Lipin基因表達與宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠肝臟脂肪含量的相關(guān)性研究

卞京 陳平洋 卞讀軍 賀曉日 Alpha Kalonda Mutamba 王濤

（1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院，湖南長沙 410006；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒專科，湖南長沙 410011；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院放射科，湖南長沙 410011）

宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）指胎兒在宮內(nèi)生長勢能偏離導(dǎo)致生長發(fā)育速度低于正常，本質(zhì)上是發(fā)生在孕期的任何生物學(xué)進程偏離正常導(dǎo)致胎兒生長受限［1］。近來的流行病學(xué)研究顯示宮內(nèi)營養(yǎng)不足可以改變組織器官發(fā)育和代謝，孕期低蛋白飲食導(dǎo)致營養(yǎng)不良的胎兒顯示一種“節(jié)儉表型”，青春期出現(xiàn)追趕性生長，成年后易患肥胖癥和2型糖尿病、血脂異常等代謝綜合征［2］。代謝紊亂與糖和脂肪酸代謝有關(guān)，肝臟和脂肪組織是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵部位，這些部位的結(jié)構(gòu)異常會影響脂質(zhì)代謝［3］。IUGR 動物模型顯示程序化的脂肪細胞，例如：內(nèi)在的脂肪生成增強和脂肪細胞增生導(dǎo)致了肥胖的發(fā)生，主要原因是發(fā)育程序化作用，脂肪組織被確定為程序化的主要靶目標之一［4］。脂素基因包括Lipin1、Lipin2、Lipin3，主要功能是發(fā)揮三酰甘油、磷脂合成作用［5］，同時調(diào)節(jié)脂肪酸利用和脂肪合成基因的表達，雙向調(diào)控脂肪代謝［6］。Lipin基因表現(xiàn)出組織特異性表達，Lipin1基因在脂肪組織中高度表達，而Lipin2基因主要在肝臟中表達［7］。

氫質(zhì)子磁共振波譜（1H proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS）脂肪定量分析是最近發(fā)展起來的新型影像學(xué)研究方法，有文獻報道其結(jié)果與病理結(jié)果具有良好的相關(guān)性［8］。目前，雖然肝臟脂質(zhì)評估仍然需要肝臟活檢，但是，活檢是一種侵入性檢查，會帶來潛在的損害。相比之下，1H-MRS 是無創(chuàng)的肝臟代謝生化指標變化及定量分析的方法，具有可重復(fù)性。通過計算水和脂肪對應(yīng)的波譜曲線下面積，可以間接用波譜技術(shù)量化脂肪含量［9］。

IUGR 動物模型的可視化影像學(xué)研究具有無創(chuàng)、直觀、動態(tài)、可重復(fù)性的特點，同時探討與Lipin基因表達的相關(guān)性，從分子影像學(xué)到基因-影像的關(guān)聯(lián)，尤其動態(tài)研究具有重要的臨床前意義。本研究目的是觀察IUGR仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1、肝臟Lipin2的表達與肝臟脂肪含量的動態(tài)變化，探討IUGR仔鼠Lipin基因的表達與肝臟脂肪含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物模型

Sprague-Dawley（SD）孕鼠20只由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗方案已獲得我院實驗動物倫理委員會批準（2020169）。將孕鼠隨機分為對照組和IUGR 組（每組10 只）。對照組孕鼠在孕期使用正常蛋白飼料喂養(yǎng)（蛋白含量21%），IUGR 組孕鼠在孕期使用低蛋白飼料喂養(yǎng)（蛋白含量10%），造模方法參考文獻［1］。將兩組孕鼠分娩的新生仔鼠分別納入到對應(yīng)的IUGR組和對照組。

在21 d 的哺乳期，IUGR 組和對照組母鼠均用正常蛋白飼料和正常飲水喂養(yǎng)；斷乳后，IUGR 組和對照組仔鼠均用正常蛋白飼料和正常飲水喂養(yǎng)至生后12周。分別在生后1 d、1周、3周、8周和12周測量仔鼠體重。在3周、8周和12周測量仔鼠身長和腹圍，同時計算體重指數(shù)（body mass index，BMI）。

1.2 磁共振檢測

大鼠分別在生后3 周、8 周、12 周進行3.0T1H-MRS 檢測，禁食6 h 后，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，利用支架固定位置后，仰臥位放進12通道大鼠線圈，肝區(qū)放置在線圈中央，腹部使用墊片固定，使用繃帶綁住腹部能部分減少呼吸運動偽影。采用飛利浦公司Achieva 3.0T 磁共振掃描儀，常規(guī)采用快速自旋回波行橫斷位、矢狀位、冠狀位掃描。T1 加權(quán)成像（weighted imaging，WI）：重復(fù)時間 （repetition time，TR）10 ms， 回 波 時 間 （echo time， TE） 2.3/3.4 ms；T2WI：TR 3 392 ms，TE 100 ms。采集次數(shù) 3 次；層厚1.5 mm，層間距0.1 mm，采集矩陣256×192，視野14 cm。

