水稻化感抗（耐）稗草相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsMYB57的靶蛋白篩選

張翠 馬繼瓊 楊奕 許明輝 孫一丁 郭怡卿

摘要：【目的】揭示水稻化感抗（耐）稗草的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為遺傳修飾改良水稻化感性狀做鋪墊，也為雜草的防控提供新途徑?！痉椒ā坷肧MART技術(shù)，通過同源重組方式，在Y2H菌株中構(gòu)建水稻受稗草脅迫的酵母cDNA文庫;利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NdeⅠ構(gòu)建OsMYB57 C端缺失的pGBK-OsMYB57誘餌載體，按照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2操作檢測誘餌自激活活性;用酵母雙雜交技術(shù)篩選OsMYB57互作蛋白，將所得互作蛋白的編碼序列構(gòu)建至pGAD載體，并與誘餌載體共轉(zhuǎn)化Y2HGold菌株驗(yàn)證蛋白互作，再以BiFC技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白間的互作。【結(jié)果】酵母cDNA文庫庫容量為1.36×107 CFU/mL，插入片段在250～2000 bp，平均長度大于1000 bp，重組率為100%，庫容量大且質(zhì)量良好;篩選出4個(gè)有注釋的互作蛋白，分別是16號(hào)RZFP34、50號(hào)4HTR、51號(hào)BM1PD和74號(hào)GTP1;回轉(zhuǎn)驗(yàn)證及BiFC結(jié)果顯示RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1與OsMYB57在植物細(xì)胞中相互作用，其中RZFP34是一個(gè)E3亞型泛素連接酶，在植物中響應(yīng)非生物逆境脅迫應(yīng)答，且水稻OsRZFP34基因啟動(dòng)子區(qū)含有與水稻化感調(diào)控有關(guān)的水楊酸和茉莉酸等激素響應(yīng)及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域相關(guān)元件?！窘Y(jié)論】RZFP34通過與OsMYB57互作參與水稻化感轉(zhuǎn)錄調(diào)控而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 水稻;稗草;互作;化感抗（耐）性;OsMYB57;酵母雙雜交

中圖分類號(hào)： S511;Q756? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）01-0029-09

Screening of target protein of rice allelopathy resistance to barnyard grass related transcription factor OsMYB57

ZHANG Cui1， MA Ji-qiong2， YANG Yi2， XU Ming-hui2， SUN Yi-ding2*， GUO Yi-qing1*

（1College of Plant Protection，Yunnan Agricul tural University， Kunming? 650201， China; 2Institute of Biotechnology and Genetic Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming? 650205， China）

Abstract：【Objective】To explore the transcriptional regulation mechanism on rice allelopathy resistant weeds， and provide theoretical basis for breeding rice of resistant weeds.It provided basis for the genetic modification and improvement of rice allelopathy traits， and also provided a new way for the prevention and control of weeds. 【Method】Using SMART technology， cDNA library of rice under barnyard grass stress was constructed in Y2H by homologous recombination. The decoy vector pGBK-OsMYB57 with C-terminal deletion of OsMYB57 was constructed using restriction endonuclease BamHⅠ and NdeⅠ， and its self-activation activity was detected according to YeastmakerTM Yeast Transformation System 2. The interaction protein of OsMYB57 was screened by yeast two-hybrid technology， and pGAD vector was constructed with the interaction protein coding sequence， and the interaction protein of Y2HGold strain was co-transformed with bait vector. The interaction between proteins was further verified by BiFC technology. 【Result】The size of yeast cDNA library was 1.36×107 CFU/mL， the inserted fragment was 250-2000 bp， the average length was more than 1000 bp， and the recombinant rate was 100%， showed that the library was large and of good quality. Four annotated interacting proteins， RZFP34 16， 4HTR 50， BM1PD 51 and GTP1 74， were screened out. RZFP34， 4HTR， BMIPD and GTP1 interacted with OsMYB57 in plant cells. The RZFP34 was an E3 subtype ubiquitin ligase that responded to abiotic stress in plants， and the promoter region of rice OsRZFP34 contained elements related to hormone response such as salicylic acid， jasmonic acid and MYB transcription factor binding domain related to allelopathy regulation of rice. 【Conclusion】RZFP34 interacts with OsMYB57 and participates in allelopathy transcriptional regulation of rice.

