頭孢菌素的聚合物分析

胡昌勤 張夏 李進(jìn)

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

對(duì)藥物雜質(zhì)譜(impurity profile)的控制一直是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外藥品質(zhì)量控制的關(guān)注熱點(diǎn)[1-2]。β-內(nèi)酰胺抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類(lèi)，頭孢菌素作為臨床中最重要的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺抗生素，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)仿制藥一致性評(píng)價(jià)的熱點(diǎn)品種。針對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素雜質(zhì)譜控制中的最薄弱環(huán)節(jié)——聚合物控制問(wèn)題[3]，作者已經(jīng)對(duì)青霉素類(lèi)抗生素聚合物分析的進(jìn)展進(jìn)行了綜述[4]，也對(duì)頭孢菌素中7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析策略與方法進(jìn)行了專門(mén)的討論[5]。鑒于頭孢菌素的聚合反應(yīng)與其3位側(cè)鏈和7位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，根據(jù)頭孢菌素7位側(cè)鏈的特點(diǎn)，將其分為7位側(cè)鏈含有伯氨基的頭孢菌素(7-氨噻肟頭孢菌素是其中的一類(lèi))和不含伯氨基的頭孢菌素；根據(jù)其3位側(cè)鏈的特點(diǎn)，將其分3位側(cè)鏈為烷基結(jié)構(gòu)和具有易解離基團(tuán)的頭孢菌素(圖1)；然而，實(shí)際產(chǎn)品中7位側(cè)鏈不含有伯氨基結(jié)構(gòu)且3位側(cè)鏈為烷基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素較少存在。本文通過(guò)對(duì)近年來(lái)文獻(xiàn)[6-11]的回顧性分析，將分別對(duì)7位側(cè)鏈含有伯氨基的頭孢菌素(不包括7-氨噻肟頭孢菌素)和7位側(cè)鏈不含有伯氨基但3位側(cè)鏈具有易解離基團(tuán)的二類(lèi)頭孢菌素的聚合物分析進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 7位側(cè)鏈具有伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素

7位側(cè)鏈含有伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素，除7-氨噻肟頭孢菌素外，目前臨床中主要有頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢丙烯和頭孢拉定。該類(lèi)頭孢菌素的3位側(cè)鏈較為穩(wěn)定，不易發(fā)生降解反應(yīng)；7位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與青霉素中氨芐西林、阿莫西林的6位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似；故認(rèn)為它們的聚合反應(yīng)與氨芐西林、阿莫西林的聚合反應(yīng)相似。根據(jù)對(duì)氨芐西林、阿莫西林聚合反應(yīng)的認(rèn)知[4,12]，其主要聚合反應(yīng)途徑為氨基攻擊β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合，其他可能的聚合反應(yīng)即使在強(qiáng)制聚合反應(yīng)中也較難發(fā)生；雖然氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合可以形成多種差異異構(gòu)體，但在實(shí)際產(chǎn)品中通常僅存在一個(gè)主要的異構(gòu)體，其他異構(gòu)體的含量較低可以忽略。以頭孢氨芐為例，在中國(guó)藥典2015版頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)色譜系統(tǒng)中，通過(guò)調(diào)整有機(jī)相比例使頭孢氨芐的保留時(shí)間約為5 min，主峰后可見(jiàn)5個(gè)主要雜質(zhì)峰；利用柱切換-LC/MS/MSn技術(shù)證明其中3個(gè)雜質(zhì)峰(MP-1、IMP-2和IMP-3)的分子量均為694.8 Da，質(zhì)譜裂解信息也基本相同，提示它們?yōu)轭^孢氨芐二聚體差向異構(gòu)體；其中MP-1的含量最高，是主要聚合產(chǎn)物[6]；與對(duì)氨芐西林、阿莫西林的聚合分析結(jié)果[4]相似。

