滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)脾陰虛證模型大鼠胃腸激素及胃腸免疫功能的影響*

周雯，戰(zhàn)麗彬，李媛

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心，遼寧 沈陽 110847

脾為倉(cāng)廩之官，后天之本，其主要生理功能是運(yùn)化水谷精微，化生氣血以榮養(yǎng)五臟六腑、四肢百骸。脾陰具有灌溉臟腑、補(bǔ)益腦髓、營(yíng)養(yǎng)肌肉、濡潤(rùn)筋骨的作用[1-2]。脾陰虛是指脾陰不足，臟腑失其濡養(yǎng)所表現(xiàn)的證候。隨著對(duì)脾陰虛證研究的不斷深入，很多學(xué)者認(rèn)為，其與胃腸激素及胃腸免疫功能的病理改變密切相關(guān)[3-5]。血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是機(jī)體內(nèi)的一種胃腸道激素，分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)是腸腔中的一類抗體，其含量反映免疫功能。本研究通過觀察脾陰虛證大鼠血清VIP、胃sIgA含量及空腸VIP表達(dá)情況，探討滋補(bǔ)脾陰方藥對(duì)胃腸激素及胃腸免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物中心，溫度(22±3) ℃，濕度50%，明暗交替12 h。

1.2 藥材及試劑滋補(bǔ)脾陰方藥(由紅參30 g，山藥15 g，茯苓15 g，白芍15 g，蓮子20 g，白扁豆15 g，遠(yuǎn)志10 g，石菖蒲10 g，丹參12 g，檀香4.5 g，橘紅 9 g，炙甘草9 g組成，來源于大連市美羅醫(yī)藥公司)；傷陰藥(由制附子、肉桂、吳茱萸組成，來源于南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂)；VIP ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ml154710)；sIgA ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ml003136)；VIP免疫組化試劑盒[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：ab78536]；2%戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：P8410)。

1.3 儀器酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)；洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems公司)；全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.4 動(dòng)物分組、建模與給藥18只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、滋補(bǔ)脾陰方藥組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由飲水進(jìn)食。采用復(fù)合因素方法(即飲食不節(jié)、勞倦過度與耗傷陰液聯(lián)合應(yīng)用)建立脾陰虛證模型[6-7]。脾氣虛證模型階段：大鼠飽食1 d，禁食2 d，1個(gè)循環(huán)為3 d，在這期間大鼠能夠自由飲水，但每日大鼠游泳至力竭，連續(xù) 14 d，游泳水溫為22 ℃。脾陰虛證模型階段：第15天，脾氣虛證建立成功的模型每日灌胃?jìng)幩?10 g·kg-1)，正常對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。滋補(bǔ)脾陰方藥治療階段：第25天至第38天，造模大鼠被分為模型組和滋補(bǔ)脾陰方藥組，其中滋補(bǔ)脾陰方藥組灌胃滋補(bǔ)脾陰方藥，濃度為34.6 g·kg-1·d-1，其余各組給予同體積生理鹽水灌胃。

1.5 評(píng)估模型參考《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[8]及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[9]評(píng)定脾氣虛證模型：①食少；②消瘦；③神疲乏力；④毛色無光澤，便軟或溏。脾陰虛證模型標(biāo)準(zhǔn)：①體質(zhì)量下降；②易激惹；③肛溫升高；④糞便呈干燥狀態(tài)；⑤背毛無光澤；⑥進(jìn)食量時(shí)增時(shí)減；⑦飲水量增多。

1.6 標(biāo)本采集與處理末次給藥后，采用2%戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，留取大鼠的胃、空腸組織。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)

1.7.1 檢測(cè)大鼠血清VIP和胃sIgA水平每組6只大鼠，按照試劑盒說明書對(duì)樣品濃度進(jìn)行檢測(cè)：將10 μL樣本加入樣品孔，后添加稀釋液40 μL，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL加入標(biāo)準(zhǔn)品孔中；每孔加入100 μL辣根酶標(biāo)記抗體，37 ℃孵育60 min；洗板5次，吸水紙拍干。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃ 避光孵育15 min，終止液50 μL，450 nm處測(cè)定各孔吸光值。

