5種薔薇科果樹(shù)對(duì)梨火疫病的抗性*

段紅雁，李紫英，王 蘭，李競(jìng)雄，陳 偉

（塔里木大學(xué)，南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，南疆特色果樹(shù)高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

新疆獨(dú)特的豐富光熱資源使其特色林果產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，截至2017 年，新疆林果總面積達(dá)到123.7萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量748.0 萬(wàn)t，年產(chǎn)值457.0 億元，林果業(yè)已成為農(nóng)民脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。但隨著林果產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和“一帶一路”建設(shè)的深入推進(jìn)，林果品種的引進(jìn)和種苗等繁殖材料的調(diào)運(yùn)頻繁，水果貿(mào)易日益增加，梨火疫病等有害生物傳播的風(fēng)險(xiǎn)性隨著繁殖材料、水果入境數(shù)量的增加而提高，成為林果產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)的重大隱患[2]。近年來(lái)，在蘋(píng)果（Malus pumila）、海棠（Malus spectabilis）、新疆梨（Pyrus sinkiangensis）、杜梨（Pyrus betulaefolia）和山楂（Crataegus pinnatifida）上發(fā)現(xiàn)了一種新病害，引起花腐、枝干枯死，甚至整樹(shù)死亡，極大影響了庫(kù)爾勒香梨和蘋(píng)果等產(chǎn)業(yè)發(fā)展，尤其是對(duì)南疆的庫(kù)爾勒香梨產(chǎn)業(yè)造成了近乎毀滅性的打擊[3]。經(jīng)鑒定，該病害是為解淀粉歐文氏菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病。該病害于1780 年首次在美國(guó)紐約州報(bào)道，然后傳播到世界其他國(guó)家和地區(qū)。梨火疫病菌寄主范圍廣，可以危害40 余屬的220 多種薔薇科植物，其中最感病的是梨、蘋(píng)果、山楂、海棠等果樹(shù)，引起花序枯死、枯枝、果實(shí)腐爛和整株死亡[4]。目前，梨火疫病已對(duì)美國(guó)、加拿大和新西蘭等多國(guó)的梨、蘋(píng)果造成了毀滅性的打擊，對(duì)林果產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[5]。

2016 年5 月，梨火疫病在新疆伊犁州首次報(bào)道發(fā)生，2020 年被中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入《一類(lèi)農(nóng)作物病蟲(chóng)害名錄》[6]，現(xiàn)已傳至甘肅省的張掖和武威地區(qū)，對(duì)新疆乃至全國(guó)林果產(chǎn)生了巨大威脅[7]。圍繞梨火疫病，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量研究，但該病害防治難度大，至今無(wú)特效藥劑和防治方法，依然是梨、蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)關(guān)注的主要問(wèn)題。目前仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，雖然有一定防效，但易造成農(nóng)藥殘留，危害人體健康，造成環(huán)境污染[7]。梨火疫病是梨和蘋(píng)果及其他薔薇科植物的一種毀滅性細(xì)菌病害[8]，利用抗病品種防治是最經(jīng)濟(jì)和最有效的方法，但國(guó)外資料表明，評(píng)估品種對(duì)梨火疫病的抗性是比較困難的，目前關(guān)于新疆特色果樹(shù)庫(kù)爾勒香梨、紅富士蘋(píng)果及其他薔薇科植物對(duì)該病害的抗性報(bào)道很少。為明確新疆栽培的梨和蘋(píng)果及其他薔薇科果樹(shù)對(duì)該病害的抗病性，保證新疆特色果樹(shù)庫(kù)爾勒香梨、紅富士蘋(píng)果等產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，本研究以蘋(píng)果、庫(kù)爾勒香梨、杜梨、海棠、山楂等5種薔薇科果樹(shù)為供試材料，測(cè)定其對(duì)梨火疫病菌的抗性表現(xiàn)，以期為該病害的預(yù)防和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

梨火疫病菌Erwinia amylovora由塔里木大學(xué)綠色防控實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)材料

從健康紅富士蘋(píng)果（Malus pumila）樹(shù)、八棱海棠（M.micromalus）樹(shù)、庫(kù)爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis）樹(shù)、杜梨（Pyrus betulaefolia）樹(shù)、黃果山楂（Crataegus pinnatifida）樹(shù)采集新梢，基部用浸水的無(wú)菌脫脂棉包裹，再用保鮮膜包扎保濕。5月采集各種果樹(shù)相同大小的幼果，幼果采集時(shí)帶果柄，不破壞表面蠟質(zhì)層。采集材料盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌活化，制備接種液

將供試菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）上，28.5 ℃培養(yǎng)36 h 活化。挑取單菌落于NA 培養(yǎng)液中，28.5 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，將OD600值為1.2左右的菌液作為接種液。

