ORMDL3 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在中性粒細(xì)胞哮喘中的作用機(jī)制研究

王龍梅孫永顯張新鵑陳曉艷

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,西醫(yī)教學(xué)部,山東 煙臺(tái) 264199)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道炎癥性疾病,過去的研究認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是哮喘發(fā)病過程中氣道炎癥反應(yīng)的主要原因,近些年的研究認(rèn)為超過50%的哮喘以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,中性粒細(xì)胞哮喘的臨床表現(xiàn)及肺功能均較嗜酸性粒細(xì)胞哮喘更差[1-2],但關(guān)于中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。 有研究報(bào)道,在哮喘發(fā)病過程中,氣道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及細(xì)胞自噬均過度激活,ERS 介導(dǎo)細(xì)胞自噬激活、自噬標(biāo)志基因Beclin-1 表達(dá)增加且LC3-I向LC3-II 轉(zhuǎn)化,可能引起氣道上皮損傷、增加氣道反應(yīng)性[3-4]。

ORMDL3 ( ORMDL sphingolipid biosynthesis regulator 3)基因是新發(fā)現(xiàn)的哮喘易感基因,定位于17q21 染色體區(qū),主要的生物學(xué)功能包括調(diào)控ERS及細(xì)胞自噬等[5-6]。 ERS 相關(guān)的信號(hào)通路包括蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK ) 通 路、 肌 醇 酶 1 ( inositolrequiringenzyme1,IRE1) 通 路、 活 化 轉(zhuǎn) 錄 因 子6(activating transcription factor,ATF6) 通 路, 其 中ORMDL3 重要通過ATF6 通路實(shí)現(xiàn)對(duì)ERS 的調(diào)控。但ORMDL3 在中性粒細(xì)胞哮喘發(fā)病中的作用是否與ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬有關(guān)尚不明確。 因此,本研究將通過一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來闡明ORMDL3 通過ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在中性粒細(xì)胞哮喘發(fā)病中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD 大鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[SCXK(滬)2018-0006],共72 只,SPF 級(jí),8 ～10 周齡,體重180 ～200 g。 飼養(yǎng)單位為山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校[SYXK(魯)2019-0051]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ktyd-2019-023),實(shí)驗(yàn)過程遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖(LPS,批號(hào)L2880)、卵白蛋白(OVA,批號(hào)A5253)(Sigma 公司,美國(guó));ORMDL3-siRNA 慢病毒、陰性對(duì)照(negative control,NC)-siRNA 慢病毒(吉?jiǎng)P公司,上海),滴度均為1×109TU/mL;ERS 激動(dòng)劑毒胡蘿卜素(批號(hào)HY-13433,MCE 公司,美國(guó)); ORMDL3 (批 號(hào) ab211522)、 PERK (批 號(hào)ab229912)、IRE1α(批號(hào)ab37073)、ATF6 (批號(hào)ab122897)、Beclin-1(批號(hào)ab207612)、LC3(批號(hào)ab192890)一抗(Abcam 公司,美國(guó))。

小動(dòng)物肺功能儀(新行興業(yè)科貿(mào)公司,北京);正置顯微鏡(Nikon 公司,日本);凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-rad 公司,美國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(勤翔公司,上海)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及干預(yù)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為兩部分,第1 部分研究ORMDL3在中性粒細(xì)胞哮喘中的作用,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、模型+NC-siRNA 組、模型+ORMDL3-siRNA 組,后3 組進(jìn)行中性粒細(xì)胞哮喘模型制備:第1、7、14 天時(shí)給予0.1 μg LPS 滴鼻、100 μg OVA 腹腔注射,第15 天起給予10 g/L OVA 霧化吸入激發(fā)、每天1 次、每次30 min、連續(xù)14 d。 模型+NC-siRNA組、模型+ORMDL3-siRNA 組在第15 天、即OVA 激發(fā)前進(jìn)行干預(yù), 分別給予NC-siRNA 慢病毒、ORMDL3-siRNA 慢病毒50 μL 經(jīng)氣道注入。

第2 部分研究ERS 在ORMDL3 參與中性粒細(xì)胞哮喘中的作用,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組、模型+溶劑組、模型+NC-siRNA+溶劑組、模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組、模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組,造模方法和慢病毒注射方法同第1 部分,模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組第15 天起,給予300 ng/kg 毒胡蘿卜素腹腔注射、每天1 次,其余各組給予等劑量溶劑腹腔注射、每天1 次。

1.3.2 氣道功能檢測(cè)

末次激發(fā)后24 h,采用小動(dòng)物肺功能儀連接,測(cè)定0.2 s 用力呼氣容積(FEV0.2)占用力肺活量(FVC) 的比值,FEV0.2/FVC 以及呼氣峰流速(PEF)。