對(duì)聚合物質(zhì)譜裂解信息的解析是聚合物分析中的重要環(huán)節(jié)，掌握頭孢菌素的質(zhì)譜裂解規(guī)律有助于對(duì)聚合物質(zhì)譜裂解途徑的推斷。該類(lèi)頭孢菌素典型的質(zhì)譜裂解規(guī)律見(jiàn)圖2A[13]，據(jù)此，可以較好地解釋頭孢氨芐二聚體二級(jí)質(zhì)譜圖中的主要碎片離子(圖2B～C)；而通過(guò)高分辨質(zhì)譜(HRMS)確定頭孢氨芐二聚體的精確分子量，分析其元素組成(C32H35O8N6S2+)，并與所推測(cè)結(jié)構(gòu)的理論分子量相比較(誤差僅差-1.384 ppm)，可進(jìn)一步確證所推測(cè)的頭孢氨芐二聚體結(jié)構(gòu)的正確性[6]。

采用高效凝膠色譜(HPSEC)-柱切換-LC/MS方法，分析頭孢拉定在非水溶液強(qiáng)制聚合中形成的聚合物雜質(zhì)[7]：在HPSEC的HPSEC-2和在HPSEC-3色譜峰中均發(fā)現(xiàn)頭孢拉定二聚體(MW698.2)；柱切換分析顯示它們?cè)赗P-HPLC中呈3個(gè)色譜峰，與頭孢氨芐二聚體相似；此外，在HPSEC-4和HPSEC-5色譜峰中分別發(fā)現(xiàn)頭孢拉定三聚體(MW1047.6)和頭孢拉定四聚體(MW1396.8)，但它們?cè)赗P-HPLC中均不呈尖銳的色譜峰，提示在HPSEC色譜峰中可能為多個(gè)差向異構(gòu)體的混合物。質(zhì)譜分析顯示，頭孢拉定二聚體的質(zhì)譜裂解途徑與頭孢氨芐二聚體相似；頭孢拉定三聚體在質(zhì)譜分析中產(chǎn)生的m/z699、m/z655和m/z521的特征離子，提示在裂解過(guò)程中產(chǎn)生了頭孢拉定二聚體；而m/z891的特征離子提示結(jié)構(gòu)中存在β-內(nèi)酰胺環(huán)(圖3)。

綜上，該類(lèi)頭孢菌素的主要聚合反應(yīng)為側(cè)鏈氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng)，實(shí)際產(chǎn)品中聚合物主要為二聚體，僅在非水溶液中強(qiáng)制聚合才易產(chǎn)生三聚、四聚體等多聚體。采用RP-HPLC方法，利用產(chǎn)品中的二聚體作為指針性聚合物可以表征產(chǎn)品中的聚合物總量，是理想的質(zhì)控分析方法，但應(yīng)用藥典收載的有關(guān)物質(zhì)方法時(shí)通常應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，保證聚合物雜質(zhì)被洗脫出。質(zhì)譜分析中該類(lèi)頭孢菌素聚合物的聚合位點(diǎn)易斷裂，形成藥物單體或低聚物；聚合物的主要裂解途徑符合藥物單體的質(zhì)譜裂解規(guī)律。通過(guò)高分辨質(zhì)譜(HRMS)的精確分子量，得到聚合物的元素組成，可以進(jìn)一步確證推測(cè)的聚合物結(jié)構(gòu)的正確性。

2 7位側(cè)鏈不具有伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素

7位側(cè)鏈不具有伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素，實(shí)際產(chǎn)品中3位側(cè)鏈多具有易解離的基團(tuán)，如頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢硫脒等。根據(jù)目前對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素聚合反應(yīng)的認(rèn)知[4,12]，母核羧基作為活性基團(tuán)與另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)或3位側(cè)鏈的反應(yīng)是最可能的聚合反應(yīng)途徑；與β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng)通?？尚纬梢粚?duì)差向異構(gòu)體，而與3位側(cè)鏈的反應(yīng)通常形成單一的聚合物(圖4)；由于該類(lèi)頭孢菌素的3位側(cè)鏈易被水解，因而與β-內(nèi)酰胺環(huán)反應(yīng)形成的二聚體可能存在三種3位側(cè)鏈水解物(按文獻(xiàn)[5]可分別命名為水解物I、水解物Ⅱ和水解物Ⅳ)，而與3位側(cè)鏈反應(yīng)形成的二聚體僅能產(chǎn)生一種水解物。

