通督調神針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能及VEGF、NGF、MBP表達的影響?

劉 燕， 王陳妮， 蘭 崴， 唐 巍△

(1.安慶醫(yī)藥高等?？茖W校中醫(yī)康復教研室，安徽 安慶 246052；2.安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院， 合肥 230012)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要病理生理機制，大腦缺血時間過長引起大腦生物電功能調控異常，造成不可逆的神經損傷，在恢復血供的同時還會引起更嚴重的腦組織損傷[1]。中醫(yī)針刺療法對缺血性腦卒中一直有良好的效果，得到國內外廣泛認可[2，3]。中醫(yī)認為，該病治療當以通督調神為原則，督脈循行于脊里，上絡于腦，與腦和脊髓關系密切。針刺治療時以督脈穴位為主，通督脈以調元神，輔以心包經穴位，調整氣血運行進而達到調腦神的作用。臨床研究發(fā)現，通督調神針刺可明顯促進中風患者的神經功能恢復[4]，不過相關動物實驗研究較少，病理機制尚不明朗。既往文獻顯示，神經損傷修復和再生與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)有關[5，6]。本實驗構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，從VEGF、NGF、MBP蛋白表達觀察通督調神針刺對大鼠神經功能恢復的影響，并探討其可能的作用機制。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(批號AHUCM-rats-2020006)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠40只，體質量(240±15)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗前均適應性喂養(yǎng)1周，室溫22～24 ℃，濕度55%～65%，自然光照，普通飼料投喂，自由進食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

一次性使用無菌針灸針(0.25 mm×40 mm)，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；丁苯酞氯化鈉注射液(規(guī)格100 mL:25 mg)，購自石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司。VEGF抗體試劑盒(Hzbscience，貨號HZ-VEGF-Ra)，購自上海澤葉生物科技有限公司；NGF抗體試劑盒(百奧萊博，貨號ARB11095)，購自北京百奧萊博科技有限公司； MBP抗體試劑盒(TargetMol，貨號TP1092)，購自上海廣銳生物科技有限公司；DYCP31DN聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 模型制備

大鼠腦缺血再灌注損傷模型參考改良Koizumi線栓法，通過尼龍線阻斷大腦中動脈，即可造成大鼠局灶性腦缺血[7]。具體制備方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，等待5～10 min觀察到大鼠腹式呼吸表明麻醉成功。將大鼠四肢綁在實驗臺上，仰臥位，頸部備皮，碘伏消毒，切開頸正中皮膚，鈍性分離頸部肌肉組織，暴露頸部血管，游離左側頸總動脈，穿入尼龍線結扎頸外動脈，動脈夾暫時夾閉主動脈，插入自制線栓至頸內動脈，插線深度約2 cm，遇到阻力即可。將缺血時間控制在2 h，抽出尼龍線線栓完成再灌注，將再灌注時間控制在24 h。假手術組除不結扎大腦中動脈外，麻醉、切開皮膚等步驟同上。模型組、藥物組、針刺組均按此方法制備腦缺血再灌注大鼠模型。

1.4 分組及干預方法

采用隨機數字表法將40只大鼠分為假手術組、模型組、藥物組、針刺組4組各10只。假手術組與模型組不給予任何治療措施，正常喂養(yǎng)。藥物組再灌注24 h后，腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液10 mg/(kg·d)，每日1次，7 d為1個療程。針刺組再灌注24 h后，給予通督調神針刺，每日1次，7 d為1個療程。具體針刺部位與方法參照大鼠穴位圖譜[8]，針刺“風池”“足三里”“曲池穴”“合谷穴”“三陰交”(見表1)。

表1 大鼠通督調神針刺穴位定位及針刺方法

1.5 神經功能評價

大鼠神經功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)計算標準：神經功能正常=0分，提起大鼠尾巴時左前肢屈曲(輕度缺損)=1分，大鼠行走時向左側轉圈(中度缺損)=2分，大鼠行走時向左側傾斜(重度缺損)=3分，大鼠不能自發(fā)行走、意識減退甚至喪失=4分，與缺血有關的死亡=5分[9]。模型制備后立即評分(治療前的評分)，1～3分表示腦缺血再灌注模型制備成功。各組大鼠在治療或喂養(yǎng)7 d后再次評分。

1.6 取材方法

NSS評分完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。每組取5只大鼠打開胸腔暴露心臟，4%多聚乙醛灌注，斷頭摘取大腦缺血組織制作石蠟切片，用于常規(guī)病理HE染色與免疫組化SP染色。每組取另外5只大鼠麻醉后直接斷頭取腦，大腦缺血組織勻漿用于Western blot檢測。

