外源性誘導(dǎo)原發(fā)性膽汁性膽管炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展

陳海洋張 瑋

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 感染科,上海 200032)

原發(fā)性膽汁性膽管炎( primary biliary cholangitis, PBC),又稱原發(fā)性膽汁性肝硬化,是一種慢性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病,其特征是肝內(nèi)小膽管破壞,門脈周圍炎癥、纖維化,最終導(dǎo)致肝硬化。PBC 的血清學(xué)特征是抗線粒體抗體( antimitochondrial antibody, AMA)陽(yáng)性,這是一種在約95%的PBC 患者中發(fā)現(xiàn)的高度疾病特異性抗體[1]。多個(gè)國(guó)家流行病學(xué)研究表明PBC 的總體發(fā)病率為8.55/100 萬(wàn)/年,患病率為118.75/100 萬(wàn)/年,我國(guó)目前無(wú)論是發(fā)病率還是患病率都要高出平均水平[2]。 國(guó)外流行病學(xué)顯示尿路感染、香煙、有毒廢棄物和工業(yè)地區(qū)等環(huán)境污染以及貧困等因素容易誘發(fā)本病[3-5]。 Chen 等[6]在對(duì)上海部分地區(qū)19012名居民抗線粒體抗體M2 亞型(anti-mitochondrial antibody subtype M2, AMA-M2)的篩選調(diào)查中發(fā)現(xiàn)住在垃圾填埋場(chǎng)和高架附近,吸煙以及使用染發(fā)劑等被認(rèn)為是危險(xiǎn)因素。 最新流行病學(xué)也顯示城市工業(yè)區(qū),環(huán)境污染和社會(huì)貧困地區(qū)人群的PBC 患病率較高[5]。 Probert 等[7]在垃圾填埋場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了可以抑制線粒體氧化磷酸化和誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞凋亡的化學(xué)物質(zhì),其結(jié)構(gòu)是一種類似硫辛酸的人肝細(xì)胞代謝產(chǎn)物,并且可以通過(guò)外源性脂酰化途徑在酶催化下與丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2 成分相結(jié)合。 多項(xiàng)研究顯示外源性化學(xué)藥物或異物可能通過(guò)修飾丙酮酸脫氫酶復(fù)合物E2 亞單位(pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit, PDC-E2)或其他自身抗原,導(dǎo)致自身免疫易感個(gè)體耐受性喪失從而誘發(fā)PBC 的發(fā)病[8-9]。 外源性誘導(dǎo)動(dòng)物模型更加類似環(huán)境因素對(duì)PBC 發(fā)病的影響,所以有必要對(duì)外源性誘導(dǎo)PBC動(dòng)物模型的方法和特點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)(見(jiàn)表1),以便根據(jù)研究目的選擇恰當(dāng)?shù)哪Ｐ汀?/p>

表1 不同外源性物質(zhì)誘導(dǎo)PBC 動(dòng)物模型總結(jié)Table 1 Summary of animal models of PBC induced by different exogenous substances

1 藥物誘導(dǎo)模型

1.1 2-辛炔酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(2-octynoic acid BSA conjugate, 2-OA-BSA)誘導(dǎo)模型

絕大多數(shù)PBC 患者都伴有不同程度的抗線粒體抗體反應(yīng),這些抗體識(shí)別的自身抗原是2-氧酸脫氫酶復(fù)合體(2-oxo-acid dehydrogenase complex, 2-OADC)的成員,特別是PDC-E2。 實(shí)際上,這些抗體也會(huì)與許多化學(xué)修飾過(guò)的類似物發(fā)生交叉反應(yīng)[9,24]。 2-辛炔酸(2-octynoic acid, 2-OA)不僅具有在體內(nèi)修飾PDC-E2 的潛力,而且重要的是,它被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中,包括香水、口紅等化妝品和許多常見(jiàn)的食品調(diào)味料中[9]。