比較該類(lèi)頭孢菌素質(zhì)譜裂解途徑(圖5)與圖2A的差異：雖然它們均可發(fā)生β-內(nèi)酰胺環(huán)的A裂解反應(yīng)，但A2碎片的豐度在不同化合物中的差異較大，R3為甲氧基取代時(shí)A2離子豐度最弱；當(dāng)其失去3位側(cè)鏈后，不再發(fā)生經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺環(huán)B裂解反應(yīng)，且A裂反應(yīng)主要產(chǎn)生A3碎片，A1離子豐度較弱， R3為甲氧基取代時(shí)沒(méi)有A1離子[13-14]。

文獻(xiàn)[8]報(bào)道了2個(gè)頭孢唑林二聚體(分子量均為794 Da，分別稱之為聚合物1和聚合物2)；根據(jù)頭孢菌素的聚合反應(yīng)機(jī)理推測(cè)分子量為794 Da的頭孢唑林二聚體可能有5種結(jié)構(gòu)(圖6A)。結(jié)構(gòu)C由于不含β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜分析中被首先排除。利用上述質(zhì)譜裂解規(guī)律分析頭孢唑林聚合物1：其二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)β-內(nèi)酰胺環(huán)的A2特征裂解碎片(m/z628)，同時(shí)存在m/z455和m/z473的頭孢唑林碎片和頭孢唑林開(kāi)環(huán)物特征碎片，故其可能為結(jié)構(gòu)A或D(圖6B)；但根據(jù)質(zhì)譜裂解途徑分析無(wú)法判斷其究竟是何種結(jié)構(gòu)[8]。利用結(jié)構(gòu)已知的頭孢唑林二聚體對(duì)照品(結(jié)構(gòu)D)(廣州牌牌生物科技有限公司)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)照品保留時(shí)間與二聚體1相同，即證明頭孢唑林二聚體1為結(jié)構(gòu)D(未發(fā)表資料)。

文獻(xiàn)[8]未能推測(cè)出聚合物2的可能結(jié)構(gòu)。由于聚合物2 的質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺環(huán)A3特征離子(m/z635)(圖6B)，故推測(cè)其可能結(jié)構(gòu)為B或E(具有可解離的3位側(cè)鏈)。由于質(zhì)譜圖中未出現(xiàn)特征的頭孢唑林碎片(m/z455)，但出現(xiàn)了m/z473的特征碎片(與頭孢唑林開(kāi)環(huán)物特征碎片相同)，因此，對(duì)m/z473特征離子的解析成為關(guān)鍵。如果頭孢唑林二聚體在3位側(cè)鏈斷裂前發(fā)生經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺環(huán)B裂解反應(yīng)，則能形成m/z473的特征離子(圖6C)；據(jù)此，可推測(cè)出聚合物2的質(zhì)譜裂解途徑(圖6D)。同樣，僅根據(jù)質(zhì)譜裂解途徑分析無(wú)法判斷聚合物2究竟是結(jié)構(gòu)B或E。由于文獻(xiàn)[8]中未發(fā)現(xiàn)聚合物2具有同分異構(gòu)體(提示不存在差向異構(gòu)體)，且通過(guò)對(duì)頭孢唑林、聚合物1和聚合物2的UV光譜比較，認(rèn)為二聚體2母核的共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化(二聚體2通過(guò)酯鍵對(duì)具有完整結(jié)構(gòu)的頭孢唑林母核的共軛結(jié)構(gòu)影響較大)，因此認(rèn)為聚合物2更可能為結(jié)構(gòu)E(最終應(yīng)通過(guò)雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn))。

文獻(xiàn)[9]采用HPSEC-柱切換-LC-MS技術(shù)分析注射用頭孢硫脒中的聚合物，發(fā)現(xiàn)實(shí)際樣品中存在分子量為884的二聚體(圖7D)，推測(cè)其可能為羧基與3位側(cè)鏈的聚合產(chǎn)物(圖7A)；雖然羧基與的β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng)也可能形成分子量為884的二聚體(圖7B)，但質(zhì)譜裂解途徑分析不支持該結(jié)構(gòu)(無(wú)法解釋m/z473的頭孢硫脒特征離子碎片)(圖7C)，因而支持文獻(xiàn)推測(cè)的結(jié)構(gòu)的正確性。

