磷酸酶和張力蛋白同源物在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)及與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系

丁錦榮，管義祥，劉小江

南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226600

顱腦損傷是臨床中發(fā)病率較高的創(chuàng)傷類型，病死率居所有創(chuàng)傷首位[1]。據(jù)相關(guān)研究報道[2]，我國每年約60萬例顱腦損傷發(fā)生，病死率65%～80%。神經(jīng)功能恢復(fù)與創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的預(yù)后有關(guān)，腦部神經(jīng)功能恢復(fù)越差，預(yù)后也越差[3-4]。目前臨床中尚缺乏對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)狀況進行預(yù)測的特異性標(biāo)志物?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)研究報道[5]，磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologues，PTEN)在間充質(zhì)干細(xì)胞外分泌體中的表達(dá)與海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力有關(guān)，可通過調(diào)控多種細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)促進細(xì)胞凋亡，推測PTEN在外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表達(dá)可能參與腦損傷的病理過程。目前PTEN在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達(dá)及與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系尚不清楚。本研究前瞻性研究2019年6月—2021年5月筆者醫(yī)院收治的創(chuàng)傷性顱腦損傷患者臨床資料，探討PTEN在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達(dá)及與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系。

資料與方法

1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)經(jīng)影像學(xué)檢查確診為顱腦損傷[6]；(3)格拉斯哥昏迷評分(Glasgow coma score，GCS)3～11分；(4)受傷至入院治療時間<12h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦疝或惡性腫瘤；(2)免疫系統(tǒng)或代謝功能障礙；(3)合并其他部位損傷；(4)心、肝、腎、免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病；(5)合并血液系統(tǒng)疾病或凝血功能障礙；(6)既往腦創(chuàng)傷史；(7)精神疾病。

本組創(chuàng)傷性顱腦損傷患者(82例)、健康志愿者(75例)，分別記為腦傷組和健康對照組。腦傷組男性54例，女性28例；年齡31～64歲，平均53.1歲。健康對照組男性42例，女性33例；年齡32～68歲，平均55.5歲。本研究患者及家屬均簽署知情同意書，獲筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(JCZ21028)。

2 PBMC分離及PTEN mRNA表達(dá)檢測方法

采集所有研究對象外周血10mL(創(chuàng)傷性顱腦損傷患者于入院后治療前、健康者于體檢當(dāng)天)，使用PBMC分離液分離PBMC(北京康瑞納生物科技有限公司)，用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。提取PBMC總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計PTEN和內(nèi)參基因β-actin上下游引物，PTEN上游引物：5’-GGGCTAGTTTGCAAAGTTT-3’，下游引物：5’-ACATTTCGCTAGCCTGAAAT-3’，產(chǎn)物長度125 bp；β-actin上游引物：5’-ATTGCATTTGCATTCTGAC-3’，下游引物：5’-GCCATGGTGAGCGTATTAC-3’，產(chǎn)物長度118 bp；引物序列、大小均由上海生工生物公司合成。按反應(yīng)條件進行擴增：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；72℃，30s；40個循環(huán)。根據(jù)2-△△Ct計算PTEN mRNA相對表達(dá)量。

3 治療方法

依據(jù)《顱腦創(chuàng)傷和腦科危重癥治療學(xué)》[7]，給予創(chuàng)傷性顱腦損傷患者降低顱內(nèi)壓、營養(yǎng)支持及通氣等規(guī)范治療。

4 資料收集

收集可能影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)的相關(guān)因素，主要包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、受傷至入院治療時間、住院時間、吸煙史、飲酒史、是否為開放性損傷、是否合并糖尿病、高血壓、高血脂癥、是否進行手術(shù)、致傷原因、顱腦損傷嚴(yán)重程度、合并疾病數(shù)量、GCS[8]、昏迷時間及PTEN mRNA。

5 觀察指標(biāo)

(1)比較兩組研究對象臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達(dá)；(2)治療1個月后統(tǒng)計創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況，采用改良Rankin量表(modified rankin scale，mRS)[9]對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況進行評定，并分為恢復(fù)良好組(mRS評分0～2分)和恢復(fù)不良組(mRS評分3～6分)；(3)比較恢復(fù)良好組和恢復(fù)不良組患者的臨床資料；(4)Logistic回歸分析影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)的危險因素；(5)分析PTEN mRNA對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)不良的預(yù)測效能。

6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1 兩組研究對象臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達(dá)比較

兩組研究對象性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腦傷組PTEN mRNA高于健康對照組(P<0.05)。見表1。

2 創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況

本組82例創(chuàng)傷性顱腦損傷患者，21例患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良，神經(jīng)功能恢復(fù)不良發(fā)生率25.61%。

