黃地老虎幼蟲取食誘導的棉花植株揮發(fā)物驅(qū)避雌蛾產(chǎn)卵

李夢宇, 張 濤, 夏施珂, 肖海軍, 陸宴輝,*

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學昆蟲研究所, 南昌 330045; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193;3. 河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所, 河北保定 071000)

植物在受到植食性昆蟲取食危害時會產(chǎn)生蟲害誘導植物揮發(fā)物(herbivore-induced plant volatiles, HIPVs)，這類揮發(fā)物常影響植食性昆蟲同種個體的取食、產(chǎn)卵等選擇行為。例如，很多植物被昆蟲取食后會釋放(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯[(E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene, DMNT)]作為直接或間接防御物質(zhì)(Liuetal., 2018)。草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda初孵幼蟲喜歡利用DMNT搜索寄主植物，當添加過DMNT的豇豆幼苗與未受損豇豆幼苗及機械損傷的豇豆幼苗相比較時，草地貪夜蛾的初孵幼蟲對添加DMNT的植株有更明顯的偏好(Carrolletal., 2008)。在很多蛾類昆蟲中，幼蟲危害寄主產(chǎn)生的HIPVs對同種雌蛾具有顯著的產(chǎn)卵忌避作用。煙草植株被煙芽夜蛾Heliothisvirescens幼蟲取食后，釋放的HIPVs能對雌蛾產(chǎn)卵行為產(chǎn)生顯著影響(De Moraesetal., 2001)。棉花受植食性昆蟲危害后，也能產(chǎn)生HIPVs。如被斜紋夜蛾Spodopteralittoralis取食的棉株能產(chǎn)生10余種能引起雌蛾觸角響應的HIPVs，而且在健康棉花植株上不斷添加HIPVs后，會明顯降低雌蛾產(chǎn)卵量(Zakiretal., 2013)。因其產(chǎn)卵驅(qū)避作用，HIPVs有望開發(fā)為新型的害蟲防控手段(Waretal., 2011)。

黃地老虎Agrotissegetum隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)地夜蛾屬Agrotis，是一種重要的地下害蟲，主要危害棉花、玉米及蔬菜等的幼苗和低矮草本植物，在我國多地均有分布(王敬儒等, 1983; 郭江龍等, 2016)。黃地老虎雌蛾平均產(chǎn)卵300～600粒，產(chǎn)卵量大且分散(屈年華, 2011)。雌蛾主要將卵產(chǎn)在低矮植物的葉片背面或雜草中，也會產(chǎn)在濕潤的土表、土塊等地方；其產(chǎn)卵方式會隨產(chǎn)卵植物和氣候條件等不同產(chǎn)生差異(王敬儒等, 1983; 李國英, 2017)。幼蟲孵化后2 h即開始取食，危害植物幼苗及幼根；幼蟲共6齡，2齡以下危害植物幼苗，3齡以上潛入土中，危害植物根莖；幼蟲白天潛入土中，夜晚再鉆出危害。由于幼蟲在土壤中危害的隱蔽性，因此對棉花產(chǎn)量影響極大，尤其以第一代幼蟲在新疆棉花苗期及蕾期危害最為嚴重(馬祁等, 2000; 李新輝等, 2003; 李國英, 2017; 王盼盼等, 2017)。

本研究通過產(chǎn)卵籠試驗評價黃地老虎雌蛾對幼蟲取食危害過的棉花植株的產(chǎn)卵選擇行為，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)鑒定黃地老虎幼蟲危害后棉花植株產(chǎn)生的HIPVs，通過觸角電位儀(EAG)和室內(nèi)產(chǎn)卵籠試驗測試HIPVs組分激發(fā)雌蛾的電生理反應及對產(chǎn)卵行為影響，從而闡明黃地老虎幼蟲危害棉花植株產(chǎn)生的HIPVs及其對雌蛾產(chǎn)卵選擇的影響效應。研究結(jié)果將為解析黃地老虎與棉花互作關系、研發(fā)黃地老虎行為調(diào)控劑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲：黃地老虎為中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地飼養(yǎng)的實驗種群，于養(yǎng)蟲室內(nèi)用人工飼料進行繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度26±1℃，相對濕度60%±5%，光周期14L∶10D。試驗選擇健康活躍的2-3齡幼蟲用于危害棉花植株，健康活躍且無畸形的3-6日齡成蟲進行產(chǎn)卵選擇試驗及觸角電位測定。

