大蒜凍干粉指紋圖譜的建立及蒜氨酸含量測(cè)定?

孫小鑫， 苗 青， 王瑞海， 馬小華， 吉星月， 劉麗梅△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，烏魯木齊 830002；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院， 河北 廊坊 065001)

大蒜為百合科植物大蒜(AlliumsativumL.)的鱗莖[1]，是使用歷史最為悠久的藥食兩用植物之一，其中蒜氨酸是大蒜中具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等活性的重要化學(xué)成分[2-4]。雖然蒜氨酸在強(qiáng)光照射、高溫條件下較穩(wěn)定[5]，但當(dāng)大蒜破碎后細(xì)胞破裂，其可在一定溫度下被大蒜自身具有的蒜氨酸酶催化轉(zhuǎn)化為大蒜辣素，大蒜辣素不穩(wěn)定，進(jìn)一步分解生成大蒜素等[6]。為能夠最大程度地避免高溫造成的大蒜原有活性成分蒜氨酸分解、失活并保留其活性，大蒜腸溶片藥品生產(chǎn)采用大蒜凍干粉作為中間體。因此，大蒜凍干粉的質(zhì)量控制對(duì)于大蒜腸溶片臨床用藥的治療效果保障至關(guān)重要。

當(dāng)前，針對(duì)大蒜凍干粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未見收載。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》僅以大蒜素作為大蒜含量測(cè)定的指標(biāo)成分[1]，而《歐洲藥典》則將大蒜辣素作為大蒜的質(zhì)控指標(biāo)，大蒜素與大蒜辣素均不是大蒜中的原型成分，不能直接反映大蒜的質(zhì)量。藥品生產(chǎn)企業(yè)采用的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是同對(duì)照品一起先將大蒜凍干粉中的蒜氨酸轉(zhuǎn)化為大蒜辣素，根據(jù)大蒜辣素的含量計(jì)算蒜氨酸的含量，然而此法涉及復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化問題。《美國(guó)藥典》針對(duì)蒜氨酸結(jié)構(gòu)中無共軛體系和發(fā)色集團(tuán)，使用紫外末端吸收檢測(cè)靈敏度有限的問題，采用衍生化法測(cè)定蒜氨酸的含量，但操作繁瑣[7]。

為科學(xué)地反映大蒜凍干粉的質(zhì)量，本文擬采用殺酶測(cè)定法，在抑制或殺滅蒜氨酸酶并保證蒜氨酸穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，建立測(cè)定方法。目前報(bào)道殺酶的常規(guī)方式包括酶抑制劑(羧甲基羥胺半鹽酸鹽)殺酶[8]、微波殺酶[9，10]、有機(jī)溶劑殺酶[11]等，但對(duì)蒜氨酸酶殺酶方式的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。因此，研究擬針對(duì)蒜氨酸酶的殺酶方法開展系統(tǒng)研究，在優(yōu)化殺酶方法及參數(shù)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)建立大蒜凍干粉的指紋圖譜及蒜氨酸含量測(cè)定方法，并將本研究建立的含量測(cè)定方法與《美國(guó)藥典》中衍生化法測(cè)定蒜氨酸含量的方法進(jìn)行對(duì)比，為生產(chǎn)企業(yè)有效控制大蒜凍干粉的質(zhì)量提供簡(jiǎn)便、易行、可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 藥物

大蒜凍干粉(批號(hào)分別為DG20190301、DG20200402、DG20200403、DG20200404、DG20200405、DG20200501、DG20200502、DG20200503、DG20200504、DG20200602、DG20200605、DG20200609、DG20200901、DG20200902、DG20200903、DG20200904)，新疆特豐藥業(yè)股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

蒜氨酸(批號(hào)AL160615，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司)；磷酸氫二鉀、庚烷磺酸鈉、羧甲基羥胺半鹽酸鹽(批號(hào)分別為R15O11P127525、R19S11K125061、Z12A10H85668，上海源葉生物科技有限公司)；磷酸二氫鉀(批號(hào)959525-1，北京市紅星化工廠)；磷酸二氫鈉(批號(hào)040817，北京化學(xué)試劑公司)；氫氧化鈉(批號(hào)20140418，北京化工廠)。水為娃哈哈純凈水，甲醇、三氟乙酸、1,4-二氧六環(huán)、四氫呋喃為色譜純，其余試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀、G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；BT25 S型1/10萬電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；BSA224 S-CW型1/1萬電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SB-5200DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取蒜氨酸對(duì)照品適量精密稱定，加純凈水制成每1 mL含0.146 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 殺酶方式的確定 本研究對(duì)9種殺酶條件進(jìn)行了篩選，包括微波殺酶、乙醇?xì)⒚?、甲醇?xì)⒚覆煌瑫r(shí)間(30 min、1 h、2 h)、加甲醇不同倍量(50、100、200倍)、酶抑制劑殺酶。