Wakabayashi 等[10]首先使用外源性2-OA 與牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)偶合(100 μg/25 μL),對(duì)雌性C57BL/6 小鼠進(jìn)行免疫,成功誘導(dǎo)出類PBC 動(dòng)物模型。 造模方法:2-OA-BSA 與完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant complete, CFA)偶合,進(jìn)行首次腹腔注射,其后將2-OA-BSA 與不完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant incomplete, IFA)進(jìn)行偶合,每隔2 周對(duì)模型小鼠腹腔注射1 次,持續(xù)12～24 周。 模型特征:最早在免疫4 周后血清中即可檢測(cè)到PDC-E2 抗體陽(yáng)性并顯著升高,8 周即達(dá)100%。 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNFα)和干擾素γ(interferon-gamma, IFN-γ)在免疫4周后也顯著增高。 IL-4、IL-5 和IL-10 基本沒(méi)有變化。 組織學(xué)上免疫14 周后肝切片顯示門管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),小膽管損傷或消失,肝內(nèi)或見(jiàn)肉芽腫形成。 肝內(nèi)CD4/CD8T 細(xì)胞的比值降低,而CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。 Lleo 等[11]發(fā)現(xiàn)在PBC 患者中,受損膽管周圍的門管區(qū)也存在典型的CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。 雖然該模型有PBC 典型膽管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),但是纖維化改變和反映膽汁淤積程度的相關(guān)酶測(cè)定卻仍然存在缺陷。 然而,2-OA 可用于多種小鼠品系和轉(zhuǎn)基因小鼠[25-26],達(dá)到模型的理想病理改變,也表明2-OA 誘導(dǎo)模型的廣泛應(yīng)用前景,值得進(jìn)一步探索。

Wu 等[12]、Chang 等[13]發(fā)現(xiàn)半乳糖苷基神經(jīng)酰胺(α-GalCer)激活iNKT 細(xì)胞會(huì)加重匯管區(qū)炎癥反應(yīng)、膽管損傷、肉芽腫形成和肝纖維化發(fā)生的趨勢(shì)。所以Chang 等[14]修改造模的實(shí)驗(yàn)方案,除以上干預(yù)措施外,另加α-GalCer 用0.5%吐溫20 溶解成0.2 mg/mL,取10 μL 分別于第1、2、3 次免疫接種的前1 d 靜脈注射至小鼠體內(nèi)。 方案修改后造模小鼠在免疫4 周后即出現(xiàn)更加明顯的門脈炎癥、膽管損傷。更為欣喜的是修正后12 周的模型可提高AMA 產(chǎn)生,肉芽腫形成和肝纖維化改變征象。 Zeng 等[27]、Miyake 等[28]根據(jù)這種免疫小鼠模型還發(fā)現(xiàn)iNKT細(xì)胞和自身抗體的關(guān)系也具有一致性。 這個(gè)發(fā)現(xiàn)說(shuō)明不僅適應(yīng)性免疫參與PBC 的發(fā)展,而且先天性免疫在本病的發(fā)生發(fā)展中也起著重要的作用。

1.2 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyinosinicpolycytidylic acid , polyI:C)誘導(dǎo)模型

PolyI:C 是一種干擾素誘導(dǎo)劑,觸發(fā)I 型干擾素(IFN-1)的產(chǎn)生和下游IFN-α/β 受體依賴信號(hào)通路,通過(guò)打破人體耐受性促進(jìn)后續(xù)自身免疫反應(yīng)[29-31]。 持續(xù)產(chǎn)生IFN-1 會(huì)使免疫系統(tǒng)幾乎所有成分轉(zhuǎn)向病理功能,導(dǎo)致組織損傷和疾病[32]。 許多系統(tǒng)性自身免疫性疾病患者有持續(xù)產(chǎn)生IFN-1 的跡象,并顯示IFN-α 調(diào)控基因表達(dá)增加[33-34]。 此外,多個(gè)病例報(bào)道在沒(méi)有自身免疫性疾病的情況下使用干擾素治療期間患者出現(xiàn)了自身免疫性肝炎的臨床和病理特征[35-37]。 提示IFN 系統(tǒng)在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