Key words： rice; barnyard grass; interaction; allelopathic resistance; OsMYB57; yeast two-hybrid

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31760523）;Yunnan Science and Technology Plan Project（2018FB146，2018FB063）

0 引言

【研究意義】水稻是重要的糧食作物，雜草是稻田的重要有害生物，全球每年因草害導(dǎo)致的水稻產(chǎn)量損失可高達(dá)11%。稗草是田間最難防除的惡性伴生雜草（孔垂華，2018;佟瑤等，2021）。以化學(xué)除草劑為主要手段的稻田雜草防除帶來了雜草抗藥性、藥劑殘留和后茬作物藥害、生產(chǎn)成本增加及環(huán)境污染等諸多問題（郭玉峰和鄧之亮，2018）。植物化感作用是指一種植物向周圍環(huán)境釋放特定的化感物質(zhì)而影響鄰近植物生長的現(xiàn)象，是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制和對(duì)逆境的防御機(jī)制（張小云等，2018;趙新梅等，2019）。因此，利用化感作用選育水稻抗（耐）稗草品種，是稻田稗草防除的重要途徑（李家玉等，2021）?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】楊小燕（2017）利用田間抑草圈法從135個(gè)水稻品種中篩選出42個(gè)對(duì)稗草具有化感潛力的水稻品種，豐富了水稻化感研究的種質(zhì)資源，同時(shí)證明利用水稻化感作用防控田間稗草的可行性?；兴就ㄟ^釋放化感物質(zhì)抑制雜草生長，當(dāng)前研究表明酚酸類和萜類等化合物是水稻的主要化感物質(zhì)（郭怡卿，2017），分別由苯丙酸代謝和類異戊二烯生物合成途徑所產(chǎn)生。其中酚酸類化合物是目前研究最多的一類化感物質(zhì)，酚酸類物質(zhì)的代謝途徑包括莽草酸途徑、苯丙烷代謝途徑及類黃酮代謝途徑，其中苯丙烷代謝途徑在酚酸類物質(zhì)代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂酸-4-羥化酶（C4H）是苯丙烷途徑中的關(guān)鍵酶（陳志杰等，2018;高媛等，2018）。PAL酶對(duì)植物生長發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫具有重要意義。曾嘉麗等（2018）通過生物信息學(xué)方法對(duì)水稻PAL基因功能進(jìn)行分析，結(jié)果表明PAL酶活性是衡量植物抗逆能力的生理指標(biāo)。真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄因子的參與，如在楊樹轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)20個(gè)與響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)的基因，在植物生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。一些轉(zhuǎn)錄因子可通過結(jié)合相關(guān)順式作用元件，調(diào)控苯丙烷途徑相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物抵御環(huán)境脅迫的能力（王玉等;2019）。MYB是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，包括1R、3R、4R和R2R3等4種類型，其中R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子參與對(duì)植物次生代謝基因的調(diào)控。