1.3.2 離體枝條接種

枝條離體接種參考張樂(lè)等[10]和李穎章等[11]的方法并部分修改。枝條截成30 cm 左右的莖段，用75%酒精消毒后，插入裝有無(wú)菌水的三角瓶中。用滅菌手術(shù)刀在枝條生長(zhǎng)點(diǎn)切1 個(gè)約5 mm 長(zhǎng)的傷口，取1小塊（約2 cm×2 cm）滅菌的脫脂棉，蘸取2 mL的菌液后貼在傷口部位，再用保鮮膜包裹。每個(gè)品種接種16 根枝條，對(duì)照用無(wú)菌水代替菌液。接種后放置于溫度28.5 ℃、空氣相對(duì)濕度75%、光照12 h 的人工氣候箱中培養(yǎng)。枝條接種3 d 后開(kāi)始觀察初始病斑出現(xiàn)的時(shí)間，接種7 d 后記錄發(fā)病枝條數(shù)，測(cè)定病斑長(zhǎng)度、病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的比率及發(fā)病級(jí)別。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

參考Paprstein 等[12]的方法并改進(jìn)，制定梨火疫病病原菌接種離體枝條的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，枝條無(wú)病斑；1 級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的1%～5%；3 級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的6%～15%；5 級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的16%～30%；7 級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的31%～50%；9 級(jí)，枝條病斑長(zhǎng)度占接種枝條長(zhǎng)度的50%以上。依據(jù)離體枝條接種后相同時(shí)間的病情指數(shù)劃分病原菌的致病力。

1.3.3 幼果接種

幼果先用75%乙醇浸泡10 min，待乙醇揮發(fā)后，用滅菌的解剖刀橫切為二（果實(shí)較小的可不切），用滅菌竹簽蘸取菌落點(diǎn)接在果肉上，根據(jù)幼果的大小每個(gè)切面上選取4 個(gè)接種點(diǎn)，以接種無(wú)菌水為對(duì)照[13]。每個(gè)品種接種3 個(gè)果實(shí)，接種后的果實(shí)放入滅菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于鋪吸水紙保濕的盤(pán)中，覆蓋保鮮膜，置于溫度28.5 ℃、空氣相對(duì)濕度75%的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)。幼果接種后連續(xù)7 d 觀察發(fā)病情況，記載初始菌膿出現(xiàn)的時(shí)間、菌膿面積占幼果面積的比值，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)，分析菌株致病力。

1.3.4 抗性表現(xiàn)與癥狀

參考張樂(lè)等[10]的枝條抗性劃分方法，將枝條變褐發(fā)黑，葉片幾乎全部焦枯、大部分脫落，果實(shí)接種點(diǎn)產(chǎn)生明顯菌溢、發(fā)生腐爛，初步定為低抗類(lèi)型。果實(shí)接種點(diǎn)無(wú)細(xì)菌菌溢形成，不發(fā)生腐爛或僅在接種點(diǎn)發(fā)生褐變的初步定為中抗類(lèi)型。枝條接種點(diǎn)無(wú)明顯變褐色，葉片枝條僅干枯且保持綠色初步定為高抗類(lèi)型。綜合枝條及果實(shí)的抗性表現(xiàn)類(lèi)型，可判斷5種薔薇科植物不同種的抗病性強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種薔薇科果樹(shù)離體枝條接種梨火疫病菌后的抗性表現(xiàn)

5種薔薇科果樹(shù)離體枝條接種后表現(xiàn)癥狀的時(shí)間和發(fā)病輕重不同。庫(kù)爾勒香梨、杜梨接種3 d 后即可觀察到枝條和葉片輕微發(fā)黑；接種5 d 后，枝條開(kāi)始變黑壞死，葉片焦枯、落葉，接種口附近有潰瘍斑產(chǎn)生；接種7 d 后，枝條變褐發(fā)黑，葉片幾乎全部焦枯、大部分葉片脫落。紅富士蘋(píng)果和黃果山楂接種4 d 后開(kāi)始發(fā)病，時(shí)間相對(duì)較晚，癥狀較輕；八棱海棠接種后一直未表現(xiàn)發(fā)病癥狀。

接種梨火疫病病菌7 d 后，發(fā)病率最高的是庫(kù)爾勒香梨、杜梨和紅富士蘋(píng)果，均為100%，其次是黃果山楂，為93.75%，八棱海棠枝條沒(méi)有發(fā)病。病情指數(shù)由大到小依次是庫(kù)爾勒香梨＞杜梨＞紅富士蘋(píng)果＞黃果山楂＞八棱海棠。參考張樂(lè)等[10]的枝條抗性劃分方法結(jié)合病情指數(shù)，可將庫(kù)爾勒香梨和杜梨劃分為低抗品種，紅富士蘋(píng)果和黃果山楂為中抗品種，八棱海棠為高抗品種（表1）。