1.1.2供試植物：供試棉花品種為中棉49，使用上口直徑為8.5 cm、高11 cm的塑料花盆栽培于中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊科研中試基地溫室內(nèi)，用營養(yǎng)土、蛭石及大田土以1∶3∶8的比例混勻培育，生長期間利用防蟲網(wǎng)隔絕各種害蟲的取食危害。選擇健康的3-4葉期、株高25～30 cm的棉花植株進行試驗。

1.1.3試劑：試驗所需的標準化合物如表1所示。

表1 標準化合物的相關信息

1.2 黃地老虎雌蛾對幼蟲危害棉花植株的產(chǎn)卵選擇行為

根據(jù)孫小旭等(2018)的方法，設計制作了35 cm×35 cm×105 cm的產(chǎn)卵籠，產(chǎn)卵籠分為3個區(qū)域，兩端為反應區(qū)，中間為釋放區(qū)。試驗時將產(chǎn)卵籠兩端用紗布封住，剩余四周用保鮮膜包圍并使其平整光滑。

在產(chǎn)卵籠一端反應區(qū)底部對角線中心位置放置1盆健康棉花植株(1株)，另一端反應區(qū)底部對角線中心位置放置1盆土，兩端土的重量相等。產(chǎn)卵籠釋放區(qū)底部對角線中心位置放一個直徑約2 cm、蘸有10%蜂蜜水的棉球，用于提供成蟲補充營養(yǎng)。20∶00時在每個產(chǎn)卵籠中引入10頭黃地老虎抱卵雌蟲，24 h后檢查在產(chǎn)卵籠不同部位的產(chǎn)卵數(shù)量。在產(chǎn)卵籠釋放區(qū)產(chǎn)卵視為沒有作出產(chǎn)卵選擇，在兩端反應區(qū)產(chǎn)卵視為作出產(chǎn)卵選擇。試驗過程中，用黑布遮蓋產(chǎn)卵籠以消除周圍光照的影響，每次更換試驗處理前同時更換保鮮膜防止味道吸附而對試驗產(chǎn)生干擾。試驗在5個產(chǎn)卵籠中同時進行，共計5個重復。

上述預實驗后，開展黃地老虎雌蛾對健康和受害棉花植株產(chǎn)卵選擇性評價。在單盆1株健康棉花植株上接上4頭饑餓4 h的2-3齡幼蟲，葉片、植株基部各接2頭。取食12 h后，受害棉花植株用于產(chǎn)卵選擇試驗。采用與上述相同的程序和方法，在產(chǎn)卵籠兩側(cè)分別放置1盆健康棉花植株和1盆被黃地老虎幼蟲危害的棉花植株，接入10頭黃地老虎抱卵雌蟲，24 h后調(diào)查雌蛾在兩端反應區(qū)的產(chǎn)卵量。試驗在5個產(chǎn)卵籠中同時進行，共計5個重復。

1.3 黃地老虎幼蟲危害棉花植株HIPVs的收集與分析

采用頂空法收集棉花植株揮發(fā)物，為了確保產(chǎn)生并收集到高濃度的揮發(fā)物，每盆保留3株棉花，將12頭饑餓4 h的2-3齡幼蟲分別接到3株棉花上，每株棉花葉片、植株基部各接2頭。取食12 h后，用錫箔紙包裹盆土，將整盆棉花植株放入20 L玻璃罐中。采用大氣采樣儀(北京市勞動保護科學研究所，QC-1B型)抽氣(500 mL/min)，使空氣經(jīng)活性炭凈化后進入玻璃罐，再經(jīng)裝有50 mg吸附劑(Porapak Q, 80-100 Mesh, 美國)的吸附柱。連續(xù)收集8 h后，用1 000 μL正己烷將收集的揮發(fā)物淋洗至進樣瓶，然后氮吹濃縮至100 μL，保存于-20℃。每個處理重復3次。