2.2.2 酶抑制劑用量的確定 不同劑量的酶抑制劑會(huì)影響殺酶效果，從而對(duì)蒜氨酸的含量產(chǎn)生影響，為此本研究對(duì)酶抑制劑的用量進(jìn)行了考察。取大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)約0.1 g，精密稱定，分別精密加入3 mL不同濃度(0、0.0017、0.0033、0.005、0.0067、0.01、0.013、0.017、0.02 mol/L)的酶抑制劑，振搖直到粉末完全分散，離心得到澄清溶液，精密吸取0.5 mL澄清溶液，用酶抑制劑定容至10 mL，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取大蒜凍干粉約0.1 g精密稱定，精密加入0.0067 mol/L的酶抑制劑3 mL，振搖直到粉末完全分散，離心得到澄清溶液，精密吸取0.5 mL澄清溶液，用上述酶抑制劑定容至10 mL，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液即得。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)，梯度洗脫(0～10 min，5%～10% A；10～25 min，10% A)，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃。

2.3.2 方法學(xué)考察

(1)精密度考察：取大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以蒜氨酸為參照峰，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

(2)穩(wěn)定性考察：取大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按2.3.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以蒜氨酸為參照峰，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

(3)重復(fù)性考察：取同一大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)6份，精密稱定按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以蒜氨酸為參照峰，計(jì)算11個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值。

2.3.3 指紋圖譜的建立 按2.2.3項(xiàng)下方法制備15批大蒜凍干粉的供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，將相關(guān)色譜圖的AIA文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)進(jìn)行處理，以S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)定0.2 min，采用中位數(shù)法，對(duì)色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配，生成15批大蒜凍干粉的指紋圖譜以及對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算15批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度，并計(jì)算各共有峰相對(duì)于蒜氨酸的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積的RSD值。

2.4 蒜氨酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)-甲醇(90：10)，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃。

2.4.2 方法學(xué)考察

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與檢測(cè)限、定量限的確定：精密吸取2.1項(xiàng)下的蒜氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，用純凈水依次稀釋0、2、4、8、16、32倍，按2.4.1的色譜條件進(jìn)行液相分析測(cè)定峰面積。以蒜氨酸濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，蒜氨酸峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)蒜氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，分別以信噪比S/N=3和S/N=10為標(biāo)準(zhǔn)，記錄蒜氨酸的檢測(cè)限和定量限。

(2)精密度考察：精密吸取2.4.2(1)項(xiàng)下稀釋4倍的蒜氨酸對(duì)照品溶液，按2.4.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算蒜氨酸峰面積的RSD值。

(3)穩(wěn)定性考察：按2.2.3的方法制備供試品溶液，在制備后分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算供試品溶液中蒜氨酸峰面積的RSD值。

(4)重復(fù)性考察：取大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)6份，每份約0.1 g，按2.2.3的方法制備供試品溶液，按2.4.1的色譜條件進(jìn)行液相分析，計(jì)算供試品溶液蒜氨酸含量的RSD值。

(5)加樣回收率實(shí)驗(yàn)：取已知含量的大蒜凍干粉(批號(hào)為DG20190301)約0.05 g 6份精密稱定，分別精密加入蒜氨酸對(duì)照品溶液(用濃度為0.0067 mol/L的酶抑制劑配制成1.29 mg/mL的蒜氨酸溶液)1.5 mL，并分別加入0.0067 mol/L的酶抑制劑1.5 mL，振搖直到粉末完全分散，離心得到澄清溶液，轉(zhuǎn)移0.5 mL澄清溶液用上述酶抑制劑定容至10 mL，搖勻?yàn)V過取續(xù)濾液，按2.4.1的色譜條件進(jìn)行液相分析，計(jì)算加樣回收率及RSD值。