1.3.3 肺組織病理改變檢測(cè)

完成氣道功能檢測(cè)后,處死大鼠并收集適量肺組織,生理鹽水清洗后4%多聚甲醛固定,制作病理切片后采用HE 染色試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按照試劑盒說明書進(jìn)行染色并在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.3.4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

另取適量肺組織,采用組織裂解液進(jìn)行勻漿、提取組織蛋白,檢測(cè)蛋白濃度并取30 μg 蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠,電泳分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至NC 膜,4℃孵育1 ∶ 1000 稀釋的ORMDL3、PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 一抗或1 ∶2500 稀釋的β-actin 一抗16 ～24 h,室溫孵育1 ∶2000 稀釋的二抗1 h,最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶,根據(jù)條帶吸光值、 以 β-actin 為 內(nèi) 參, 計(jì) 算 ORMDL3、 PERK、IRE1α、ATF6、Beclin-1、LC3 的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件及Prism 6.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及制圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的資料進(jìn)一步采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織中ORMDL3表達(dá)的變化及注射慢病毒敲低ORMDL3 的效果

模型組大鼠肺組織中ORMDL3 的表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組肺組織中ORMDL3 的表達(dá)水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 組肺組織中ORMDL3的表達(dá)水平較模型+NC-siRNA 組降低(P＜0.05)。見圖1。

注:與對(duì)照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.2 敲低ORMDL3 對(duì)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠氣道功能的影響

模型組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較對(duì)照組降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA 組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水 平 較 模 型+NC-siRNA 組 升 高(P＜0.05)。 見圖2。

注:與對(duì)照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.3 敲低ORMDL3 對(duì)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織病理改變的影響

對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常、未出現(xiàn)病理改變;模型組、模型+NC-siRNA 組均出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔變窄等病理改變;模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+NC-siRNA+溶劑組改善;模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組加重。 見圖3。

圖3 4 組大鼠肺組織病理改變的比較(HE 染色)Figure 3 Comparison of pathological changes of lung tissue among four groups (HE staining)

2.4 敲低ORMDL3 對(duì)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織中ERS 標(biāo)志基因表達(dá)的影響

模型組大鼠肺組織中PERK、IRE1α、ATF6的表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0. 05),模型+NCsiRNA 組肺組織中PERK、IRE1α、ATF6 的表達(dá)水平較模型組無明顯變化(P＞0. 05),模型+ORMDL3-siRNA 組肺組織中ATF6 的表達(dá)水平較模型+NC-siRNA 組 降 低(P＜0. 05)、PERK 及IRE1α 的表達(dá)水平較模型+NC-siRNA 組無明顯變化(P＞0. 05)。 見圖4。

注:與對(duì)照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.5 敲低ORMDL3 對(duì)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織中自噬標(biāo)志基因表達(dá)的影響

模型組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA組肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較模型組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA組肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較模型+NC-siRNA 組降低(P＜0.05)。 見圖5。

注:與對(duì)照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA 組相比,#P＜0.05。

2.6 ERS 激動(dòng)劑對(duì)敲低ORMDL3 改善中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠氣道功能的影響

模型+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較溶劑對(duì)照組降低(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型+溶劑組無變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的FEV0.2/FVC、PEF 水平較模型+NC-siRNA 組+溶劑組升高(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組大鼠的FEV0.2/FVC、 PEF 水平較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組降低(P＜0.05)。 見圖6。

注:與溶劑對(duì)照組相比,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA+溶劑組相比,#P＜0.05;與模型+ ORMDL3-siRNA+溶劑組相比,＆P＜0.05。

2.7 ERS 抑制劑對(duì)敲低ORMDL3 改善中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織病理改變的影響

溶劑對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常、未出現(xiàn)病理改變;模型+溶劑組、模型+NC-siRNA 組+溶劑組均出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管管壁及平滑肌、基底膜增厚,管腔變窄等病理改變;模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+NC-siRNA 組+溶劑組改善;模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組大鼠的肺組織病理改變較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組加重。 見圖7。

圖7 5 組大鼠肺組織病理改變的比較(HE 染色)Figure 7 Comparison of pathological changes of lung tissue among five groups (HE staining)

2.8 ERS 抑制劑對(duì)敲低ORMDL3 抑制中性粒細(xì)胞哮喘模型小鼠肺組織自噬的影響

模型+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較溶劑對(duì)照組升高(P＜0.05),模型+NC-siRNA 組+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較模型+溶劑組無明顯變化(P＞0.05),模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較模型+NC-siRNA 組+ 溶劑組降低(P＜0.05),模型+ORMDL3-siRNA+激動(dòng)劑組大鼠肺組織中Beclin-1、LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平較模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組升高(P＜0.05)。 見圖8。