1H-MRS：選用常規(guī)橫斷位、冠狀位及矢狀位T2WI 定位波譜感興趣區(qū) （region of interest，ROI），注意避開大血管、膽囊、大膽管、皮下脂肪和腸道。運用多體素點分辨波譜分析（point-resolved spectroscopy，PRESS）序列加抑水/不抑水采集，勻場由掃描儀自動完成，必要時手動勻場，水抑制用手動選擇最佳抑水點，使水峰半高全寬（full width at half maximum，F(xiàn)WHM）≤20。采集參數(shù)為TR 2 000 ms，TE 38 ms， 掃 描 體 素 是 10 mm×10 mm×15 mm，運用掃描儀所帶工作站波譜分析軟件進行數(shù)據(jù)處理后直接得到水峰面積（Iwater）和脂峰面積 （Ifa）t，使用公式Ifat/（Iwater+Ifa）t計算肝脂肪含量。波譜掃描結(jié)果由2位放射學(xué)醫(yī)師共同觀察判定其合格性，結(jié)合波譜圖基線是否基本平穩(wěn)、波峰是否可辨認及背景噪聲等綜合判斷?；€嚴重變形，脂肪峰很寬、變形或難以辨認等被視為不合格。每組各時間點檢測10 只大鼠，若出現(xiàn)不合格指標，則進行樣本替補。

1.3 組織病理學(xué)

使用頸椎脫臼法處死IUGR 大鼠，收集生后1 d、1 周、3 周、8 周和 12 周肝組織。收集生后3周、8周和12周內(nèi)臟脂肪組織。樣品在液氮罐冷凍，0.4%多聚甲醛固定并石蠟包埋。

1.4 RT-qPCR法檢測mRNA表達

肝臟和內(nèi)臟脂肪組織樣本存儲在-80°C 超低溫冰箱，按照生產(chǎn)商的說明書使用TRIzol 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）提取總RNA。使用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國） 將RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA 為模板，用針對目的基因設(shè)計合成的引物進行擴增，檢測細胞或組織樣本中目的基因的表達。PCR 擴增使用SYBR Green qRCR Mix（TOYOBO 公司，日本）試劑盒。Lipin 1和Lipin 2的基因序列和β-actin引物序列見表1，其設(shè)計及合成由長沙艾佳生物技術(shù)有限公司完成。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，共進行40個循環(huán)。繪制樣本的內(nèi)參基因β-actin和目的基因Lipin1、Lipin2的標準曲線?！鰿t實驗組=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），△Ct 對照組=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），通過反對數(shù)得到C值，原始濃度=濃度C×10，結(jié)果以目的基因和β-actin的比值表示。

表1 Lipin1、Lipin2和β-actin基因引物設(shè)計

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

稱量肝臟和內(nèi)臟脂肪組織，置于離心管中。在冰上將離心管中的組織剪切成細小碎片并加入裂解液。用電動組織勻漿器以轉(zhuǎn)速15 000 r/min 進行勻漿，每次10 s，間隔10 s，直至組織充分裂解。再以13 000 r/min 離心20 min，取上清液，加入5×還原樣品緩沖液，4℃分裝保存，待測。BCA 蛋白濃度測定法測定各樣本蛋白濃度。取20 μg 蛋白樣本，采用5%濃度濃縮膠電泳20 min，再經(jīng)不同濃度（8%～12%）分離膠電泳分離蛋白條帶，然后90 V電壓轉(zhuǎn)印40 min，用5%牛血清白蛋白室溫封閉NC膜2 h，洗膜后滴加蛋白特異性一抗Lipin 1（Abcam，英國，稀釋比1∶1 000）或Lipin 2（Abcam，英國，稀釋比1∶300），4℃孵育過夜，再滴加二抗溶液（湖南艾佳生物科技股份有限公司）（1∶15 000）孵育1 h，加入新鮮配制的顯色液顯色至條帶清晰呈現(xiàn)后終止染色。采用Image J圖像處理軟件對Western blot 結(jié)果進行灰度分析，結(jié)果以目的蛋白（Lipin2 和Lipin1）與內(nèi)參β-actin蛋白條帶的積分光密度比值表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗；采用Pearson相關(guān)分析Lipin 及其蛋白表達與肝臟脂肪含量的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUGR組和對照組仔鼠一般資料比較