2.4.3 樣品含量測(cè)定 按2.2.3的方法制備15批樣品的供試品溶液，按2.4.1的色譜條件進(jìn)行液相分析，記錄蒜氨酸的峰面積，根據(jù)2.4.2項(xiàng)下(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算15批樣品中蒜氨酸含量。

2.5 《美國(guó)藥典》方法[12]

2.5.1 衍生化試劑的配制 取140 mg鄰苯二甲醛，加5 mL甲醇溶解，再精密加入100 μL叔丁基硫醇，用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至50 mL，混勻。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取蒜氨酸對(duì)照品適量精密稱定，加甲醇-水(1∶1)制成每1 mL含0.05 mg的對(duì)照品溶液，取上述溶液0.1 mL于具塞試管中，加0.5 mL衍生化試劑混勻，反應(yīng)2 min后進(jìn)行液相分析。

2.5.3 供試品溶液的制備 取大蒜凍干粉約1 g精密稱定，精密加入0.01 mol/L酶抑制劑30 mL，振搖直到粉末完全分散，離心得到澄清溶液，精密吸取5 mL澄清溶液，用上述酶抑制劑定容至10 mL，搖勻取上述溶液0.1 mL于具塞試管中，加0.5 mL衍生化試劑混勻，反應(yīng)2 min后進(jìn)行液相分析。

2.5.4 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-1,4-二氧六環(huán)-四氫呋喃-0.045 mol/L磷酸鹽緩沖液(25.0∶2.9∶2.2：69.9)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)337 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.5.5 樣品含量測(cè)定 精密吸取2.5.2的對(duì)照品溶液，按2.5.3的方法制備15批樣品的供試品溶液，按2.5.4的色譜條件進(jìn)液相分析，記錄蒜氨酸的峰面積，并按《美國(guó)藥典》中公式計(jì)算樣品中蒜氨酸含量。蒜氨酸含量(%)=(rU/rS)×CS×(V/W)×D×100%，其中，rU為大蒜凍干粉中蒜氨酸峰面積，rS為蒜氨酸對(duì)照品的峰面積，CS為蒜氨酸對(duì)照品溶液濃度(mg/mL)，V為樣品儲(chǔ)備液的體積(mL)，W為大蒜凍干粉的質(zhì)量(mg)，D為由樣品儲(chǔ)備液制備樣品溶液的稀釋系數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0對(duì)15批樣品2種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 殺酶方式的篩選結(jié)果

通過HPLC法測(cè)定不同殺酶方法及殺酶條件處理后供試品溶液中的蒜氨酸含量(如圖1)。9種殺酶條件殺酶結(jié)果表明，采用酶抑制劑殺酶處理后蒜氨酸的含量最高，因此最終確定殺酶方式為酶抑制劑殺酶。

圖1 9種殺酶條件對(duì)比結(jié)果

3.2 酶抑制劑用量的篩選結(jié)果

研究通過HPLC法測(cè)定蒜氨酸含量，對(duì)比酶抑制劑的不同加入量(見圖2)。折線圖表明，當(dāng)加入酶抑制劑濃度為0.0067 mol/L、體積為3 mL時(shí)，繼續(xù)增加酶抑制劑的濃度，樣品中蒜氨酸含量幾乎沒有變化，說明蒜氨酸酶的活性得到了較好的抑制。因此，確定0.1 g樣品加入0.0067 mol/L的酶抑制劑3 mL，即加入樣品量2.18%的酶抑制劑，可以達(dá)到徹底殺酶的效果。

圖2 酶抑制用量對(duì)樣品含量影響曲線

3.3 指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果

經(jīng)精密度考察，11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤0.32%，相對(duì)峰面積的RSD均≤2.64%，表明儀器精密度良好；經(jīng)穩(wěn)定性考察，11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤0.29%，相對(duì)峰面積的RSD均≤2.90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；經(jīng)重復(fù)性考察，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤0.26%，相對(duì)峰面積的RSD均≤2.88%，表明該方法重復(fù)性良好，說明建立的指紋圖譜方法可靠。

