2、T3 處理分別下降了25.0%、27.5%、56.7%。T1、T2 處理的φEo較處理前變化幅度小，而T3 處理則表現(xiàn)出顯著的變化，下降了74.5%。Wk、Vj能夠反映PSⅡ供體側和受體側的受傷害程度，與處理前相比3 個處理Wk分別增加了12.7%、15.4%、26.4%，Vj分別上升了 5.5%、17.5%、115.3%，表明在 30/35 ℃、35/35 ℃、40/35 ℃的氣溫/根區(qū)溫度的環(huán)境中均對葉片PSⅡ供受體側造成了一定的損傷。暗恢復3 h后，T1、T2 處理的熒光參數(shù)具有明顯的回升或回落趨勢，表明T1、T2 對葉片的傷害是可逆的；T3 處理的Fv/Fm、RC/CSm、Wk在暗恢復過程中能夠較快地恢復，其中Fv/FmR3 期較R0 期上升了15.5%、RC/CSm上升了71.3%、Wk下降了6.0%，而φEo、Vj經(jīng)3 h 的恢復后并無明顯的回升或回落趨勢。

圖2 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理及3 h 暗恢復對快速葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響

通過JIP-text 還可以對葉片PSⅡ光能吸收、捕獲、傳遞效率進行分析[19]。如圖3-A、B、C 所示，以單位反應中心（RC，PSⅡ）為研究對象時，不同氣溫協(xié)同根區(qū)高溫處理的ABS/RC、TRo/RC相較于CK 均顯著上升，氣溫越高二者的上升幅度越大。相較于CK，T3 處理的ABS/RC、TRo/RC分別上升了39.3%、28.1%，而ETo/RC變化趨勢與前二者相反，相較于處理前，3 個處理的ETo/RC均有所下降，T3處理下降最顯著，降低了69.1%。經(jīng)過3 h 的暗恢復，各處理的ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC均無明顯的變化。

如圖3-D、E、F 所示，以單位面積（CS）為研究對象時，3 個處理的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm相較于CK 均顯著降低，其中T3 處理下降幅度最為顯著，與CK 相比T3 處理的ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm分別降低了21.7%、49.6%、82.2%。暗恢復3 h 后，3 個處理的ABS/CSm、TRo/CSm能夠較快地回升，3 個處理R3 期ABS/CSm較R0 期分別上升了10.1%、9.7%、18.6%，TRo/CSm分別上升了16.2%、24.0%、64.9%，而ETo/CSm無明顯的回升趨勢。

圖3 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理及3 h 暗恢復對葉片光能吸收、能量捕獲及電子傳遞的影響

2.3 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理及3 h 暗恢復對葡萄葉片熒光淬滅參數(shù)的影響

如表1 所示，高溫脅迫處理顯著降低了葉片的Y（Ⅱ），T1、T2、T3 處理與CK 相比分別降低了17.7%、33.3%、43.3%，氣溫越高Y（Ⅱ）值越??；Y（NO）的變化趨勢與Y（Ⅱ）相反，隨氣溫上升其值逐漸上升，T3 處理變化達到顯著水平，相較于處理前上升了47.1%；Y（NPQ）隨氣溫的上升呈現(xiàn)出先升高后下降的變化規(guī)律，但均未達到顯著水平；1－qP 表現(xiàn)出隨氣溫的升高而逐漸上升的趨勢，且均達到了顯著水平，分別上升了5.0%、6.3%、7.9%。經(jīng)3 h 暗恢復后，3 個處理Y（Ⅱ）值仍在繼續(xù)減小，其中T1 處理較脅迫處理后下降幅度達到顯著水平，降低了30.2%；Y（NO）值較脅迫處理后也有所降低，T3 處理較脅迫處理后下降幅度達到顯著水平，降低了10.4%；Y（NPQ）變化趨勢與前者相反，3 個處理較脅迫處理后有所上升，這可能是由于暗恢復后熱耗散機制活性恢復，耗散過剩激發(fā)能的能力上升所致；暗恢復后1－qP 同脅迫處理后相比無顯著變化。