利用GC-MS分析植物揮發(fā)物組分，GC-MS為安捷倫公司7890A-5975C，色譜柱為DB-wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。GC進樣口230℃，升溫程序為柱箱初溫50℃保持1 min；以5℃/min的速率升溫至180℃，保持2 min；然后10℃/min升溫至230℃，保持2 min。載氣是氦氣，流速是1 mL/min。MS離子源溫度設定為230℃。所有揮發(fā)物組分均采用NIST14譜庫檢索初步鑒定，并通過與標準化合物保留時間比對進行確認，進一步用外標法對所有揮發(fā)物含量進行定量分析。通過健康棉花植株和受害棉花植株中各種揮發(fā)物組分含量對比，確定HIPVs的主要組分。

1.4 黃地老虎雌蛾對HIPVs組分的電生理反應

采用EAG測定3-6日齡活躍的黃地老虎雌蛾對HIPVs的電生理反應，EAG設備(荷蘭Syntech公司)由探頭數(shù)據(jù)采集控制器IDAC-2、觸角固定器PRG-2、電極固定器、氣味刺激控制裝置CS-55、觸角電位記錄顯示輸出裝置組成。將整個觸角完整剪下，在解剖鏡下切除觸角末端部造成傷口。將觸角基部連接到參比電極，端部連接到記錄電極。觸角電極采用填有電生理鹽水(0.9%的氯化鈉水溶液)的毛細管玻璃電極，電極內(nèi)銀絲連接PRG-2。

將標準化合物按照0.001, 0.01, 0.1, 1和10 μg/μL濃度配制。每次取10 μL不同濃度標準化合物滴到濾紙(0.5 cm×4 cm)上，將其塞入巴斯德管中，進行EAG測定。每次刺激時間為0.5 s，每2次刺激間隔30 s。以順-3-己烯-1-醇為參照物評價黃地老虎對各個HIPVs組分的EAG反應，所有處理均重復10次。

1.5 黃地老虎雌蛾對具有電生理活性HIPVs組分的產(chǎn)卵選擇行為

將對觸角激發(fā)強烈電生理反應的HIPVs組分逐一開展產(chǎn)卵選擇試驗，操作同1.2節(jié)。在產(chǎn)卵籠兩端各放置一盆土，然后將10 μL濃度為10 μg/μL的標準化合物滴到濾紙上放在處理端盆土上，對照端盆土上放置滴了10 μL石蠟油的濾紙，接入10頭黃地老虎抱卵雌蟲，24 h后調(diào)查雌蛾在兩端反應區(qū)的產(chǎn)卵量。試驗在5個產(chǎn)卵籠中同時進行，共計5個重復。

1.6 數(shù)據(jù)分析

計算EAG平均相對反應值，評價黃地老虎雌蛾對各HIPVs組分的電生理反應。 EAG相對反應值=(CT-CK)/(CF-CK)。其中，CT為對待測樣品的EAG反應值，CK為對對照石蠟油的平均EAG反應值，CF為對參照順-3-己烯-1-醇的平均EAG反應值。

黃地老虎雌蛾產(chǎn)卵量和EAG反應值分別用t檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析(GraphPad Prism 9.0.1)。

2 結(jié)果

2.1 黃地老虎雌蛾對棉花植株的產(chǎn)卵選擇

無棉花植株的盆土一端黃地老虎產(chǎn)卵量為9.60±0.51粒，有棉花植株一端的產(chǎn)卵量為22.20±1.02粒，兩者差異顯著(t=11.05,df=8,P<0.001)(圖1: A)。這表明，上述自制產(chǎn)卵籠適用于黃地老虎成蟲產(chǎn)卵選擇行為試驗。

在健康和受害棉花植株之間，黃地老虎雌蛾更偏好在健康棉花植株一端產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量為87.00±7.64粒，而在被幼蟲取食過的棉花植株一端產(chǎn)卵量僅為13.20±1.99粒，健康棉株上的產(chǎn)卵量為受幼蟲危害棉株上的6.59倍，兩者之間差異極顯著(t=14.63,df=8,P<0.001)(圖1: B)。試驗中發(fā)現(xiàn)，黃地老虎雌蛾多在盆邊、紗布及保鮮膜上產(chǎn)卵，而不直接在棉花植株上產(chǎn)卵。