有研究在丹參中發(fā)現(xiàn)一種新的內(nèi)源性R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmMYB36，能促進(jìn)毛狀根中丹參酮的積累，抑制酚酸和黃酮的生物合成，因此，代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控能導(dǎo)致代謝物含量改變（Ding et al.，2017）。隨后，趙英（2019）通過酵母雙雜交、轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析等方法證明丹參SmMYB36基因與SmMYC2結(jié)合形成復(fù)合物，從而參與丹參次生代謝的調(diào)控。此外，中藥材金銀花中的LmMYB15具有轉(zhuǎn)錄激活功能，可通過結(jié)合并激活4CL、MYB3和MYB4啟動(dòng)子調(diào)控苯丙烷代謝途徑，促進(jìn)3-咖啡奎寧酸（CGA）的生物合成和苯丙素代謝（Tang et al.，2021），增強(qiáng)R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝尤其是苯丙烷代謝途徑中的重要地位。在植物逆境生理研究領(lǐng)域，F(xiàn)ang等（2020）通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)OsMAPK11通過與OsPAL2;3相互作用調(diào)節(jié)水稻對(duì)稗草的抑制作用，而OsMAPK11的表達(dá)又受到OsMYB57（R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子）的正調(diào)控，表明OsMYB57在水稻響應(yīng)雜草脅迫中發(fā)揮著積極作用。然而，水稻抗（耐）稗草機(jī)制是一個(gè)多基因共同作用、涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的復(fù)雜過程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，OsMYB57在水稻化感抗（耐）稗草作用中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍有待探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于OsMYB57結(jié)構(gòu)域分析基礎(chǔ)，采用SMART技術(shù)構(gòu)建受稗草脅迫0～20 d的水稻cDNA文庫;通過酵母雙雜交篩選出與OsMYB57互作的蛋白，并結(jié)合雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)對(duì)互作蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以期挖掘更多與OsMYB57互作的蛋白，揭示水稻化感抗（耐）稗草的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為遺傳修飾改良水稻化感性狀做鋪墊，也為雜草的防控提供新途徑。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 植物材料 水稻材料是與稗草共培養(yǎng)不同時(shí)間段的化感水稻PI312777。水稻種子利用20%次氯酸鈉消毒液浸泡10 min，然后用滅菌ddH2O漂洗4～5次，將種子置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿置于28 ℃、相對(duì)濕度80%左右的環(huán)境中，待種子萌發(fā)后將發(fā)芽種子移栽至裝有水稻土的育苗盤中（40 cm×30 cm×15 cm）培育，期間注意施加適量的氮肥。當(dāng)水稻苗長至3葉1心期時(shí)移入經(jīng)過同樣消毒處理后萌芽的稗草（稗草∶水稻=1∶1）共培20 d，取共培養(yǎng)0、1、7和20 d 4個(gè)時(shí)間段水稻材料的葉片，經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本氏煙?4 h光照∶10 h黑暗、25 ℃、相對(duì)濕度70%條件下培養(yǎng)5周左右。