表1 根區(qū)高溫脅迫下不同空氣溫度處理及3 h 暗恢復對葉綠素熒光淬滅參數(shù)的影響

3 討論與結論

植物的光合機構受到外界環(huán)境和內(nèi)部環(huán)境的綜合影響，光合作用的正常進行需要一定的溫度和光照范圍，超出這個范圍植物便會受到脅迫，對光合作用產(chǎn)生光抑制[24]。孫永江等[25]研究結果表明，在適宜的光照條件下，當空氣溫度上升至37 ℃及以上時，赤霞珠葡萄葉片的PSⅡ便會發(fā)生嚴重的光抑制甚至光破壞。Xia 等[26]研究表明，當根區(qū)溫度上升到36 ℃時，玉米葉片PSⅡ反應中心便會受到損傷，光合速率下降。本試驗也得出了相似的結論，經(jīng)過5 h 處理后T1、T2、T3 處理的Fv/Fm、φEo、RC/CSm相較于CK 顯著下降，且WK、Vj均有上升的趨勢，說明處理后葉片PSⅡ受到了一定的損傷。光破壞有2 種可能的情況，即起源于受體側的光破壞和起源于供體側的光破壞，前者主要是由于CO2同化受阻，還原性Q-A的積累促生了大量的三線態(tài)P680，三線態(tài)P680 能和O2反應生成強氧化劑單線態(tài)氧（1O2），而D1 蛋白中的組氨酸殘基是1O2攻擊、破壞的位點；后者則是由于原初電子供體電子傳遞受阻從而延長了P680+的壽命，P680+對D1 蛋白造成氧化破壞[27]。本研究中T1、T2 處理的Wk、Vj上升幅度大致相同，而T3 處理的Vj上升幅度顯著高于Wk的上升幅度，這可能是由于40/35 ℃的氣溫/根區(qū)溫度環(huán)境降低了Rubisco 的活性，抑制了PSⅡ受體側的電子傳遞，從而對PSⅡ造成了嚴重的光破壞。另外，T1、T2、T3 處理葉片的ABS/RC、TRo/RC值相較于CK 明顯上升，而ABS/CSm、TRo/CSm卻較CK 顯著下降，表明葉片可能通過增加單位反應中心的光能吸收和能量捕獲來彌補單位面積功能的下降，以此來適應脅迫環(huán)境。

許大全[28]研究表明，在沒有其他嚴重脅迫的自然環(huán)境中，光抑制是維護光合機構免受光破壞的機制運轉反應，它主要是以熱的形式耗散掉過剩光能從而避免過剩激發(fā)能的積累。在本試驗中，根區(qū)高溫的條件下葉片有效量子效率Y（Ⅱ）都呈現(xiàn)出下降趨勢，且氣溫越高下降幅度越大。在氣溫上升到40 ℃之前，葉片尚可以通過提高Y（NPQ）來耗散掉光合性能下降而過剩的激發(fā)能，以保護葉片不受到過剩激發(fā)能造成的氧化損傷，而當氣溫上升到40 ℃之后，調(diào)節(jié)性能量耗散機制變得低效，Y（NPQ）值較CK 顯著降低，從而致使T3 處理的Y（NO）顯著上升，此時T3 處理葉片光合機構受到了嚴重的損傷。

植物存在一系列的保護機制來緩解光的傷害作用，如葉黃素循環(huán)、環(huán)式電子傳遞、光呼吸等，其中D1 蛋白的快速合成被認為是重要的光修復途徑之一[29]。Luo 等[30]研究表明，葡萄葉片在氣溫40 ℃的適光環(huán)境中脅迫5 h 后經(jīng)一段時間的恢復后熒光指標均能恢復至對照水平，這表明葉片可以通過自身的修復機制進行快速的功能恢復。本試驗中經(jīng)過3 h 的暗恢復T1、T2 處理熒光參數(shù)具有明顯的回升或回落趨勢，表明室溫黑暗處理對根區(qū)高溫環(huán)境中葉片PSⅡ具有一定的恢復作用；T3 處理經(jīng)3 h 的暗恢復Fv/Fm、RC/CSm、ABS/CSm、TRo/CSm能夠較快地回升，而φEo、Vj、ETo/CSm無明顯的回升或回落趨勢，這可能是由于T3 處理下電子從QA到QB的傳遞受阻，三線態(tài)P680 與O2反應生成1O2對D1 蛋白造成損傷，從而致使代表受體側受傷害程度的參數(shù)Vj不能較快地回落。另外，在暗恢復過程中，葉片還可以通過提高Y（NPQ）和提高1－qP 的方式來減少激發(fā)能的積累，從而對光合機構起到一定的保護作用。

綜上所述，30/35 ℃、35/35 ℃氣溫/根區(qū)溫度的環(huán)境中對葉片PSⅡ產(chǎn)生的影響較小，并且經(jīng)過暗恢復后呈現(xiàn)出明顯的恢復趨勢；而在40/35 ℃氣溫/根區(qū)溫度的環(huán)境中，PSⅡ受到了嚴重的損傷，且經(jīng)過暗恢復后φEo、Vj、ETo/CSm無明顯的回升或回落趨勢，表明此環(huán)境條件下由于電子傳遞受阻而對PSⅡ受體側造成的損傷在短時間內(nèi)無法恢復。