1.7.2 免疫組化法檢測(cè)空腸VIP表達(dá)每組隨機(jī)選擇3只大鼠的空腸標(biāo)本經(jīng)40 ng·L-1多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，采用免疫組化法檢測(cè)大鼠空腸VIP表達(dá)水平。步驟如下：①石蠟切片常規(guī)脫蠟；②PBS洗2次，每次 5 min；③抗原修復(fù)；④用PBS或蒸餾水配置3%H2O2室溫封閉 10 min；⑤PBS洗1次，5 min；⑥5%牛奶封閉，室溫10 min；⑦加一抗4 ℃過夜；⑧重復(fù)步驟②；⑨加生物素化二抗，37 ℃孵育30 min；⑩重復(fù)步驟②；辣根酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素溶液，37 ℃孵育20 min；重復(fù)步驟②；DAB顯色3～10 min；染色終止，蘇木素復(fù)染；脫水，透明，封片，鏡檢。免疫組化染色的結(jié)果判定：細(xì)胞漿或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。在400倍視野范圍用圖像分析軟件測(cè)定棕黃色顆粒的平均光密度值，值越大反映空腸VIP蛋白表達(dá)水平越高。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠表觀指標(biāo)比較正常對(duì)照組大鼠行動(dòng)迅速，反應(yīng)敏捷，體格健壯，大便正常，被毛緊密有光澤；模型組大鼠體質(zhì)量下降，易激惹，肛溫升高，糞便呈干燥狀態(tài)，背毛無光澤，符合脾陰虛證模型評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，肛溫顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠肛溫顯著降低(P<0.05)，體質(zhì)量無明顯變化(P>0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠血清VIP、胃sIgA含量比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清VIP含量顯著升高(P<0.05)，胃sIgA含量顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠血清VIP含量顯著降低(P<0.001)，胃sIgA含量顯著升高(P<0.001)，見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肛溫比較

表2 各組大鼠血清VIP、胃sIgA含量比較

2.3 各組大鼠空腸VIP含量比較正常對(duì)照組大鼠空腸組織肌間叢與黏膜下可見散在的VIP棕黃色神經(jīng)元和神經(jīng)纖維，分布較稀疏，數(shù)量較少，色較淡，呈陰性或弱陽性結(jié)果；模型組大鼠空腸組織肌間叢與黏膜下則可見VIP陽性神經(jīng)元，神經(jīng)纖維明顯增多，染色普遍較深，呈陽性或強(qiáng)陽性結(jié)果；滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠空腸染色較脾陰虛組淡，數(shù)量較少，呈弱陽性反應(yīng)，見圖1。

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠VIP蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組空腸組織VIP蛋白表達(dá)顯著減弱(P<0.01)，見表3。

注：A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：滋補(bǔ)脾陰方藥組圖1 各組大鼠空腸VIP陽性表達(dá)情況(免疫組化，×400)

表3 各組大鼠空腸組織VIP表達(dá)比較

3 討論

脾五行屬土，主運(yùn)化。《素問·靈蘭秘典論》言：“脾胃者，倉(cāng)廩之官，五味出焉。”《脾胃論》記載：“脾稟氣于胃而灌溉四旁，營(yíng)養(yǎng)氣血者也?！逼⒌纳砉δ軙?huì)直接影響機(jī)體防御疾病的能力，因而有“脾主為衛(wèi)，脾虛則百病內(nèi)生”的說法[10]。研究發(fā)現(xiàn)，脾虛、脾氣虛、脾陽虛等證型研究較多，而脾陰虛證研究較少。脾陰虛證是脾虛證的重要證型，也是臨床常見慢性疾病如消渴、泄瀉、便秘等的主要證型[11-13]，脾陰虛證的主要病機(jī)是營(yíng)血津虧、運(yùn)化失職、濡養(yǎng)無權(quán)，其主要癥狀為食少、腹脹、食后尤甚、大便溏薄、面色無華、倦態(tài)乏力、形體消瘦、口干舌燥、手足心熱、舌紅少津、苔少或無、脈細(xì)無力[14]。研究表明，脾陰虛狀態(tài)下機(jī)體免疫功能受損[15-16]。

