LncRNA SNHG1下調miR-195-5p改善軟骨細胞凋亡和炎癥微環(huán)境

劉百奇 車德馨 侯慶露 王典 徐東輝

齊齊哈爾市第一醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005

骨性關節(jié)炎(OA) 是一種由多因素相互作用導致關節(jié)軟骨完整性受損，累及軟骨下骨和關節(jié)邊緣骨贅形成的關節(jié)疾病[1]。其發(fā)病機制與軟骨細胞中炎性因子過度釋放營造的炎性微環(huán)境和細胞凋亡有關[2]。目前尚無治愈OA的方法，通過尋找OA相關的病理調控基因，探索OA病程中潛在的分子靶目標，有助于找到OA的分子治療途徑。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)參與多種生物學過程，如細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應等[3-4]。小核仁RNA宿主基因1 (SNHG1)是一種位于染色體11q12.3的新型lncRNA。研究表明，SNHG1的功能障礙與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，如骨肉瘤、骨肉瘤、結直腸癌、肝癌等[5-6]。在一些疾病中，SNHG1能夠與某些miRNAs結合調控基因的表達[7-8]。長鏈非編碼RNA-微小RNA(LncRNA-miRNA)高度參與機體生理病理的分子調控網絡，LncRNA作為上游主導基因，充當miRNA負調節(jié)的分子海綿，參與OA等疾病的進展[9-10]。研究表明SNHG1通過激活miR-16-5p介導的p38 MAPK和NF-κB信號通路，能緩解IL-1β-誘導的OA炎癥[11]。這提示SNHG1可能參與OA發(fā)生、發(fā)展的過程。

miR-195-5p在OA患者關節(jié)軟骨組織和LPS刺激的ATDC5細胞中均顯著上調，miR-195-5p抑制劑通過調控Wnt/βcatenin和NF-κB信號通路，抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應，對OA具有保護作用[12]。多項研究中miR-195-5p被證明受LncRNA SNHG12或XIST調控，在骨肉瘤的分子機制中發(fā)揮調節(jié)作用[13-14]。我們在starbase數據庫中發(fā)現SNHG1和miR-195-5p二者存在潛在靶向位點。有報導稱SNHG1和miR-195-5p在肝細胞癌與結直腸癌中存在靶向調控關系[15]。Zhang等[16]報道了SNHG1通過抑制miR-195-5p的表達來抑制肝細胞癌細胞的增殖、侵襲和轉移。目前尚未有文獻報道二者在OA病理機制中作用，我們猜想存在SNHG1-miR-195-5p調控介導軟骨細胞的凋亡與炎性微環(huán)境，報道如下。

1 材料和方法

1.1 軟骨組織標本收集

在2017年10月至2019年10月期間，共收集OA及非OA患者標本各52例，OA患者年齡(58.9±5.3)歲，包括30例男性，22例女性。非OA患者年齡(59.3±4.8)歲，包括28例男性，24例女性。納入標準：年齡18～65歲，參照2003年美國風濕病學院(ACR)診斷。排除標準：合并惡性腫瘤及其他骨關節(jié)病，存在感染、妊娠及哺乳期，合并嚴重肢體功能障礙者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 軟骨細胞培養(yǎng)、轉染和OA細胞模型的建立

購買人軟骨細胞C-28 / I2(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院)，培養(yǎng)于含有10 %PBS的DMEM培養(yǎng)基(上?？道噬锟萍加邢薰?中，在37 ℃，5 % CO2的環(huán)境下進行培養(yǎng)。采用Lipofectamine? 2000試劑盒(杭州沃森生物技術有限公司)對軟骨細胞進行轉染，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。其中，主要轉染物有SNHG1過表達質粒即促進劑(SNHG1)、空載體質粒(pcDNA3.0)、miR-195-5p抑制劑(inhibitor)、miR-195-5p模擬物(miR-195-5p)、miR陰性對照(miR-NC)(廣州復能基因有限公司)。轉染24 h后，通過RT-qPCR驗證轉染效率。OA模型建立[17]，是將細胞置于5 μg/mL脂多糖(LPS)(上海恒渡生物科技有限公司)環(huán)境中，37 ℃干預5 h。未進行LPS干預的細胞作為對照。