Okada 等[15]使用IFN-1 的誘導(dǎo)劑polyI:C 建立自身免疫性膽管炎動(dòng)物模型。 造模方式:6 ～8 周的雌性C57BL/6 小鼠,每周腹腔注射2 次polyI:C,以5 mg/kg 為造模最佳濃度,連續(xù)造模28 周,成功建立PBC 小鼠模型。 模型特點(diǎn):造模8 周后組織學(xué)可見(jiàn)膽管損傷,膽管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,門管區(qū)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量在造模16 周達(dá)到最高,此后基本穩(wěn)定維持這一水平。 模型小鼠血清在8 周后可以檢測(cè)到自身抗體,到24 周后87%的模型小鼠可檢測(cè)AMA。 此外,IFN-α 在造模4 周已經(jīng)高表達(dá),但到16周后開始降低,24 周處于較低的狀態(tài)。 Hanada等[38]認(rèn)為IFN-β 和IFN-α 可以直接破壞膽管細(xì)胞緊密連接的屏障功能,通過(guò)改變膽管細(xì)胞旁路途徑來(lái)增加膽管細(xì)胞通透性。 然而Stewart[16]認(rèn)為降低干擾素會(huì)減少自身抗體和組織免疫損傷,IFN-α 低表達(dá)的情況下,IFN-β 也會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)。 奇怪的是這種現(xiàn)象與病理進(jìn)展相互矛盾,可能是因?yàn)槠渌?xì)胞因子對(duì)干擾素的調(diào)節(jié)所致,至于具體內(nèi)在聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。

1.3 2OA-BSA 聯(lián)合polyI:C 誘導(dǎo)模型

Ambrosini 等[17]認(rèn)為2OA-BSA 誘導(dǎo)的PBC 模型肝纖維化的病理特征不符合后期肝纖維化的病理征象,所以在此基礎(chǔ)之上聯(lián)合polyI:C,達(dá)到了較好的效果。 造模方法:在首次2OA-BSA 聯(lián)合CFA腹腔注射誘導(dǎo)后每3 d 加用5 mg/kg 劑量的polyI:C,干預(yù)8 周后處死小鼠。 和2OA-BSA 誘導(dǎo)模型相比有以下異同。 相同:兩者肝組織有相同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、肉芽腫形成和膽管損傷。 兩者產(chǎn)生的抗體和CD4+T 細(xì)胞水平相當(dāng)。 不同點(diǎn):聯(lián)合polyI:C 誘導(dǎo)的模型Th1 細(xì)胞因子、IL-12、IFN-γ 和TNF-α增多,CD8+T 細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量增多,門脈匯管區(qū)炎癥和纖維化形成明顯,此外造模時(shí)間只需要8 周。 但是polyI:C 可有效激活免疫系統(tǒng),聯(lián)合使用后促使造成嚴(yán)重的腹腔炎癥,提高了動(dòng)物死亡率。polyI:C 在2OA 免疫誘導(dǎo)下進(jìn)行二次免疫,證實(shí)PBC 如同其他自身免疫性疾病一樣,屬于多系統(tǒng)協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)。

2 抗原誘導(dǎo)模型

2.1 微生物誘導(dǎo)模型

流行病學(xué)研究表明PBC 與復(fù)發(fā)性尿路感染有關(guān)[39-40]。 Selmi 等[41]發(fā) 現(xiàn) PBC 患 者 血 清 對(duì)

(Novosphingobiumaromaticivorans,N.aromaticivorans) 的反應(yīng)活性比對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli,E. coli)要高出100～1000 倍。 其后又進(jìn)一步將N. aromaticivorans、E. coli等多種細(xì)菌的PDC-E2 內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)前者與人類的PDC-E2 具有最高的同源性,并且在對(duì)比幾種細(xì)菌誘導(dǎo)PBC 模型特點(diǎn)后,認(rèn)為N. aromaticivorans比之前提出的E. coli、螺桿菌(Helicobacter species, Hp)要更可能誘導(dǎo)PBC 的發(fā)病[42]。