3.4 指紋圖譜的建立結(jié)果

15批樣品的指紋圖譜共標(biāo)示出11個(gè)共有峰，其中9號(hào)峰(蒜氨酸)分離度好，保留時(shí)間居中，因此選擇9號(hào)峰為參照峰(見圖3)。樣品S1～S15與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.999、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.997、0.997、0.996、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999，15批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均≥0.996，說明大蒜凍干粉總體質(zhì)量穩(wěn)定(見圖4)。各共有峰相對(duì)于蒜氨酸相對(duì)保留時(shí)間的RSD均≤0.38%，相對(duì)峰面積的RSD為0.00%～59.12%，表明15批大蒜凍干粉在化學(xué)成分種類上一致，但同一成分的含量存在一定差異。

9.蒜氨酸圖3 蒜氨酸對(duì)照品及大蒜凍干粉的HPLC圖

圖4 15批大蒜凍干粉HPLC指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜(R)

3.5 蒜氨酸含量測(cè)定方法學(xué)考察結(jié)果

蒜氨酸的回歸方程為：Y=10.421X-3.2556，R=1，檢測(cè)限為0.50 ng，定量限為1.67 ng；經(jīng)精密度考察，求得蒜氨酸峰面積的RSD值是0.13%(n=6)，表明儀器的精密度良好；經(jīng)穩(wěn)定性考察，求得供試品溶液中蒜氨酸峰面積的RSD值是0.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；經(jīng)重復(fù)性考察，求得供試品溶液蒜氨酸含量的RSD值是0.42%(n=6)，表明此方法的重復(fù)性良好；蒜氨酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)，RSD值符合要求(見表1)。

表1 大蒜凍干粉中蒜氨酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.6 含量測(cè)定色譜圖及結(jié)果

本研究建立的含量測(cè)定方法以及《美國(guó)藥典》衍生化法得到的對(duì)照品和樣品色譜圖(見圖5、6)，2種方法測(cè)得15批大蒜凍干粉中蒜氨酸的含量(見表2)。

表2 2種方法測(cè)定15批大蒜凍干粉中蒜氨酸含量結(jié)果比較(n=3)

3.7 2種方法對(duì)比結(jié)果

配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，2種方法測(cè)得15批樣品中蒜氨酸的含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.704>0.05)。

注：A．蒜氨酸對(duì)照品；B．大蒜凍干粉；1．蒜氨酸圖5 蒜氨酸對(duì)照品和大蒜凍干粉HPLC色譜圖

注：A．蒜氨酸對(duì)照品；B．大蒜凍干粉；1．蒜氨酸圖6 蒜氨酸對(duì)照品和大蒜凍干粉的衍生化法色譜圖

4 討論

本研究首先對(duì)殺酶方式進(jìn)行了系統(tǒng)考察。微波殺酶時(shí)間短、操作容易，但是殺酶不徹底，而且因微波爐的型號(hào)、功率等不同不便于建立標(biāo)準(zhǔn)；乙醇沒有起到殺酶的作用，甲醇?xì)⒚笗r(shí)間長(zhǎng)、用量大，且殺酶效果不如酶抑制劑殺酶；因此，本研究確定殺酶方式為酶抑制劑殺酶，此方法殺酶效果好、效率高，同時(shí)對(duì)酶抑制劑的用量進(jìn)行了考察，并確定加入樣品量2.18%的酶抑制劑可以達(dá)到徹底殺酶的效果。

研究在建立含量測(cè)定的色譜條件時(shí)考察了多個(gè)因素，比較了Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Supersil AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)這5種色譜柱的分離效果，結(jié)果表明Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱能使各色譜峰得到較好的分離，且色譜圖的基線平穩(wěn)，故最終選擇其作為蒜氨酸含量測(cè)定的色譜柱。流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)分離度也會(huì)產(chǎn)生影響，本研究參考文獻(xiàn)考察了純水[9]、0.1%磷酸水[7]、0.04%CF3COOH水[13]、甲醇-0.02%CF3COOH水溶液(5：95)[14]、0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)-甲醇(90：10)[15]等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明當(dāng)流動(dòng)相為0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)-甲醇(90∶10)時(shí)，樣品中蒜氨酸峰形及各色譜峰的分離度均最好，因此，本研究最終選擇流動(dòng)相為0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)-甲醇(90：10)。本研究也考察了不同流速(0.5 mL/min、0.8 mL/min、1 mL/min)以及不同檢測(cè)波長(zhǎng)(210 nm、214 nm、220 nm)對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果顯示流速為0.5 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)，蒜氨酸的峰形、分離度、響應(yīng)最佳。