1. 1. 2 主要試劑、菌株和載體 RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司;Taq DNA聚合酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒、乙酰丁香酮、MES、氯化鎂（MgCl2）和醋酸鋰（LiAc）等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;培養(yǎng)基YPDA、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp（DDO）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（QDO）和X-a-Gal （X）均購自北京酷來搏科技有限公司;金擔(dān)子素（aureobasidin A，AbA）、酵母菌株（Y2HGold）及載體（pGADT7-Rec、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGADT7、pGBKT7-Lam和pGBKT7）、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTM Yeast Transformation System 2（Cat.No. 630439）、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NdeⅠ及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司。

1. 2 酵母雙雜交文庫構(gòu)建及鑒定

參照Oligotex mRNA Midi Kit說明書進(jìn)行mRNA的分離純化，然后按照CloneMiner說明書進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，將cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187進(jìn)行酵母文庫構(gòu)建，收集轉(zhuǎn)化子保存于-80 ℃冰箱，即為酵母雙雜交文庫。

1. 3 互作蛋白篩選及回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將載體pGBKT7-OsMYB57轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30 ℃下以250 r/min搖瓶培養(yǎng)至OD600為1.0;1000 g離心收集菌體，用1 mL SD/-Trp培養(yǎng)基重懸菌液使細(xì)胞數(shù)達(dá)1.0×108 CFU/mL并轉(zhuǎn)移到2 L錐形瓶中，加入1 mL文庫菌液和45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基;30 ℃下以50 r/min搖瓶培養(yǎng)，16 h后觀察是否出現(xiàn)酵母合子細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間不超過24 h;1000 g離心收集細(xì)胞，用適量0.5×YPDA清洗錐形瓶并收集殘余細(xì)胞;加入適量0.5×YPDA重懸菌液，涂布于QDO培養(yǎng)基，30 ℃下培養(yǎng)5 d左右。將QDO培養(yǎng)基上生長的菌落轉(zhuǎn)涂于QDO/A培養(yǎng)基上，觀察菌落，挑選藍(lán)色克隆繼續(xù)驗(yàn)證。隨機(jī)挑選10個(gè)可在QDO/X/A培養(yǎng)基上生長的藍(lán)色克隆進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，分別提取陽性酵母中的pGADT7重組載體質(zhì)粒，然后再將pGADT7重組載體與pGBKT7-OsMYB57載體共同轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold中，涂布于QDO/X/A培養(yǎng)基上，以pGBKT7-53/pGADT7-T組合生長情況為陽性對(duì)照，pGBKT7-Lam/pGADT7-T組合為陰性對(duì)照。觀察酵母是否生長或變藍(lán)，若生長且變藍(lán)，則證明為真實(shí)互作，否則可能為假陽性。

1. 4 BiFC蛋白互作驗(yàn)證

將RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1和OsMYB57基因構(gòu)建到載體pCAMBI-YN-GFP及pCAMBI-YC-GFP上，即pCAMBI-YN-GFP-RZFP34、pCAMBI-YN-GFP-4HTR、pCAMBI-YN-GFP-BMIPD、pCAMBI-YN-GFP-GTP1和pCAMBI-YC-GFP-OsMYB57。pCAMBI-YC-GFP -OsPid2-2和載體pCAMBI-YN-GFP、pCAMBI-YC-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，挑取含有目的載體的農(nóng)桿菌單克隆至含有卡納霉素和利福平抗生素的3 mL YEB培養(yǎng)基中，28 ℃下200 r/min過夜培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)移1 mL至20 mL含有抗生素和15 μmol/L乙酰丁香酮的YEB中，28 ℃下200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5。5000 r/min離心10 min收集菌體，用浸染液懸浮農(nóng)桿菌菌體至OD600為1.0。室溫靜止2.5 h。按照互作驗(yàn)證要求等體積混合對(duì)應(yīng)的YN-GFP和YC-GFP的菌體（RZFP34 YN-GFP+OsMYB57 YC-GFP、4HTR YN-GFP+OsMYB57 YC-GFP、BMIPD YN-GFP+OsMYB57 YC-GFP、GTP1 YN-GFP+OsMYB57 YC-GFP、YN-GFP+OsPid2-2YC-GFP為陽性對(duì)照，YN-GFP+YC-GFP為陰性對(duì)照），用注射器從煙草葉片背面?zhèn)谔幾⑸渚?，做好?biāo)記，21 ℃黑暗保濕培養(yǎng)2 d后于倒置熒光顯微鏡下觀察注射周圍區(qū)域有無熒光。

1. 5 OsRZFP34啟動(dòng)子序列分析

運(yùn)用在線網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析OsRZFP34啟動(dòng)子區(qū)域3553 bp序列的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水稻酵母雙雜交cDNA文庫的建立

分別取0～20 d不同時(shí)間段稗草脅迫的水稻葉片，用TRIzol法提取總RNA，按濃度等比例混合，超微量分光光度計(jì)（DS-11）測量RNA的OD260/OD280=1.96，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，28Sr RNA、18S? rRNA特異條帶清晰，且亮度比接近2∶1（圖1-A），用Invitrogen的CloneMiner II試劑盒構(gòu)建的cDNA初級(jí)文庫經(jīng)電泳檢測片段彌散分布于100～5000 bp（圖1-B），說明RNA和cDNA質(zhì)量良好。