圖1 黃地老虎雌蛾對棉花植株的產(chǎn)卵選擇

2.2 黃地老虎幼蟲危害棉花植株HIPVs組分鑒定

與健康植株相比，黃地老虎幼蟲取食危害后，棉花植株中有8種揮發(fā)物含量發(fā)生了顯著變化，分別為十四烷、苯甲醛、β-石竹烯、芳樟醇、十六烷、葎草烯及2種無法確定種類的化合物(圖2)。對前面6種HIPVs組分進行了定量分析，發(fā)現(xiàn)β-石竹烯和葎草烯含量變化最大，分別增加了5.33倍和3.68倍，而十四烷含量增加了0.76倍，苯甲醛含量增加了0.68倍，十六烷含量增加了1.53倍，增幅較小;同時，芳樟醇僅在幼蟲危害的棉花植株中被發(fā)現(xiàn)(表2)。

圖2 健康棉花植株(B)和黃地老虎幼蟲危害棉花植株(A)揮發(fā)物的GC FID圖

表2 黃地老虎幼蟲危害棉花植株中6種已知揮發(fā)物組分的含量變化

2.3 黃地老虎雌蛾對HIPVs組分的電生理反應

在2.2節(jié)鑒定到的6種HIPVs組分中，β-石竹烯(F=11.54,df=4, 45,P<0.001)、苯甲醛(F=205.30,df=4, 45,P<0.0001)和芳樟醇(F=56.73,df=4, 45,P<0.001)引起的雌蛾觸角反應隨濃度增大而增大，其中苯甲醛引起的反應值最高，芳樟醇次之，β-石竹烯引起的反應最弱(圖3)。在苯甲醛濃度為10 μg/μL時，EAG相對反應值大于1，說明其引起的觸角反應程度強于參照物順-3-己烯-1-醇；同時，葎草烯(F=30.90,df=4, 45,P<0.001)、十四烷(F=3.28,df=4, 45,P=0.019)和十六烷(F=1.01,df=4, 45,P=0.413)引起的觸角反應則并不隨濃度增大而增大(圖3)。

圖3 黃地老虎雌蛾對不同HIPVs組分的觸角電位反應

2.4 黃地老虎雌蛾對HIPVs組分的產(chǎn)卵選擇行為

對2.3節(jié)中EAG活性最強的芳樟醇和苯甲醛，分別進行產(chǎn)卵選擇試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，黃地老虎雌蛾更偏好在苯甲醛一端產(chǎn)卵，對照端產(chǎn)卵量為15.40±3.03粒，苯甲醛端產(chǎn)卵量為71.00±23.67粒(t=2.33,df=8,P=0.048)(圖4: A)。而芳樟醇則完全相反，雌蛾在對照一端產(chǎn)卵更多，對照端產(chǎn)卵量為94.20±14.95粒，芳樟醇端產(chǎn)卵量為46.60±11.69粒(t=2.508,df=8,P=0.037)(圖4: B)。初步確認黃地老虎幼蟲危害棉花植株產(chǎn)生的HIPVs中，具有產(chǎn)卵驅(qū)避活性的化合物主要是芳樟醇。

圖4 黃地老虎雌蛾對芳樟醇和苯甲醛的產(chǎn)卵選擇

3 討論與結(jié)論

植物在生長過程中會面對各種植食性昆蟲的侵害，在長期共同進化中植物對植食性昆蟲形成了一套穩(wěn)定的防御系統(tǒng)，其中釋放HIPVs以驅(qū)避害蟲取食及產(chǎn)卵等行為是植物防御的重要手段之一。植物HIPVs釋放防御這一生物學現(xiàn)象在亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、二斑葉螨Tetranychusurticae和細紋黛齒螟Heortiavitessoides(Horiuchietal., 2003; Huangetal., 2009; Qiaoetal., 2018)等害蟲危害中均有報道。本研究發(fā)現(xiàn)棉花植株被黃地老虎幼蟲危害后也會產(chǎn)生類似的防御反應，能夠通過釋放HIPVs降低雌蛾在受害植株上的產(chǎn)卵量。這種產(chǎn)卵行為可能是源于避免同種不同個體間在同一植株上的生態(tài)位競爭。