建立指紋圖譜的色譜條件時(shí)，本研究對(duì)0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液的不同pH(1.5、2.1、3.0)進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明隨著溶液pH的降低，色譜峰的個(gè)數(shù)增多且分離度更好，考慮到pH為1.5時(shí)溶液的酸性太強(qiáng)，會(huì)對(duì)色譜柱的柱效產(chǎn)生影響，因此確定溶液的pH為2.1。同時(shí)對(duì)磷酸二氫鉀與庚烷磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了篩選：①0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1);②0.28%磷酸二氫鉀+0.4%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1);③0.56%磷酸二氫鉀+0.4%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)。結(jié)果表明，當(dāng)磷酸二氫鉀與庚烷磺酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.28%和0.2%時(shí)，色譜峰的分離度最佳，因此確定離子對(duì)試劑為0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)。本研究以A：甲醇，B：0.28%磷酸二氫鉀+0.2%庚烷磺酸鈉溶液(pH=2.1)為流動(dòng)相，對(duì)以下梯度洗脫條件進(jìn)行了篩選：①0～5 min、5%～10% A；5～25 min、10% A；②0～10 min、5%～10% A；10～25 min，10% A；③0～15 min、5%～10% A；15～25 min、10% A；④0～10 min、0%～10% A；10～25 min、10% A；⑤0～10 min、3%～10% A；10～25 min、10% A。結(jié)果表明，當(dāng)梯度洗脫條件為②時(shí)，色譜峰多，色譜圖基線平穩(wěn)且分離度最好，因此確定梯度洗脫條件為：0～10 min、5%～10% A；10～25 min、10% A。

本研究建立了15批大蒜凍干粉的指紋圖譜，結(jié)果顯示15批樣品的化學(xué)成分種類基本一致，指紋圖譜的相似度均≥0.996，說明企業(yè)生產(chǎn)的大蒜凍干粉(中間體)總體質(zhì)量穩(wěn)定；15批樣品含量有一定差異，可能與大蒜的產(chǎn)地有關(guān)，但其含量均在企業(yè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

在供試品溶液的制備過程中，振搖直到粉末完全分散后發(fā)現(xiàn)，大蒜凍干粉不能完全溶解在溶液中。本研究對(duì)大蒜凍干粉經(jīng)振搖分散后的溶液進(jìn)行了超聲處理，結(jié)果表明超聲與否不會(huì)對(duì)蒜氨酸的峰面積產(chǎn)生影響，故確定振搖直到粉末完全分散，離心得到澄清溶液即可。由于蒜氨酸對(duì)照品價(jià)格昂貴，在建立方法時(shí)涉及到加樣回收，因此本研究將大蒜凍干粉的取樣量定為0.1 g；在與《美國(guó)藥典》建立的衍生化方法進(jìn)行對(duì)比時(shí)，衍生化法按《美國(guó)藥典》中1 g的取樣量，而本研究按建立的方法取樣量為0.1 g，在此說明。大蒜凍干粉中的蒜氨酸遇蒜氨酸酶會(huì)分解，因此在做加樣回收率實(shí)驗(yàn)時(shí)用酶抑制劑配制蒜氨酸對(duì)照品溶液，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法對(duì)樣品中蒜氨酸含量沒有影響。

經(jīng)配對(duì)樣本的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，本研究建立的蒜氨酸含量測(cè)定方法與《美國(guó)藥典》衍生化法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然樣品經(jīng)衍生化后可以避開末端吸收波長(zhǎng)[16]，但衍生化法與本研究建立的方法比較，氣味難聞且操作繁瑣。采用本研究建立的方法進(jìn)行蒜氨酸含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)便且結(jié)果準(zhǔn)確。

綜上，本研究采用HPLC法建立了15批大蒜凍干粉的指紋圖譜，并建立了大蒜凍干粉中蒜氨酸的含量測(cè)定方法，所建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法易于操作、重復(fù)性好，能夠?yàn)樯a(chǎn)企業(yè)有效控制大蒜凍干粉的質(zhì)量提供簡(jiǎn)便、易行、可靠的方法。