從獲得總體積為200 mL的酵母雙雜交文庫中隨機(jī)取出100 μL酵母菌液，按1∶100、 1∶1000和1∶10000進(jìn)行稀釋，取100 μL稀釋液涂布于SD/-Leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h。在稀釋度為1∶10000的平板上統(tǒng)計(jì)單克隆數(shù)，其庫容量為1.36×107 CFU/mL（圖2-A）。于培養(yǎng)基平板中隨機(jī)挑取24個(gè)酵母單克隆，利用PCR技術(shù)對(duì)其插入片段進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，所有克隆均能擴(kuò)增出單一條帶且插入片段在250～2000 bp，平均長度大于1000 bp，重組率為100%（圖2-B），表明所構(gòu)建文庫的質(zhì)量良好，可用于后續(xù)蛋白互作篩選試驗(yàn)。

2. 2 OsMYB57誘餌載體的構(gòu)建和自激活檢測

酵母雙雜交篩庫前要構(gòu)建pGBKT7-OsMYB57誘餌載體并對(duì)其進(jìn)行自激活檢測，由于OsMYB57的C端存在激活域從而使其具有自激活活性，為避免重組誘餌蛋白的毒性作用，設(shè)計(jì)引物以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，擴(kuò)增得到OsMYB57 C端缺失的OsMYB57片段（565 bp）（圖3-A），并構(gòu)建到pGBKT7載體上，將誘餌載體pGBK-OsMYB57、pGBK-53和pGBK-Lam分別與pGAD-T7質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入Y2HGold中，觀察到pGBK-OsMYB57和pGBK-Lam不能在QDO/A培養(yǎng)基上生長，說明pGBK-OsMYB57無自激活活性，可進(jìn)行后續(xù)的文庫篩選（圖3-B）。

2. 3 誘餌pGBK-OsMYB57互作蛋白篩選結(jié)果

將轉(zhuǎn)入pGBK-OsMYB57載體的Y2HGold菌株和構(gòu)建好的酵母文庫菌株共培養(yǎng)，30 ℃下50 r/min搖床中培養(yǎng)20 h，在顯微鏡下觀察到如米老鼠頭像般的酵母結(jié)合子（圖4-A），證明酵母培養(yǎng)液中誘餌菌株與文庫菌株正常雜交，后繼續(xù)將酵母細(xì)胞涂布于DDO/X/A培養(yǎng)基上，于30 ℃下生長3～5 d，待長出菌落，選擇正常生長的藍(lán)色菌落轉(zhuǎn)移到DDO/X/A培養(yǎng)基上繼續(xù)純化培養(yǎng)。最后得到48個(gè)可正常生長的藍(lán)色菌落（圖4-B），即為候選陽性克隆。

2. 4 誘餌載體篩庫結(jié)果

將48個(gè)陽性克隆提取pDADT7融合載體質(zhì)粒并進(jìn)行測序分析，通過NCBI比對(duì)結(jié)果并排除假陽性，獲得4個(gè)具有功能注釋的互作蛋白（表1），包括E3 ubiquitin-protein ligase RZFP34 isoform X1（RZFP34，登錄號(hào)XP_015612719.1）、Probable 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase 2（4HTR，登錄號(hào)XP_015631811.1）、Probable bifunctional methylthioribμLose-1-phosphate dehydratase/enolase-phosphatase E1（BMIPD，登錄號(hào)XP_015617752.1）和GTPase activating protein 1（GTP1，登錄號(hào)XP_015627 601.1），相似性均為100%。

功能注釋分析表明，RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1基因全長分別為864、916、919和853 bp;蛋白長度分別為288、305、303和251 aa;分別位于10、3、11和10號(hào)染色體（表2）。RZFP34屬于E3泛素亞型連接酶，包含環(huán)指和CHY鋅指結(jié)構(gòu)域;4HTR為二氫甲基吡啶酸還原酶，參與生物合成和新陳代謝過程，在胞質(zhì)細(xì)胞合成中起催化作用，DapB是中二胺肟酸途徑中的一種重要酶;BMIPD為雙功能甲基硫代酮糖-1-磷酸脫氫酶/烯醇酶磷酸酶E1，參與生物合成及新陳代謝過程，在細(xì)胞合成中起催化及水解作用;GTP1為HR病變誘導(dǎo)家族蛋白（表2）。