1.7 免疫組化法檢測VEGF、NGF、MBP蛋白表達

石蠟切片經500 mL抗原修復工作液處理后，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。免疫組化SP染色：以磷酸鹽緩沖液作為陰性對照，切片加入VEGF、NGF、MBP一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜。再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。再加入二氨基聯苯胺顯色液50 μL，染色5 min，切片置于顯微鏡下觀察。評價標準：細胞被染成棕黃色為陽性，計算每張切片的平均陽性細胞百分比[10]。

1.8 Western blot法檢測VEGF、NGF、MBP蛋白表達

取大鼠腦缺血組織200 μg，加入適量蛋白裂解液勻漿離心后取上清，加入適量磷酸鹽緩沖液調整所有大鼠組織樣本為相同濃度。加入VEGF、NGF、MBP一抗工作液(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。再加入二抗工作液，37 ℃孵育30 min，電泳、轉膜、脫色、曝光顯影。以β-actin為內參，使用Image J軟件測量目的蛋白相對灰度值。目的蛋白相對灰度值=目的蛋白/β-actin的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠治療前后NSS評分比較

模型組、藥物組、針刺組大鼠治療前NSS評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。藥物組、針刺組大鼠治療后NSS評分均明顯低于治療前(P<0.05)。藥物組大鼠治療后NSS評分明顯低于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠治療后NSS評分明顯低于模型組和藥物組(P<0.05)(見圖1)。

注：與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05；與治療前比較：△P<0.05圖1 各組大鼠治療前后神經功能缺損評分比較(Neurological Severity Scores，NSS)

2.2 各組大鼠腦缺血組織HE染色結果

假手術組大鼠腦缺血組織細胞層次整齊，結構完整，細胞核被染成紫藍色，細胞核形態(tài)完整，細胞質被染成紅色，胞漿豐富，染色均勻(圖2A)。模型組大鼠腦缺血組織細胞排列疏松，細胞腫脹，可見大量壞死細胞，細胞核固縮，核仁模糊，細胞質水腫，胞漿減少(圖2B)。藥物組大鼠腦缺血組織中正常形態(tài)細胞數目減少，細胞染色形態(tài)與模型組類似，與模型組比較，壞死細胞數目較少，部分細胞完整(圖2C)。針刺組大鼠腦缺血組織中正常形態(tài)細胞數目減少，細胞染色形態(tài)與模型組類似，與模型組比較，壞死細胞數目較少，出現膠質細胞與膠原纖維增生(圖2D)。

注：A.假手術組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組圖2 各組大鼠腦缺血組織HE染色比較(×100)

2.3 各組大鼠腦缺血組織VEGF表達比較

根據免疫組化染色測定VEGF表達的陽性細胞百分比，以及Western blot法測定VEGF表達的相對灰度值，結果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的VEGF表達高于假手術組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中VEGF表達高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中的VEGF表達高于模型組和藥物組(P<0.05)(見圖3、4)。

注：A.假手術組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組；與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖3 各組大鼠腦缺血組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫組化SP染色比較(×400)

注：與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖4 各組大鼠腦缺血組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)Western blot條帶比較

2.4 各組大鼠腦缺血組織NGF表達比較

根據免疫組化染色測定NGF表達的陽性細胞百分比，以及Western blot法測定NGF表達的相對灰度值，結果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的NGF表達高于假手術組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中的NGF表達高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中的NGF表達高于模型組和藥物組(P<0.05)(見圖5、6)。

2.5 各組大鼠腦缺血組織MBP表達比較

根據免疫組化染色測定MBP的陽性細胞百分比以及Western blot法測定MBP表達的相對灰度值，結果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的MBP表達低于假手術組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中的MBP表達高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中MBP表達高于模型組和藥物組(P<0.05)(見圖7、8)。

注：A.假手術組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組；與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖7 各組大鼠腦缺血組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)的免疫組化SP染色比較(×400)

注：與假手術組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖8 各組大鼠腦缺血組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)Western blot條帶比較

3 討論

腦缺血疾病屬于中風范疇，中醫(yī)認為大腦功能與五臟關系密切，心主神明，腦為髓海。中風的病機經絡辨證為督脈氣衰、陽氣不振，督脈痹阻則氣血滯留，血液運行不暢[11]。督脈為陽脈之海，總督諸陽，因此通督脈以調元神可達陰平陽秘、形神協調之功，輔以心包經穴位，進一步疏通經絡、醒腦開竅。本實驗選擇的通督調神針刺包含風池、足三里、曲池、合谷、三陰交5處穴位，風池主中風偏枯、少陽頭痛，乃風邪蓄積之所；曲池調和氣血、疏經通絡，主治半身不遂；合谷屬陽主表，宣通氣血；合谷升而能散；曲池走而不守；足三里調理肝脾，補益氣血；三陰交健脾和胃、調補肝腎、疏經通絡。有研究報道，通督調神針刺治療能有效改善患者腦組織低灌注區(qū)的腦血流量，疏經通絡，調和氣血[12，13]。上述經絡理論與腦缺血疾病的病理生理基礎相互聯系，可為針刺治療提供理論基礎。