兩組孕鼠均在受孕后第20～23天產(chǎn)仔鼠，未發(fā)生流產(chǎn)現(xiàn)象。對照組和IUGR 組仔鼠總數(shù)分別為112只和105只。每組分別取10只觀察生后3周、8周、12周時的一般資料，IUGR組仔鼠平均出生體重（5.4±0.5）g，低于對照組仔鼠平均出生體重［（6.6±0.3） g］（t=7.781，P＜0.05）。IUGR 組仔鼠生后1 周體重（12.0±0.4）g，低于對照組仔鼠生 后 1 周 體 重 ［ （15.3±0.3） g］（t=20.948，P＜0.05）。生后 3 周時，IUGR 組仔鼠體重、身長、BMI 均低于對照組（P＜0.05），兩組腹圍比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。生后8 周時，IUGR 組仔鼠體重、BMI、腹圍超過對照組（P＜0.05），兩組身長比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。生后12周時，IUGR 組仔鼠體重、BMI、腹圍亦超過對照組（P＜0.05），兩組身長比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組仔鼠一般資料比較 （，n=10）

表2 兩組仔鼠一般資料比較 （，n=10）

注：［BMI］體重指數(shù)。

BMI身長(cm)images/BZ_104_525_1200_813_1259.pngimages/BZ_104_1100_1200_1388_1259.pngimages/BZ_104_1388_1200_1673_1259.png6.6±0.4 7.9±0.7images/BZ_104_1673_1200_1958_1259.pngimages/BZ_104_813_1200_1100_1259.pngimages/BZ_104_237_1377_525_1495.png組別對照組IUGR組images/BZ_104_525_1377_813_1495.png5.5±0.6 4.4±0.5 7.6±0.8 8.4±0.6images/BZ_104_813_1377_1673_1495.png10.4±0.3 9.5±0.4images/BZ_104_1673_1377_1958_1495.png17.4±1.0 18.2±1.0 12周21.7±0.8 21.4±1.1 0.683 0.503images/BZ_104_237_1513_525_1631.pngimages/BZ_104_525_1513_1411_1572.png對照組IUGR組7.8±0.6 8.2±0.4體重(g)images/BZ_104_525_1572_1411_1631.png17.3±1.3 18.5±0.9 12周348±43 394±29 2.865 0.010images/BZ_104_1411_1572_1652_1631.pngimages/BZ_104_237_1749_1119_1867.png16.1±0.8 16.9±0.5images/BZ_104_1119_1749_1652_1867.png59±4 40±3images/BZ_104_1652_1749_1948_1867.png8周220±26 247±23

2.2 兩組仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1 mRNA 及其蛋白表達變化

生后3周、8周、12周時，IUGR組仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1 mRNA及其蛋白表達水平均高于對照組（P＜0.05），見表3和圖1。

表3 兩組仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1 mRNA及其蛋白相對表達比較 （，n=10）

表3 兩組仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1 mRNA及其蛋白相對表達比較 （，n=10）

images/BZ_104_237_2342_516_2460.pngimages/BZ_104_516_2342_1385_2401.png蛋白對照組IUGR組images/BZ_104_237_2578_813_2696.png3周1.01±0.17 1.28±0.08 8周1.21±0.28 1.44±0.16images/BZ_104_813_2578_1385_2696.png12周1.23±0.18 1.53±0.14images/BZ_104_1385_2578_1671_2696.png3周0.34±0.17 0.66±0.06images/BZ_104_1671_2578_1957_2696.png8周0.49±0.08 0.73±0.14 12周0.52±0.19 0.88±0.12 4.869 0.001

圖1 對照組與IUGR組仔鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1蛋白表達條帶圖

2.3 兩組仔鼠肝臟組織Lipin2 mRNA 及其蛋白表達變化

生后1 d時IUGR組肝臟組織Lipin2 mRNA及其蛋白表達水平低于對照組（P＜0.05），而生后1周、3 周、8 周、12 周時 Lipin2 mRNA 及其蛋白表達水平均高于對照組（P＜0.05），見表4和圖2。