2. 5 互作蛋白回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

分別將pGAD-Rce-RZFP34、pGAD-Rce-4HTR、pGAD-Rce-BMIPD、pGAD-Rce-GTP1與pGBK-OsMYB57載體共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold中，于DDO培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長3 d后挑選生長良好的菌落，經(jīng)0.9% NaCl稀釋后轉(zhuǎn)至QDO/X/A培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照相比，4個(gè)克隆可正常生長且為藍(lán)色，表明RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1與OsMYB57互作（圖5）。

2. 6 OsMYB57互作蛋白的雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)

分別將RZFP34、4HTR、BMIPD和GTP1基因構(gòu)建到pCAMBI-YN-GFP載體，OsMYB57構(gòu)建到pCAMBI-YC-GFP載體，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，等體積混合含有RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1YN-GFP和OsMYB57YC-GFP質(zhì)粒的菌體。pCAMBI-YN-GFP-RZFP34、pCAMBI-YN-GFP-4HTR、pCAMBI-YN-GFP-BMIPD、pCAMBI-YN-GFP-GTP1分別與OsMYB57YC-GFP組合，以YN-GFP+pid2-2YC-GFP為陽性對(duì)照，YN-GFP+YC-GFP為陰性對(duì)照，注射煙草后在倒置熒光顯微鏡下觀察，與陰性對(duì)照相比，所有組合均能產(chǎn)生熒光（圖6），說明RZFP34、4HTR、BMIPD、GTP1與OsMYB57在植物細(xì)胞中相互作用。

2. 7 RZFP34生物信息學(xué)分析

通過PlantCARE在線網(wǎng)站分析RZFP34基因啟動(dòng)子區(qū)域3553 bp序列，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子區(qū)包含許多參與激素響應(yīng)、光響應(yīng)及逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件（表3）。這些元件主要包括9個(gè)光響應(yīng)元件（ACE、AE-box、G-Box、G-box、GT1-motif、I-box、Sp1和TCCC-motif），2個(gè)與水楊酸響應(yīng)相關(guān)的元件（TCA-element），4個(gè)與茉莉酸甲酯響應(yīng)相關(guān)的元件（CGTCA-motif、TGACG-motif），3個(gè)與ABA激素響應(yīng)相關(guān)的元件（ABRE），1個(gè)與赤霉素響應(yīng)相關(guān)的元件（P-box），1個(gè)與生長素響應(yīng)相關(guān)的元件（TGA-element），1個(gè)參與調(diào)控分生組織表達(dá)的元件（CAT-box）和1個(gè)與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS），9個(gè)（MYB）、1個(gè)（MYB recognition site）、1個(gè)（Myb）、11個(gè)（MYC）及3個(gè)（Myb-binding site）等與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合相關(guān)或轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)相關(guān)的順式作用元件。

3 討論

近年來，利用作物化感控制稻田雜草的方法因符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)和生態(tài)友好理念而備受關(guān)注（Jabran et al.，2015），化感作用通過化感物質(zhì)發(fā)揮作用，化感水稻可通過調(diào)控自身次生代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，合成重要化感物質(zhì)酚酸類化合物，從而抑制稗草的生長（Fang et al.，2013）。MYB家族中R2R3型轉(zhuǎn)錄因子參與植物的次生代謝相關(guān)基因調(diào)控，水稻中R2R3型轉(zhuǎn)錄因子OsMYB57正向調(diào)控稗草脅迫應(yīng)答（Fang et al.，2020），但OsMYB57的化感抑草網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制仍有待研究，基于此構(gòu)建了水稻受稗草脅迫不同時(shí)間段的酵母cDNA文庫，文庫質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明，其優(yōu)異的庫容量達(dá)到孫一丁等（2021）構(gòu)建的受稻瘟病誘導(dǎo)后不同時(shí)間段的含抗性基因Pid2水稻材料的cDNA文庫質(zhì)量水平，為后續(xù)酵母文庫的篩選提供了保障。酵母雙雜交（Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（BIFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（Protein chip）和鄰近生物素識(shí)別技術(shù)（BioID）等是目前植物蛋白互作的主要研究方法（張恒等，2020），其中酵母雙雜交技術(shù)以其快速、直接、靈敏的優(yōu)點(diǎn)將蛋白間微弱的瞬時(shí)作用描述出來，從而研究蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及挖掘植物新蛋白的功能（王麗梅和魏傳垠，2001;馬海蓉和李維琪，2003）。但酵母雙雜交的高靈敏度可能導(dǎo)致篩選出的互作蛋白成假陽性，因此還需結(jié)合BiFC和pull-down等蛋白互作研究方法對(duì)互作蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。