注:與溶劑對(duì)照組比較,*P＜0.05;與模型+NC-siRNA+溶劑組比較,#P＜0.05;與模型+ORMDL3-siRNA+溶劑組比較,＆P＜0.05。

3 討論

中性粒細(xì)胞哮喘是哮喘的獨(dú)立亞型,臨床癥狀重、激素治療反應(yīng)差且機(jī)制未完全闡明。 ORMDL3基因?qū)儆贠RM 家族、定位于17q21 染色體區(qū),是哮喘易感基因;該家族另兩個(gè)成員分別是ORMDL1 及ORMDL2,分別定位于2q32 和12q13.2 染色體區(qū),未見其與哮喘相關(guān)的報(bào)道。 本研究采用LPS+OVA致敏、OVA 激發(fā)的方式建立了中性粒細(xì)胞哮喘模型,模型大鼠出現(xiàn)了哮喘典型的氣流受限、肺組織病理改變,且肺組織中ORMDL3 表達(dá)增加,表明中性粒細(xì)胞哮喘模型制備成功且ORMDL3 高表達(dá)與中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病有關(guān)。 進(jìn)一步在OVA 激發(fā)誘導(dǎo)哮喘前通過注射ORMDL3-siRNA 慢病毒的方式敲低ORMDL3 的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低ORMDL3 的表達(dá)能夠改善哮喘大鼠的氣道功能及肺組織病理改變,表明ORMDL3 表達(dá)增加與中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病有關(guān)。

ORMDL3 具有多樣的生物學(xué)功能,有研究報(bào)道ORMDL3 在脾細(xì)胞[7]、β 細(xì)胞[8]、白細(xì)胞[9]中參與ERS 的調(diào)控。 ERS 是一種病理刺激下未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng),由PERK、 IRE1α、 ATF6 進(jìn) 行 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo), 其 中ORMDL3 主要通過ATF6 通路激活ERS。 已有研究報(bào)道,在哮喘發(fā)病過程中存在ERS 過度激活[10-12],本研究也證實(shí)模型大鼠肺組織中3 種ERS 標(biāo)志基因的表達(dá)水平均明顯增加,與既往文獻(xiàn)關(guān)于ERS 與哮喘的報(bào)道一致[10-12]。 在注射慢病毒敲低ORMDL3 后,哮喘大鼠肺組織ATF6 的表達(dá)水平降低,而PERK、IRE1α 的表達(dá)水平無明顯變化,表明ORMDL3 參與ERS 中ATF6 通路的調(diào)控,高表達(dá)的ORMDL3 可能通過激活ERS 的ATF6 通路參與哮喘發(fā)病,阻斷ORMDL3 抑制哮喘發(fā)病過程中ERS 的ATF6 通路并起到治療作用。

ERS 在哮喘發(fā)病過程中的作用復(fù)雜,心腦血管相關(guān)的研究證實(shí)ERS 是自噬的上游調(diào)控機(jī)制[13-14]。自噬是細(xì)胞內(nèi)各種基質(zhì)及細(xì)胞器通過溶酶體系統(tǒng)發(fā)生降解的過程,適度自噬有利于細(xì)胞在壓力環(huán)境下存活,但過度激活的自噬會(huì)引起細(xì)胞損傷。 在哮喘發(fā)病過程中自噬過度激活,使用自噬抑制劑能夠改善哮喘大鼠的氣道功能[15-16]。 本研究在模型大鼠肺組織中檢測(cè)到自噬標(biāo)志基因Beclin-1 及LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平增加,敲低ORMDL3 后Beclin-1及LC3-II/LC3-I 的表達(dá)水平降低,表明高表達(dá)的ORMDL3 在哮喘發(fā)病過程中參與自噬的激活。 為了進(jìn)一步闡明ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在ORMDL3 參與中性粒細(xì)胞哮喘中的作用,本研究在敲低ORMDL3 后給予ERS 激動(dòng)劑毒胡蘿卜素干預(yù),通過毒胡蘿卜素激活ERS 后,敲低ORMDL3 改善氣道功能、肺組織病理改變及抑制細(xì)胞自噬的作用發(fā)生逆轉(zhuǎn),表明ORMDL3 參與中性粒細(xì)胞哮喘的作用與ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬有關(guān),阻斷ORMDL3 抑制哮喘發(fā)病過程中ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞自噬并起到治療作用。

綜上所述,在中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病中,ORMDL3 參與ERS 及細(xì)胞自噬的調(diào)控,高表達(dá)的ORMDL3 通過ERS 的ATF6 通路激活細(xì)胞自噬,進(jìn)而引起氣流受限、肺組織病理改變。 將來;阻斷ORMDL3 通過抑制ERS ATF6 通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬改善氣流受限、肺組織病理改變,有望成為治療中性粒細(xì)胞哮喘的可能靶點(diǎn)。