本研究發(fā)現(xiàn)健康棉花植株幾乎不釋放芳樟醇，但是被黃地老虎幼蟲危害后，棉花植株會產(chǎn)生芳樟醇(表2)。電生理實驗發(fā)現(xiàn)，黃地老虎雌蛾對芳樟醇反應明顯，且存在顯著的劑量反應關系(圖3)；進一步行為實驗表明，黃地老虎雌蛾在芳樟醇附近產(chǎn)卵量明顯更少(圖4)。因此，我們推斷芳樟醇是棉花受到黃地老虎危害后產(chǎn)生的具有產(chǎn)卵驅(qū)避活性的HIPVs。作為一種重要的HIPVs，芳樟醇在其他植物受到危害時也會產(chǎn)生，并起到產(chǎn)卵驅(qū)避作用。例如，Kessler和Baldwin(2001)的研究表明，當煙草受到煙芽夜蛾H.virescens危害后芳樟醇產(chǎn)生的量會明顯增多，進一步在田間試驗利用人工合成的芳樟醇標準品模擬煙芽夜蛾危害煙草后的芳樟醇釋放量，結(jié)果表明芳樟醇對煙芽夜蛾的產(chǎn)卵具有顯著的驅(qū)避作用。棉花被斜紋夜蛾危害后會產(chǎn)生芳樟醇等氣味，并進一步驅(qū)避斜紋夜蛾的產(chǎn)卵行為(Zakiretal., 2013)。為了更好發(fā)揮芳樟醇的產(chǎn)卵驅(qū)避作用，科學家擬通過轉(zhuǎn)基因技術，讓作物本身釋放芳樟醇以驅(qū)避害蟲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當轉(zhuǎn)芳樟醇基因煙草與正常煙草相對比時，能釋放芳樟醇的轉(zhuǎn)基因煙草上棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的產(chǎn)卵量會顯著減少(McCallumetal., 2011)；桃蚜Myzuspersicae在轉(zhuǎn)芳樟醇基因煙草植株上的產(chǎn)卵量顯著少于非轉(zhuǎn)基因煙草上的(Huangetal., 2018)。因此，芳樟醇是一種對多種害蟲都有產(chǎn)卵驅(qū)避活性的HIPVs組分，對棉田生態(tài)系統(tǒng)中多種害蟲的生態(tài)功能有待系統(tǒng)評價。

與健康棉花植株相比，受到黃地老虎危害的棉花植株會釋放出6.33倍的β-石竹烯和4.68倍的葎草烯，同時會產(chǎn)生更多的苯甲醛、十四烷等物質(zhì)(表2)。雖然這些揮發(fā)物在健康棉花中也存在，但是被害蟲危害后釋放量顯著增加，我們也將之確認為黃地老虎危害棉花產(chǎn)生的HIPVs。其中，苯甲醛不僅能夠引起黃地老虎雌蛾的強烈觸角電位反應，而且會吸引黃地老虎雌蛾產(chǎn)卵。苯甲醛是常見的花香物質(zhì)(Hoballahetal., 2005)，在棉花、煙草、玉米等植物揮發(fā)物中均普遍存在(Loughrinetal., 1994; Yanetal., 2005; Yan and Wang, 2006)，可吸引黃地老虎雌蛾前往覓食，從而導致苯甲醛端產(chǎn)卵量更多。本試驗對含量變化不大及觸角電生理反應小的物質(zhì)沒有進行重點評價，但是否對芳樟醇等功能揮發(fā)物存在影響效應，值得進一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)棉花植株受到黃地老虎幼蟲危害后會顯著降低雌蛾在受害植株的產(chǎn)卵量，其中芳樟醇是主要的產(chǎn)卵驅(qū)避活性物質(zhì)，從而闡明黃地老虎幼蟲危害棉花植株產(chǎn)生的HIPVs及其組分對雌蛾產(chǎn)卵選擇的影響效應，結(jié)果為進一步開發(fā)基于HIPVs的黃地老虎防控技術提供了科學依據(jù)。