新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后NLRP6炎癥小體的變化

聶影

摘要：目的：通過制備新生Sprague-Dawley大鼠缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic ischemic brain damage，HIBD）的動物模型。測定HIBD在不同時間點腦組織中NLRP6，Cleaved-caspase-1，IL-18，IL-1β的表達(dá)。方法：選擇7日齡SD大鼠120只作為研究對象，將其隨機(jī)分為3組，每組40只，空白組、假手術(shù)組、缺氧缺血性腦損傷組（HIBD組），在第6h、24h、48h、72h、7d取材，建立動物模型，行免疫組化分析、蛋白免疫印跡、PCR檢測。結(jié)果：空白組、假手術(shù)組無陽性IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)，Cleaved-caspase-1表達(dá)水平低，NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低。HIBD組IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平增加，72h最為顯著，HIBD組Cleaved-caspase-1表達(dá)水平逐漸增加，72h最為顯著，HIBD組NLRP6、Caspase-1的mRNA處理水平也開始顯著提高，72小時達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：7日齡新生兒SD大鼠模型建立成功且有實驗意義。隨著時間損傷逐漸加重，與NLRP6、Cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18的表達(dá)上調(diào)存在相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇7日齡SD大鼠120只作為研究對象，將其隨機(jī)分為3組，每組40只，空白組、假手術(shù)組、缺氧缺血性腦損傷組（HIBD組），所有大鼠體重范圍在（200±20）g，由長春市億斯實驗動物科技公司生產(chǎn)供應(yīng)。佳木斯大學(xué)實驗動物研究中心飼養(yǎng)，120只大鼠無性別差異，體重在（13±2）g范圍內(nèi)。試劑及器械均有佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 方法

動物模型建立：HI組： 參照改良Rice-Vannuncci法建立模型，具體流程包括：行左側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，92 % N+8 % O混合氣體缺氧處理2.5 h，建立缺氧缺血腦損傷模型;Sham組：僅將左側(cè)頸總動脈鈍性分離，不給予結(jié)扎，不行缺氧缺血處理;Control組：不做任何處理。HE染色，尼式染色，免疫組化分析，WesternBlot和熒光定量PCR檢測組腦組織標(biāo)本采集均需在冰上操作，隨后將其置入-80℃的低溫冷凍冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0分析實驗數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采取卡方檢驗，用率（n%）表示，計量資料行t檢驗，用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表達(dá)，若P<0.05，證明統(tǒng)計學(xué)意義存在。

2 結(jié)果

行為學(xué)：與空白組、假手術(shù)組相比，HIBD組有呼吸急促，站立不穩(wěn)等癥狀，缺氧后大鼠無法翻身。

HE病理學(xué)形態(tài)染色：空白組、假手術(shù)組在不同時間點下表現(xiàn)為形態(tài)豐富，層次清晰，數(shù)量正常，無病理變化。HIBD組6h后層次混亂，數(shù)量下降，24h腦卒中區(qū)域懷素，神經(jīng)元數(shù)量下降，48h腦組織區(qū)域出現(xiàn)明顯組織壞死，神經(jīng)元丟失，72h可見局灶壞死神經(jīng)元細(xì)胞和固縮，7天可見膠質(zhì)細(xì)胞增生。

尼氏形態(tài)學(xué)染色：空白組、假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞胞體飽滿，清晰可見細(xì)胞核，HIBD組神經(jīng)元細(xì)胞有損傷，細(xì)胞核溶解。

免疫組織化學(xué)染色：空白組、假手術(shù)組無陽性IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)，HIBD組IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平增加，72h最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

蛋白免疫印跡：空白組、假手術(shù)組Cleaved-caspase-1表達(dá)水平低，HIBD組Cleaved-caspase-1表達(dá)水平逐漸增加，72h最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

PCR檢測：空白組、假手術(shù)組 NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低，HIBD組NLRP6、Caspase-1的mRNA處理水平也開始顯著提高，72小時達(dá)到高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦損傷是新生兒死亡的主要原因，該病癥不僅影響新生兒的生活質(zhì)量，且給患兒家庭與社會帶來負(fù)擔(dān)。相關(guān)學(xué)者研究分析，炎癥是導(dǎo)致新生兒缺氧缺血性腦病發(fā)展的關(guān)鍵因素，疾病不斷發(fā)展，炎癥也會不斷加大對腦實質(zhì)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而引發(fā)繼發(fā)性腦組織損害。新生兒HIE中具體機(jī)制目前尚不確定，適應(yīng)性免疫在其中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，越來越多的研究證實：T細(xì)胞在慢性炎癥中發(fā)作重要作用，而B細(xì)胞可通過抗炎因子對HIE后炎癥和組織修復(fù)發(fā)揮保護(hù)作用。由此可說明，炎癥參與了腦損傷，且在修復(fù)與恢復(fù)中也有顯著作用。

炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)組成的蛋白復(fù)合體，可對促進(jìn)因子IL-1β和IL-18進(jìn)行激活，并引起宿主的炎癥反應(yīng)。對炎癥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其是有NLRPl-NLRPl4等共十四個亞親族構(gòu)成，包含NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM2等為主體的炎性細(xì)胞小體，其中以NLRP6最為集中，因為其具有正向調(diào)節(jié)作用功能，可維持上皮完整性，抑制癌物質(zhì)和神經(jīng)炎癥，還可使pro-IL-18，pro-IL-1β成為有活性的IL-18和IL-1β，加速炎癥反應(yīng)。NLRP6 在多種炎癥性疾病和宿主防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用，有學(xué)者研究表明NLRP6 炎性小體的表達(dá)在大鼠中被上調(diào)，可激活CLeaved-Caspase-1 信號傳導(dǎo)，引起神經(jīng)炎癥，通過 siRNA 干擾了 SE 大鼠大腦中的NLRP6 和 CLeaved-Caspase-1 ，具有神經(jīng)保護(hù)作用。而本次研究結(jié)果表明：空白組、假手術(shù)組無陽性IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)，Cleaved-caspase-1表達(dá)水平低，NLRP6、Caspase-1中的mRNA水平最低，HIBD組IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平增加，72h最為顯著，HIBD組Cleaved-caspase-1表達(dá)水平逐漸增加，72h最為顯著，HIBD組NLRP6、Caspase-1的mRNA處理水平也開始顯著提高，72小時達(dá)到高峰，由此可證實：7日齡新生兒SD大鼠模型建立成功。HIBD隨著時間損傷逐漸加重，與NLRP6、Cleaved-caspase1、IL-1β、IL-18的表達(dá)上調(diào)存在相關(guān)性。

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