文獻(xiàn)[10]采用二維RPLC-QTOFMS技術(shù)在頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉樣品，發(fā)現(xiàn)4個(gè)頭孢哌酮二聚體雜質(zhì)峰：雜質(zhì)峰6與峰7的質(zhì)譜信息相似(MS1均為m/z1175.2797，分子式為C48H50N14O16S3)，雜質(zhì)峰8與峰9的質(zhì)譜信息相似(MS1均為m/z1291.2926，分子式為C50H54N18O16S4)，提示互為差向異構(gòu)體。但作者推測(cè)它們?yōu)閭?cè)鏈仲氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合產(chǎn)物(圖8A)。然而，該反應(yīng)機(jī)理在以往的研究中從未被證實(shí)，根據(jù)目前對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素聚合反應(yīng)的認(rèn)知[4,14]，母核的羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合可以產(chǎn)生一對(duì)二聚體差向異構(gòu)體(MW1290，分子式為C50H54N18O16S4)(圖8B)，且對(duì)其質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行分析可以較好地解釋峰8/峰9質(zhì)譜圖中的主要碎片離子，故認(rèn)為峰8/峰9更可能為圖8B的結(jié)構(gòu)。圖8B的二聚體脫去3位側(cè)鏈形成的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)(MW1174，分子式為C48H50N14O16S3)與峰6/峰7的結(jié)構(gòu)信息一致(圖8C)，對(duì)其質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行分析(圖8D)，也可較好地解釋其質(zhì)譜圖中的主要碎片離子(圖8F)；雖然母核的羧基與3位側(cè)鏈的反應(yīng)也可以形成分子量1174的二聚體(圖8D)，但該反應(yīng)不能產(chǎn)生差向異構(gòu)體；因此認(rèn)為峰6/峰7更可能是圖8C的結(jié)構(gòu)。

縱上，目前對(duì)該類(lèi)頭孢菌素聚合物分析的研究較少，雖然認(rèn)為它們可以通過(guò)頭孢菌素母核的羧基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)或3位側(cè)鏈發(fā)生聚合，但何種反應(yīng)為主要的聚合反應(yīng)途徑目前缺乏理論計(jì)算的支持；在實(shí)際分析中，似不同結(jié)構(gòu)的化合物聚合反應(yīng)途徑不完全相同。對(duì)該類(lèi)頭孢菌素實(shí)際產(chǎn)品中的聚合物進(jìn)行分析，通常僅發(fā)現(xiàn)二聚體且含量均較低；在水溶液中進(jìn)行強(qiáng)制聚合，通常不能增加聚合物的含量，而高濕條件下固態(tài)聚合是增加聚合物含量的有效途徑。在利用質(zhì)譜裂解途徑推斷聚合物的結(jié)構(gòu)時(shí)，通過(guò)分析β-內(nèi)酰胺環(huán)的A裂解碎片，可以幫助判斷聚合反應(yīng)位點(diǎn)：如具有完整頭孢菌素結(jié)構(gòu)的聚合物，質(zhì)譜分析中3位側(cè)鏈斷裂易產(chǎn)生A3碎片；而如果出現(xiàn)A2碎片，提示其可能是與3位側(cè)鏈的聚合產(chǎn)物；通過(guò)分析聚合物是否存在差向異構(gòu)體亦可幫助判斷聚合反應(yīng)位點(diǎn)。當(dāng)質(zhì)譜裂解途徑分析不能推斷出聚合物的最可能結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)通過(guò)聚合物對(duì)照品進(jìn)行確認(rèn)。