清代陳修園謂：“脾為太陰，乃三陰之長(zhǎng)。故治陰虛者，當(dāng)以滋脾陰為主，脾陰足，自能灌溉諸臟腑也?！盵17]本課題組戰(zhàn)麗彬教授從“滋補(bǔ)脾陰”立法論治脾陰虛證，認(rèn)為其治療方藥應(yīng)具有補(bǔ)而不燥、滋而不膩、生津化液的特點(diǎn)，因此根據(jù)清·吳澄《不居集》中資成湯化裁而成滋補(bǔ)脾陰方藥，臨床療效顯著。方中以山藥為君，善補(bǔ)脾陰；白扁豆益氣健脾，與山藥配伍可健脾固守中州；紅參補(bǔ)脾生津，安神益智，與扁豆共為臣藥；蓮子合丹參交通心腎，茯苓與蓮子均可調(diào)補(bǔ)脾陰并安神志，檀香、橘紅芳香醒脾，菖蒲合遠(yuǎn)志化痰開竅，白芍養(yǎng)陰和營(yíng)，使以甘草，酸甘化陰，益氣調(diào)藥。全方共奏培補(bǔ)后天、滋補(bǔ)脾陰之效，兼能補(bǔ)氣理氣、活血化瘀、化痰開竅、安神益智。

VIP由神經(jīng)元、內(nèi)分泌和免疫細(xì)胞產(chǎn)生，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等，是胃腸道激素的一種，不僅對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)起抑制性調(diào)節(jié)作用，并且抑制免疫反應(yīng)[18-21]。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，脾虛證VIP水平均升高[22-25]。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠血清中VIP含量明顯降低，空腸組織VIP蛋白表達(dá)減弱。由此推測(cè)，VIP功能紊亂可能是脾陰虛證發(fā)病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，通過抑制VIP促進(jìn)胃腸免疫功能可能是滋補(bǔ)脾陰方藥發(fā)揮作用的途徑之一。

sIgA是在人類和大多數(shù)其他哺乳動(dòng)物腸腔中發(fā)現(xiàn)的最豐富的一類抗體，被認(rèn)為是保護(hù)腸上皮免受腸道毒素和病原體的第一道防線。sIgA支配腸黏膜的體液免疫[26-27]。由于其聚合性質(zhì)和多價(jià)性，sIgA主要通過非共價(jià)交聯(lián)微生物或大分子保護(hù)黏膜表面，從而在空間上阻礙黏附素與上皮細(xì)胞的相互作用以及抑制微生物運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)微生物在黏液中的包埋。sIgA通過蠕動(dòng)或黏液纖毛運(yùn)動(dòng)促進(jìn)被捕獲微生物的清除[28]。研究發(fā)現(xiàn)，sIgA是免疫保護(hù)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，參與維持腸道黏膜的穩(wěn)定性[29]。因此，sIgA可作為揭示胃腸黏膜免疫功能的一個(gè)有效指標(biāo)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脾陰虛證模型大鼠腸道sIgA水平降低，滋補(bǔ)脾陰方藥能夠增加腸道sIgA水平改善腸黏膜免疫屏障的異常狀態(tài)[30]。本研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠比較，滋補(bǔ)脾陰方藥組大鼠胃組織sIgA含量升高。提示脾陰虛時(shí)胃組織和腸組織sIgA含量均降低，胃腸免疫功能降低，而滋補(bǔ)脾陰方藥則能升高sIgA水平，促進(jìn)胃腸免疫功能。

綜上所述，VIP和sIgA的紊亂很可能是脾陰虛證的病理生理改變之一，滋補(bǔ)脾陰方藥可顯著降低脾陰虛證大鼠血清、空腸VIP水平及大鼠胃組織sIgA水平，推測(cè)滋補(bǔ)脾陰方藥治療脾陰虛證的一條重要途徑可能是通過調(diào)節(jié)胃腸激素和胃腸免疫功能實(shí)現(xiàn)的，這為后期科學(xué)闡述滋補(bǔ)脾陰方藥治療脾陰虛證的作用機(jī)制提供了依據(jù)。