表1 5種薔薇科果樹(shù)枝條接種梨火疫病菌后的發(fā)病情況及抗性評(píng)價(jià)

2.2 5種薔薇科果樹(shù)果實(shí)接種梨火疫病菌后的抗性表現(xiàn)

幼果接種梨火疫病菌48 h 后，感病品種果實(shí)即在接種點(diǎn)及其周?chē)霈F(xiàn)乳白色、有光澤的菌膿，整個(gè)果面開(kāi)始變黑、腐爛。對(duì)照接種點(diǎn)及周邊未見(jiàn)菌膿，果實(shí)剖面大多較干燥。

由表2 可知，5種薔薇科植物幼果對(duì)梨火疫病抗性表現(xiàn)不同。庫(kù)爾勒香梨和杜梨的抗病性最弱，發(fā)病率為100.0%，幼果接種后第2 d 即在果肉上產(chǎn)生大量菌膿，且菌膿面積占幼果表面積的2/3 以上，為低抗品種；其次是紅富士蘋(píng)果和黃果山楂，發(fā)病率分別為90.0%、76.7%，幼果接種4 d 后在果肉上產(chǎn)生中量菌膿，菌膿面積占幼果表面積的1/3～2/3，為中抗品種；八棱海棠的抗病能力最強(qiáng)，發(fā)病率為60.0%，幼果接種5 d 后在果肉上產(chǎn)生少量菌膿，菌膿面積占幼果表面積的1/3 以下，為高抗品種。

表2 5種薔薇科果樹(shù)果實(shí)接種梨火疫病菌后的發(fā)病情況及抗性評(píng)價(jià)

3 討論

庫(kù)爾勒香梨為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，已成為南疆經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)，但近年來(lái)由于一些新病害的發(fā)生，嚴(yán)重抑制了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病害的防控已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。劉華威等[14]采用幼果人工接種鑒定技術(shù)，對(duì)保存的54 份梨種質(zhì)資源進(jìn)行梨火疫病抗性評(píng)價(jià)，表明中國(guó)梨種質(zhì)中可能存在較豐富的抗梨火疫病資源。柴菊華[15]對(duì)11種蘋(píng)果砧木和3種梨砧木進(jìn)行了抗性試驗(yàn)，篩選出了高抗、高感和感病品種。李洪濤等[9]選取國(guó)外3 個(gè)菌株對(duì)國(guó)內(nèi)梨品種（種質(zhì)）進(jìn)行了抗病性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明庫(kù)爾勒香梨為高感品種，杜梨為感病品種。本研究采用離體枝條接種法和果實(shí)針刺法鑒定了5種薔薇科果樹(shù)對(duì)Erwinia amylovora菌株的抗病性，抗性由大到小依次為八棱海棠＞黃果山楂＞紅富士蘋(píng)果＞杜梨＞庫(kù)爾勒香梨，鑒定結(jié)果與前人一致，如何利用抗病資源和分子育種手段提高庫(kù)爾勒香梨抗性，保證庫(kù)爾勒香梨產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展是未來(lái)研究方向。

幼果對(duì)Erwinia amylovora菌株最為敏感，幼果接種是鑒定E.amylovora致病性的常用方法。5種薔薇科植物幼果對(duì)E.amylovora菌株均有抗病性，其中杜梨、庫(kù)爾勒香梨幼果的抗病性最差，幼果接種2～3 d 后即可在果肉上產(chǎn)生大量菌膿，菌膿面積占幼果表面積的2/3 以上。這一結(jié)果與李洪濤等[9]、胡白石[8]研究的結(jié)果一致。其次是紅富士蘋(píng)果和黃果山楂，幼果接種4～5 d 后在果肉上產(chǎn)生中量菌膿，菌膿面積占幼果表面積的1/3～2/3。八棱海棠的幼果抗病性相對(duì)較強(qiáng)，幼果接種4～6 d 后果肉上產(chǎn)生少量菌膿，菌膿面積占幼果表面積的1/3 以下。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，5種薔薇科果樹(shù)在枝條和果實(shí)的抗性表現(xiàn)一致，最好的是海棠，為高抗品種；其次為山楂和蘋(píng)果，為中抗品種；最差的是杜梨和庫(kù)爾勒香梨，為低抗品種。不同種薔薇科植物在離體枝條與幼果上對(duì)E.amylovora菌株的抗病性鑒定，對(duì)今后深入揭示薔薇科植物抗病分子機(jī)制有重要意義。