3 其他結(jié)構(gòu)的頭孢菌素

頭孢西丁鈉、頭孢呋辛鈉等結(jié)構(gòu)中存在氨甲酰結(jié)構(gòu)的頭孢菌素，理論上它們應(yīng)當(dāng)與其他頭孢菌素具有相似的聚合反應(yīng)途徑，但采用柱切換-LC/MS技術(shù)分析頭孢西丁鈉強(qiáng)制聚合溶液中的聚合物時(shí)，雖然發(fā)現(xiàn)其中存在多個(gè)聚合物雜質(zhì)(圖9)，但均無(wú)法依據(jù)頭孢菌素的已知聚合反應(yīng)途徑(母核羧基的反應(yīng)或3位側(cè)鏈中氨甲酰結(jié)構(gòu)中氨基的反應(yīng))推測(cè)出可能結(jié)構(gòu)，且在實(shí)際產(chǎn)品中也未檢測(cè)到聚合物雜質(zhì)[11]。對(duì)頭孢呋辛鈉水溶液降解雜質(zhì)的分析顯示，其3位側(cè)鏈水解可形成去氨甲酰頭孢呋辛，去氨甲酰頭孢呋辛3位側(cè)鏈的羥基可以被氨基取代，進(jìn)一步形成3位具有伯氨基結(jié)構(gòu)的降解物[15]，在對(duì)頭孢西丁鈉雜質(zhì)譜的分析中亦發(fā)現(xiàn)相似的降解物[16]。由于伯氨基在頭孢菌素的聚合反應(yīng)中是最重要的聚合反應(yīng)位點(diǎn)[4-5,12]，使得該類(lèi)頭孢菌素的聚合反應(yīng)變得更加復(fù)雜。文獻(xiàn)[11]強(qiáng)制聚合反應(yīng)介質(zhì)為水溶液，因而其觀測(cè)到聚合物雜質(zhì)更可能與頭孢西丁降解物參與的聚合反應(yīng)有關(guān)。對(duì)該類(lèi)頭孢菌素聚合物解析需要進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

7位側(cè)鏈含有伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素，側(cè)鏈氨基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)是主要的聚合反應(yīng)途徑；該類(lèi)頭孢菌素在水溶液中強(qiáng)制聚合，通常僅能形成二聚體，在非水溶液中聚合可以形成多聚體；推測(cè)該類(lèi)頭孢菌素的聚合物結(jié)構(gòu)：首先根據(jù)反應(yīng)機(jī)理推測(cè)可能的結(jié)構(gòu)，再利用質(zhì)譜裂解規(guī)律對(duì)所推測(cè)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，必要時(shí)通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行再確證。

7位側(cè)鏈不含伯氨基結(jié)構(gòu)的頭孢菌素主要通過(guò)母核羧基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)或3位側(cè)鏈進(jìn)行聚合，二者的區(qū)別在于前者可形成一對(duì)差向異構(gòu)體；對(duì)該類(lèi)頭孢菌素進(jìn)行強(qiáng)制聚合時(shí)宜采用高濕環(huán)境固態(tài)聚合的方法，在水溶液中通常不易形成聚合物。不同品種究竟易通過(guò)何種聚合反應(yīng)途徑進(jìn)行聚合目前沒(méi)有較明確的結(jié)論；利用質(zhì)譜裂解規(guī)律有時(shí)無(wú)法判斷聚合物的具體聚合位點(diǎn)，因而采用反合成方法獲得聚合物對(duì)照品是確證該類(lèi)頭孢菌素聚合物結(jié)構(gòu)的理想方法。由于該類(lèi)頭孢菌素的3位側(cè)鏈易水解，由羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)形成的聚合物理論上可形成3種側(cè)鏈水解物，羧基與3位側(cè)鏈環(huán)形成的聚合物僅能形成1種水解物，利用該特性通過(guò)對(duì)聚合物水解物的發(fā)現(xiàn)也可以幫助判斷二類(lèi)聚合物。

對(duì)部分頭孢菌素如頭孢西丁鈉等，按目前已知的聚合反應(yīng)機(jī)理尚不能完全解釋其聚合反應(yīng)途徑，但該類(lèi)頭孢菌素實(shí)際樣品中的聚合物含量均較低，提示相對(duì)于其他頭孢菌素，它們不易發(fā)生聚合反應(yīng)。