利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出4個(gè)有注釋的與OsMYB57互作的蛋白，在4個(gè)蛋白中，4HTR參與了生物合成和新陳代謝過程，在胞質(zhì)細(xì)胞合成中起催化作用;DapB是中二胺肟酸途徑的一種重要酶，是開發(fā)新抗生素的潛在靶點(diǎn)（Pote et al.，2018）。BMIPD參與生物合成及新陳代謝過程，在細(xì)胞合成中起催化及水解作用;MASA是一種普遍存在的蛋氨酸合成途徑中的雙功能酶，催化2，3-二酮-5-甲基硫代-1-磷酸戊烷連續(xù)反應(yīng)生成還原型代謝產(chǎn)物（Wang et al.，2005）。GTP1為HR病變誘導(dǎo)家族蛋白，可調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂和細(xì)胞分化（Wang et al.，2018）。RZFP34是一種E3泛素亞型連接酶，含有環(huán)指和CHY鋅指結(jié)構(gòu)域，RZFP34在擬南芥中的同源蛋白AtRZFP34可通過SnRK 2.6介導(dǎo)的磷酸化和自身泛素化促進(jìn)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉、產(chǎn)生活性氧并增強(qiáng)擬南芥抗旱性（Ding et al.，2017）。環(huán)鋅指蛋白基因多受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在白菜中低溫、鹽和ABA誘導(dǎo)BrRZFP1的表達(dá)，BrRZFP1過表達(dá)提高了白菜對(duì)低溫、鹽和脫水脅迫的耐受力（Jung et al.，2013）。有研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中高溫脅迫和ABA處理均能誘導(dǎo)OsRZFP34的表達(dá)，OsRZFP34過表達(dá)通過增大高溫脅迫下水稻氣孔的張度來降低葉片溫度（Hsu et al.，2014）。生物信息學(xué)對(duì)OsRZFP34分析表明，啟動(dòng)子上具有許多與激素水楊酸、茉莉酸、生長素、赤霉素和其他逆境響應(yīng)及MYB類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等相關(guān)元件，因此該基因可能參與了植物響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。由于水稻化感抗（耐）性與水楊酸和茉莉酸信號(hào)途徑密切相關(guān)（劉亞洲等，2019），推測OsRZFP34可能通過與OsMYB57的相互作用，利用泛素化機(jī)制對(duì)OsMYB57蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，以此影響水稻的化感抗（耐）機(jī)制，后期將從泛素化對(duì)OsMYB57的降解作用方面進(jìn)行驗(yàn)證，并利用反向遺傳學(xué)探究OsRZFP34參與水稻化感的調(diào)控作用，以期為研究水稻化感抗（耐）稗草的機(jī)制提供依據(jù)，也為遺傳修飾改良水稻化感性狀提供更多的選擇。

4 結(jié)論

經(jīng)篩庫獲得的OsMYB57互作蛋白R(shí)ZPF34是一種E3泛素亞型連接酶，其參與植物激素應(yīng)答、非生物逆境脅迫響應(yīng)及氣孔調(diào)節(jié)等過程，在水稻OsRZPF34基因的啟動(dòng)子中存在與水稻化感作用相關(guān)的茉莉酸及水楊酸激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件，可為RZPF34與OsMYB57互作機(jī)制的研究提供新思路。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）