Mattner 等[18]使用N. aromaticivorans打破免疫耐受造出具有顯著自身免疫特點(diǎn)的PBC 小鼠模型。造模方法如下:制備N. aromaticivorans細(xì)菌懸液(每100 μL 含有5×107個(gè))。 分別于第1 天和第14 天將細(xì)菌懸液靜脈注射到4 ～20 周非肥胖型糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠體內(nèi)進(jìn)行活體感染。 模型特點(diǎn):活體感染1 個(gè)月后小鼠肝脾質(zhì)量較前增加; 主要組織相容性復(fù)合體( major histocompatibility complex, MHC)II 類分子在受損小膽管的表達(dá);可見(jiàn)嚴(yán)重的門脈浸潤(rùn)和膽管損傷,并伴有部分纖維化改變。 這種表現(xiàn)在感染E. coli的小鼠肝組織中未發(fā)現(xiàn)。 造模6 個(gè)月后門脈炎癥、膽管損傷和肉芽腫形成相比E. coli感染要具有明顯差異。 血清檢測(cè)表明感染2 周后小鼠即出現(xiàn)PDCE2 和AMA 的聚集,伴有T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)小膽管的現(xiàn)象,并持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間高水平的IgG。 盡管如此,這種模型卻未出現(xiàn)與人類PBC 發(fā)展進(jìn)程中相似的肝纖維化表現(xiàn)。 但有研究表明這種肝纖維化改變不明顯可能是由于NOD 遺傳背景之下IFN 的高表達(dá)[43]。 這也提示PBC 疾病的發(fā)生可能與某種遺傳易感性基因有關(guān)。 Wang 等[19]分別用E. coli和N.aromaticivorans感染NOD 小鼠建立PBC 模型,發(fā)現(xiàn)E. coli感染小鼠會(huì)導(dǎo)致更加明顯的膽管炎癥損傷并且產(chǎn)生更高濃度的AMA,然而與PBC 患者血清相比,E. coli感染小鼠對(duì)PDC-E2 的血清學(xué)抗體反應(yīng)卻相對(duì)較弱[44],盡管如此Wang 認(rèn)為在感染E. coli的早期足以打破免疫耐受并導(dǎo)致類似于PBC 的肝病理表現(xiàn)。

2.2 抗線粒體抗體抗原(AMA 抗原)誘導(dǎo)模型

英國(guó)的一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)檢出M2 抗體陽(yáng)性的無(wú)癥狀患者在出現(xiàn)PBC 癥狀和體征之前,時(shí)間間隔長(zhǎng)達(dá)10 余年之久[45]。 目前依靠常規(guī)使用的血清AMA 檢測(cè),其特異性和敏感性還不夠,仍有一部分病人出現(xiàn)漏診[46]。 所以提高對(duì)PBC 診斷的敏感性顯得尤為重要。 Kikuchi[47]和Miyakawa 等[48]將AMA 反應(yīng)的主要自身抗原克隆并鑒定為2-氧代酸脫氫酶復(fù)合體家族成員:丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2(PDC-E2), 支鏈 2-氧代酸脫氫酶復(fù)合體-E2(BCOADC-E2) 和2-氧戌二酸脫氫酶復(fù)合體-E2(OGDC-E2)。 并且也發(fā)現(xiàn)有些患者的血清與BCOADC-E2 和OGDC-E2 是可以反應(yīng)的。 多年前Moteki 等[49]將牛、大鼠和人類線粒體抗原的混合物,即3 個(gè)不同支鏈結(jié)構(gòu)域雜交克隆,命名為pMLMIT3,用于PBC 病人檢測(cè)發(fā)現(xiàn)可以明顯提高檢出率。

Jiang 等[20]根據(jù)基因工程的方法將人源靶抗原連接加工后獲得重組抗原蛋白三聯(lián)體(重組AMA抗原),據(jù)此成功模擬PBC 模型[21]。 造模方法:每只小鼠(C57BL/6)一次腹腔注射重組抗原蛋白三聯(lián)體100 μg/200 μL。 模型特點(diǎn):在免疫66 周后病理顯示肝小葉無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死表現(xiàn),并且可見(jiàn)匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和小膽管損傷。血清中AMA-M2 抗體陽(yáng)性率達(dá)100%,并且谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBil)無(wú)明顯變化,以上特征與早期PBC 相似。 此外具有肝特異性,靈敏度高,已嘗試投入臨床用于輔助PBC 疾病的篩查[22]。Miyakawa 等[50]通過(guò)克隆人源cDNA 利用新開發(fā)的酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)表達(dá)重組蛋白,用于PBC 陰性病人的檢測(cè),有90%與至少1 個(gè)重組蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)。