腦缺血再灌注損傷是導致神經功能缺損的重要原因，其生物學機制可能與神經干細胞自由基增加、脂質過氧化、興奮性氨基酸毒性等有關[14，15]。腦缺血發(fā)生后，大腦血氧供給不足，神經細胞代謝的廢物堆積，產生炎癥細胞因子、趨化因子、氧自由基等，直接損傷神經細胞以及血管內皮細胞。本研究對腦缺血再灌注損傷大鼠實施通督調神針刺，結果顯示針刺組大鼠治療后NSS評分較治療前明顯降低，且低于模型組和藥物組，說明通督調神針刺能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能，減輕腦缺血再灌注損傷。與谷詩濃等[16]報道的通督調神針法可改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍，減少腦神經細胞凋亡，進而保護神經功能的研究結果一致。另外，藥物組大鼠給予丁苯酞氯化鈉注射液為陽性對照。國外研究顯示，丁苯酞可治療缺血性腦卒中，改善患者中樞神經功能損傷，具有較強的抗腦血栓作用，還能減輕腦水腫，改善缺血腦區(qū)的微循環(huán)，調節(jié)腦血流量、營養(yǎng)神經，促進患者神經功能損害的恢復[17，18]。一項實驗研究也發(fā)現，丁苯酞氯化鈉注射液能明顯縮小大鼠的腦缺血病灶，抑制神經細胞凋亡[19]。目前認為丁苯酞的藥理機制為靶向抑制環(huán)氧化酶，降低花生四烯酸水平，減少前列腺素的合成，減輕腦缺血再灌注后的炎癥反應以及氧化應激損傷，提高血管內皮功能，維持血腦屏障的穩(wěn)態(tài)。

本研究發(fā)現，模型組VEGF與NGF表達較假手術組升高，且治療后藥物組與針刺組VEGF與NGF表達升高更顯著。分析其原因可能VEGF是血管生成的重要誘導因子，VEGF的表達與血管內皮功能密切相關，受到一氧化氮等因子調控。既往研究報道，腦缺血缺氧會誘導VEGF表達，VEGF增加促進神經細胞修復[20，21]，與本研究結果中模型組VEGF表達升高一致。治療后藥物組與針刺組VEGF升高更顯著，可能是因為VEGF屬于血管生成誘導因子，在藥物或者針刺的治療下，VEGF升高能夠發(fā)揮神經細胞修復作用。NGF為促進神經細胞生長、發(fā)育、分化、修復的重要因子。本研究發(fā)現，模型組NGF表達上調，可能與發(fā)生神經細胞損傷時，NGF表達可負反饋性上升有關，NGF通過抑制毒性氨基酸、氧自由基釋放，減少細胞凋亡，從而阻止腦缺血再灌注損傷，減輕繼發(fā)的病理損害[22]。治療后藥物組、針刺組的NGF表達均明顯增加，提高了神經細胞損傷修復的速度，促進了神經細胞營養(yǎng)代謝。Chang等[23]研究探討針刺對神經再生的作用，也發(fā)現針刺能夠上調NGF等多種神經生長因子水平，促進神經保護和神經再生作用，增加腦血流量，調節(jié)氧化應激，減輕谷氨酸興奮毒性，維持血腦屏障完整性，抑制細胞凋亡。MBP是神經少突細胞和施萬細胞分泌的髓鞘蛋白質，主要功能為保護髓鞘，維持髓鞘功能穩(wěn)定，在正常神經細胞中MBP表達較高，而當發(fā)生腦損傷后MBP表達下降[24]，這可以解釋本研究中模型組大鼠MBP表達降低，模型組MBP水平變化與VEGF、NGF的變化不一致，可能與VEGF、NGF是促進血管或神經生成的誘導因子，而MBP屬于髓鞘蛋白質，其本身是神經細胞軸突結構之一有關。經過治療，藥物組、針刺組的MBP表達相比模型組有一定提高，但仍低于假手術組，說明通督調神針刺能夠上調MBP表達，促進腦缺血區(qū)的神經髓鞘組織再生。Meta分析也發(fā)現，督脈針刺可以通過調控MBP的表達誘導神經再生，從而起到治療缺血性腦病的作用[25]。

綜上所述，通督調神針刺能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能，具體機制可能與針刺上調VEGF、NGF、MBP表達進而營養(yǎng)神經、促進神經髓鞘組織再生有關。