圖2 對照組與IUGR組仔鼠肝臟組織Lipin2蛋白表達條帶圖

表4 兩組仔鼠肝臟組織Lipin2 mRNA及其蛋白相對表達比較 （，n=10）

表4 兩組仔鼠肝臟組織Lipin2 mRNA及其蛋白相對表達比較 （，n=10）

images/BZ_105_237_414_386_532.pngimages/BZ_105_386_414_1315_473.png蛋白對照組IUGR組images/BZ_105_386_473_1315_532.pngimages/BZ_105_237_650_572_768.png1.20±0.05 1.00±0.10images/BZ_105_572_650_758_768.png0.97±0.24 1.26±0.27images/BZ_105_758_650_943_768.png1.19±0.13 1.40±0.23images/BZ_105_943_650_1129_768.png1.18±0.07 1.57±0.25images/BZ_105_1129_650_1315_768.png1.24±0.05 1.48±0.14images/BZ_105_1315_650_1501_768.png1 d 0.48±0.14 0.32±0.09images/BZ_105_1501_650_1687_768.png1周0.37±0.08 0.54±0.15images/BZ_105_1687_650_1873_768.png3周0.56±0.34 0.93±0.32images/BZ_105_1873_650_2059_768.png8周0.96±0.31 1.23±0.21 12周0.94±0.08 1.46±0.39 4.101 0.001

2.4 兩組仔鼠肝臟脂肪含量的變化

生后3 周時，IUGR 組仔鼠和對照組肝臟脂肪含量比較差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05），生后8 周、12周時，IUGR組仔鼠肝臟脂肪含量顯著高于對照組（P＜0.05），見表5。

表5 兩組仔鼠肝臟脂肪含量比較 （，%，n=10）

表5 兩組仔鼠肝臟脂肪含量比較 （，%，n=10）

images/BZ_105_1284_1881_1524_1999.png組別對照組IUGR組images/BZ_105_1524_1881_1764_1999.png3周3.4±0.3 3.8±1.0images/BZ_105_1764_1881_2004_1999.png8周3.9±0.6 7.6±0.9 12周4.8±0.6 8.5±0.7 12.772 0.001

2.5 肝臟脂肪含量與Lipin mRNA及其蛋白表達的相關(guān)性分析

IUGR 組大鼠 Lipin1 蛋白和 mRNA 表達與肝臟脂肪含量呈正相關(guān)（分別r=0.628、0.521，P＜0.05），Lipin2 蛋白和mRNA 表達與脂肪含量呈正相關(guān)（分別r=0.601、0.524，P＜0.05），見圖3。

圖3 肝臟脂肪含量與Lipin mRNA及其蛋白表達的相關(guān)分析圖

3 討論

宮內(nèi)環(huán)境異?？赡芡ㄟ^發(fā)育程序化的途徑，引發(fā)出生后機體生理和代謝永久性的改變，增加成年期代謝性疾病發(fā)生的危險性［10］。導(dǎo)致IUGR肥胖的機制已經(jīng)在動物模型上進行廣泛的研究，脂肪組織被確定為程序化的主要目標之一［11］。制造IUGR 動物模型，可使用多種方法，如孕期營養(yǎng)限制、子宮胎盤結(jié)扎、糖皮質(zhì)激素暴露、煙熏等方法，營養(yǎng)不足或過度都會通過表觀遺傳機制影響后代基因表達［12］，這是健康和疾病發(fā)育起源理論的潛在分子機制［13］。IUGR動物模型提供了進一步的證據(jù)來支持以下假設(shè)，即子宮內(nèi)生長受限的各種缺陷會導(dǎo)致三酰甘油代謝受損和成年期肥胖，并且在某些情況下，誘導(dǎo)的表型會影響多代［14］。孕期營養(yǎng)限制導(dǎo)致后代脂肪組織增多，脂肪細胞中Lipin1和Lipin2的過度表達導(dǎo)致三酰甘油積累增加［15］。本研究IUGR模型顯示在出生3周后體重追趕生長，在8周時補償和加速追趕生長出現(xiàn)早發(fā)性肥胖和血脂異常，過多的脂肪組織堆積?？焖俪练e的脂肪組織在12周可能導(dǎo)致肥胖和胰島素抵抗。