2.3 膽管蛋白(bile duct protein, BDP)誘導(dǎo)模型

根據(jù)PBC 發(fā)病的典型特征,Ma 等[23]通過(guò)同源BDP 免疫誘導(dǎo)方式建立PBC 小鼠模型。 造模方法:8～12 周齡小鼠(C57BL/6)通過(guò)門靜脈灌注原位膠原酶IV,10 min 后剪裁肝,用軟牙刷刷去肝細(xì)胞,直到可見(jiàn)整個(gè)膽管樹。 將膽管樹置于原位膠原酶IV中震蕩10 min,分離粘附的肝細(xì)胞。 在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌3 次后,將膽管樹置于PBS,制備膽管細(xì)胞蛋白勻漿,并進(jìn)行蛋白定量。 將4 mg/mL的BDP 與CFA 等體積乳化,完全乳化后,取BDPCFA 乳劑在小鼠背部多點(diǎn)皮下注射,每周1 次,免疫3 次。 隨后將BDP 與IFA 乳化,BDP-IFA 乳劑僅在最后一次免疫中使用,BDP-IFA 處理1 周后處死小鼠,進(jìn)行分析。 模型特點(diǎn):在病理中發(fā)現(xiàn)門靜脈匯管區(qū)膽管周圍嚴(yán)重的肝特異性炎癥,肝和脾中CD4+T 和CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量和激活狀態(tài)增加。 以及由T 細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞組成的樹突狀細(xì)胞在肝和脾的數(shù)量也有所增加。 此外,該模型中脾的生發(fā)中心反應(yīng)更強(qiáng)。 血清中AMAs 100%陽(yáng)性,并增加了血清中的AMAs,包括抗PDC-E2、BCOADC-E2 和OGDC-E2。 該模型的建立主要依賴于膽管抗原,而在人類中,膽管抗原再次表明分子擬態(tài)參與觸發(fā)或促進(jìn)PBC 發(fā)病。

3 討論與展望

除了臨床樣本、環(huán)境研究、體外實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)數(shù)據(jù)外,動(dòng)物模型是理解和尋找PBC 臨床方案不可或缺的工具。 到目前為止,PBC 的發(fā)病機(jī)制仍然不夠清晰,只是對(duì)該疾病發(fā)展過(guò)程和預(yù)后有一定了解。 熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是唯一經(jīng)FDA 認(rèn)證的一線藥物[51],但也只能改善患者膽汁淤積的狀態(tài),無(wú)法根本治愈。 在實(shí)際臨床中有高達(dá)30%的PBC 患者對(duì)UDCA 應(yīng)答欠佳,應(yīng)答欠佳不僅會(huì)提高并發(fā)癥的發(fā)生率,更容易進(jìn)展為肝硬化,甚至需要肝移植,這類患者是快速發(fā)展至晚期肝病的高風(fēng)險(xiǎn)人群[52-54]。 臨床二線貝特類藥物聯(lián)合UDCA 也僅僅可以改善血清相關(guān)指標(biāo),與單獨(dú)使用UDCA 相比,對(duì)癥狀和死亡率的影響并沒(méi)有顯著差異[55]。 因此,當(dāng)務(wù)之急在于盡早探明本病的發(fā)病機(jī)制以研發(fā)更適合PBC 的新藥。

目前建立的動(dòng)物模型只能模擬PBC 某一病理階段,還不能完整模擬其病理過(guò)程。 人體生活在復(fù)雜環(huán)境中,自身免疫性疾病是環(huán)境多因素刺激和遺傳因素導(dǎo)致免疫耐受破壞所致。 以上構(gòu)建的小鼠模型各有特點(diǎn),啟示我們單因素造模方法只能擬合出接近PBC 某一階段病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型,聯(lián)合使用比如2OA-BSA 聯(lián)合polyI:C 可以較好提高動(dòng)物模型擬合度。 對(duì)于這種病理過(guò)程復(fù)雜的疾病模型應(yīng)該打破傳統(tǒng)單因素造模思路,從多因素(不局限外源性誘導(dǎo))考慮,或者結(jié)合肝纖維化、肝硬化疾病動(dòng)物模型造模方法,采取復(fù)合多因素造模方法,探索出更加符合人類PBC 發(fā)病特點(diǎn)的動(dòng)物模型。