3 恢復(fù)良好組和恢復(fù)不良組患者臨床資料比較

恢復(fù)不良組住院時間、開放性損傷占比、進行手術(shù)占比、重度顱腦損傷占比、昏迷時間及PTEN mRNA均多于恢復(fù)良好組(P<0.05)，GCS則低于恢復(fù)良好組(P<0.05)。見表2。

4 影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)的危險因素

以住院時間、GCS、昏迷時間、PTEN mRNA(均為連續(xù)變量)、開放性損傷(否=0，是=1)、進行手術(shù)(否=0，是=1)、顱腦損傷嚴(yán)重程度(重度=0，輕中度=1)為自變量，創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況為因變量，恢復(fù)不良=1，恢復(fù)良好=0，進行Logistic回歸分析，多因素分析結(jié)果顯示，重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)的危險因素(OR=2.852、3.374、4.011，P<0.05)。見表3。

5 PTEN mRNA對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良的預(yù)測效能

ROC曲線分析顯示，PTEN mRNA對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良預(yù)測的最佳截斷點1.72，靈敏度71.43%，特異度80.33%，AUC值0.784。見圖1。

表1 兩組患者臨床資料及PTEN mRNA在PBMC中的表達(dá)比較

表2 恢復(fù)良好組和恢復(fù)不良組患者臨床資料比較

表3 影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)的多因素Logistic回歸分析

ROC：受試者工作特征

討 論

顱腦損傷指頭部由于遭受外界劇烈、嚴(yán)重傷害所導(dǎo)致的腦挫裂傷、顱內(nèi)水腫等，近年來隨著交通事故的頻發(fā)，創(chuàng)傷性顱腦損傷的發(fā)生率呈逐年升高趨勢[10-11]。顱腦損傷具有并發(fā)癥多、致殘病死率高等特點，嚴(yán)重影響了患者預(yù)后。據(jù)相關(guān)研究表明[12]，顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)與預(yù)后密切相關(guān)。目前臨床中尚缺乏對顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)進行有效評估預(yù)測的高特異性標(biāo)志物，探討PTEN在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達(dá)及與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系具有十分重要的臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，腦傷組PTEN mRNA高于健康對照組，提示相比健康者，創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PTEN mRNA異常偏高。PTEN為具有蛋白性和脂性雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。既往研究表明[13-14]，PTEN參與多種細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，其可通過磷酸化調(diào)控與受體結(jié)合，形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，與神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷防護、再生中具有重要作用。本研究中創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良發(fā)生率25.61%，提示創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良發(fā)生率較高，本研究結(jié)果與朱輝和周樹生[15]研究結(jié)果相近。本研究結(jié)果表明，恢復(fù)不良組住院時間、手術(shù)治療占比、開放性損傷占比、重度顱腦損傷占比、昏迷時間及PTEN mRNA均多于恢復(fù)良好組，GCS則低于恢復(fù)良好組。經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)的危險因素，提示重度顱腦損傷、GCS及PTEN mRNA均為影響創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)的危險因素，臨床中需逐一控制各項因素對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的影響，以降低神經(jīng)功能恢復(fù)不良的發(fā)生率。重度顱腦損傷、GCS均與創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的病情直接相關(guān)，可直接影響患者神經(jīng)功能的恢復(fù)[16-17]。PTEN所編碼的蛋白質(zhì)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化能力有關(guān)，據(jù)相關(guān)研究報道[18]，PTEN可通過調(diào)控相關(guān)通路活性影響mTOR等下游關(guān)鍵分子的表達(dá)，近而抑制神經(jīng)元再生，并可阻礙神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)。ROC曲線分析顯示，PTEN mRNA對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者的神經(jīng)功能恢復(fù)不良預(yù)測的最佳截斷點1.72，靈敏度71.43%，特異度80.33%，AUC值0.784，提示PTEN mRNA可作為預(yù)測創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良的重要參考指標(biāo)。本研究創(chuàng)新之處在于有針對性的對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PTEN在PBMC中的表達(dá)進行分析，并探討PTEN與神經(jīng)功能恢復(fù)的相關(guān)性，以期通過PTEN表達(dá)情況對該類患者神經(jīng)功能恢復(fù)狀況進行評估。

綜上所述，PTEN在創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PBMC中的表達(dá)與神經(jīng)功能的恢復(fù)存在一定的相關(guān)性，PTEN mRNA可作為預(yù)測創(chuàng)傷性顱腦損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)不良的重要參考指標(biāo)，建議在臨床中對創(chuàng)傷性顱腦損傷患者PBMC中PTEN mRNA的表達(dá)進行監(jiān)測，以降低神經(jīng)功能恢復(fù)不良的發(fā)生率。

作者貢獻聲明：丁錦榮：論文修改及審校、資料搜集、論文撰寫；管義祥：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持、病例隨訪、數(shù)據(jù)整理；劉小江：資料收集、論文撰寫、文獻檢索、病例資料整理及統(tǒng)計學(xué)分析/研究(內(nèi)容)設(shè)計