IUGR 動物模型研究發(fā)現(xiàn)，由于脂肪功能紊亂出現(xiàn)不成比例的內(nèi)臟脂肪組織沉積［16］，IUGR大鼠成年期出現(xiàn)能量攝入增加，空腹血糖、總膽固醇和三酰甘油水平升高，呈現(xiàn)出高血脂和肝臟脂肪堆積，可能與IUGR大鼠的食欲增強和轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)及脂肪酸氧化相關(guān)基因調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)［17］。Lipin基因作為磷脂酸磷酸酶，是脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)錄輔助活化因子所必需的。Lipin1主要表達于脂肪細胞和骨骼肌，Lipin2主要表達于肝臟［18］。本研究收集來源于腸系膜和網(wǎng)膜的內(nèi)臟脂肪組織，分析發(fā)現(xiàn)3周、8 周、12 周 IUGR 組Lipin1基因表達高于對照組。出生1 d時的IUGR組仔鼠肝臟Lipin2表達量比對照組降低，說明IUGR組仔鼠在宮內(nèi)或者剛出生時肝臟代謝較對照組減弱，證實了“腦保護效應(yīng)”的學(xué)說，即受IUGR的影響，為了保證優(yōu)先臟器如腦的發(fā)育，外周組織器官（如肝臟、脂肪等）代謝減弱。1周以后，IUGR組仔鼠肝臟Lipin2表達量持續(xù)高于對照組，顯示IUGR仔鼠出生后處于正常營養(yǎng)的飲食狀態(tài)時，出現(xiàn)追趕生長，IUGR組Lipin1和Lipin2在3～12周表達增強，推測IUGR仔鼠發(fā)育期肝臟代謝水平可能處于一種較對照組偏高的代謝狀態(tài)。這一過程提示當(dāng)IUGR形成的代謝狀態(tài)與生后營養(yǎng)環(huán)境不相協(xié)調(diào)時，可能改變了肝臟的發(fā)育軌跡，導(dǎo)致物質(zhì)代謝發(fā)生一定程度的紊亂，有可能導(dǎo)致代謝綜合征的發(fā)生。

1H-MRS 是一種無創(chuàng)診斷技術(shù)，被認為是一種靈敏且可重復(fù)的定量肝臟脂質(zhì)含量的影像學(xué)方法［19］。磁場強度增加波譜分辨率更高，肝臟脂質(zhì)含量測量更準確。因為1H-MRS 檢測的水信號平均濃度在肝臟比其他代謝物的濃度高數(shù)倍，必須進行水抑制。同時需要不抑制水的掃描來獲得一個相同的體素參考信號［20］。波譜中的脂質(zhì)信號來自脂質(zhì)、脂肪酸和三酰甘油，主要是脂質(zhì)前體或脂質(zhì)分解產(chǎn)物，來自脂質(zhì)脂肪酸鏈的甲基。在本研究中，IUGR 大鼠在生后8 周和12 周時肝臟脂肪含量顯著高于對照組大鼠。說明肝臟和脂肪組織結(jié)構(gòu)的變化發(fā)生在IUGR大鼠出生后的發(fā)育時期，表明1H-MRS 檢測的脂肪含量能反映IUGR 大鼠脂質(zhì)代謝情況。

1H-MRS 可以作為非侵入性方法部分替代組織病理學(xué)，磁共振成像對實驗動物活體組織能準確評估肝臟脂肪［21］。三酰甘油積累是脂肪變性的組織病理學(xué)特征，磁共振的主要優(yōu)勢是它直接對三酰甘油顯像的化學(xué)特異性。對于檢測輕度脂肪變性，磁共振檢查方法具有較高靈敏度和特異度［22］。本研究結(jié)果顯示Lipin1蛋白及其mRNA表達水平與脂肪含量呈正相關(guān)，而Lipin2蛋白及其mRNA表達水平與脂肪含量呈正相關(guān)，提示肝臟脂肪含量與Lipin1和Lipin2基因的表達水平呈正相關(guān)?；?H-MRS 的脂質(zhì)測量，比組織病理學(xué)方法后處理時間更少，不需要犧牲動物，很容易進行重復(fù)隨訪，1H-MRS 廣泛使用在動物實驗中可能會部分節(jié)約實驗動物數(shù)量。

總之，本研究表明，1H-MRS 能無創(chuàng)性測量IUGR大鼠肝臟脂肪含量，IUGR大鼠存在相關(guān)的脂質(zhì)代謝異常。肝臟脂肪含量與Lipin1和Lipin2基因的表達呈正相關(guān)。IUGR 大鼠內(nèi)臟脂肪組織Lipin1和肝臟組織Lipin2 mRNA及其蛋白表達上調(diào)可引起肝臟1H-MRS脂肪含量增加。1H-MRS能夠無創(chuàng)測量IUGR 大鼠肝臟脂肪含量，為縱向臨床前研究提供了可靠依據(jù)。本研究也存在幾個局限性。首先，本研究中的大鼠自我調(diào)節(jié)食物攝入量，IUGR 大鼠和對照組大鼠之間的食物消耗量沒有差異。其次，本研究使用臨床大孔徑磁共振掃描儀代替專用的小動物磁共振掃描儀，圖像質(zhì)量有待進一步提高。第三，成像時大鼠自由呼吸，可引起偽影，由于目前大鼠呼吸和心電指標在臨床磁共振儀器尚無法檢測到，因此呼吸或者心電門控技術(shù)尚無法使用。