1.3 動物模型的建立

采購SD大鼠[雌性，體重(225±25)g](上海弗爾博生物科技有限公司)，依據飼養(yǎng)標準進行飼養(yǎng)，經本院動物保護委員會批準。改良Hulth法建立OA大鼠模型[18]，在全麻下，經膝內側切口，打開關節(jié)腔，切斷前交叉韌帶并切除內側半月板等步驟，通過內、外側應力試驗和前抽屜試驗來驗證手術是否成功。對照組為假手術組，只打開關節(jié)腔。術后強迫大鼠活動，術后3周對模型組大鼠關節(jié)內分別注射SNHG1促進劑(SNHG1)、miR-195-5p抑制劑(inhibitor)(60 mg / kg體重，持續(xù)3 d)，單純模型組與對照組注射生理鹽水。大鼠分為對照組(n=10)、模型組(n=10)、模型組基礎上SNHG1干預組(SNHG1，n=10)、模型組基礎上inhibitor干預組(inhibitor，n=10)。最后一次注射后2周，對大鼠施行安樂死，收集軟骨組織。

1.4 實時定量PCR

Trizol試劑(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取細胞中的總RNA，以反轉錄試劑盒(北京杰輝博高生物技術有限公司)進行反轉錄，轉錄后對合成的互補DNA進行擴增。引物設計(無錫懷信生物醫(yī)藥科技有限公司)。mRNA使用β-Actin作內參，miRNA使用U6作為內參，相對表達量以2-△△Ct進行分析。

1.5 細胞凋亡檢測

收集轉染后軟骨細胞，經PBS(北京華邁科生物技術有限責任公司)洗滌后添加了含FITC(2 μL)(上海金穗生物科技有限公司)與PI(5 μL)(北京凱瑞基生物科技有限公司)500 μL的結合緩沖液并放置于陰暗環(huán)境中，1 h后流式細胞儀(北京安麥格貿易有限公司)測量細胞凋亡率。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

通過ELISA試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)測定人軟骨細胞、大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α，嚴格按照操作說明書進行，最后實用酶標儀(北京安麥格貿易有限公司)在450 nm處測量吸光度。

1.7 細胞增殖檢測

以MTT試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進行檢測，先接種細胞于96孔板(密度：5×104個細胞/孔)，在不同孵育時間向每孔添加20 μL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，接著逐個孔混入150 μL的DMSO，震蕩10 min，最后酶標儀在450 mm的波長下測量吸光度值。

1.8 蛋白質印跡分析

通過RIPA緩沖液(北京欣華綠源科技有限公司)分離細胞組織中的蛋白，經10 %SDS-PAGE(南京恩晶生物科技有限公司)電離后轉PVDF膜(北京凱瑞基生物科技有限公司)，使用封閉液(上海恒斐生物科技有限公司)封閉1 h。再使一抗與膜在4 ℃溫育過夜，一抗包括IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Bax、Bcl-2以及β-Actin(北京百奧萊博科技有限公司)。將樣品與HRP偶聯(lián)的二抗(上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)在37 ℃雜交。最后，通過化學發(fā)光試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)分析蛋白條帶。

1.9 雙熒光素酶報告檢測

將野生型(Wt)與突變型(Mut)的SNHG1、miR-195-5p片段的互補DNA片段亞克隆到熒光素酶報告載體中熒光素酶基因下游。將上述SNHG1片段與miR-195-5p或miR-NC共轉染，48 h后，用雙熒光素酶報告試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)連續(xù)測定細胞裂解物中熒光素酶活性。

1.10 RNA免疫共沉淀

通過EZMagna RIP試劑盒(上海谷研實業(yè)有限公司)進行測定。細胞經過裂解，與蛋白A磁珠、一抗孵育 1 h，再在4 ℃免疫沉淀8 h。最后，提純RNA后檢測SNHG1、miR-195-5p表達量。

1.11 RNA下拉實驗

分別用生物素化miR-195-5p-Wt、miR-195-5p-Mut和Bio-NC(陰性對照)，轉染于軟骨細胞。48 h后，孵育細胞裂解物與M-280鏈霉菌磁珠，檢測與珠子結合的RNA復合物中SNHG1的水平。

1.2 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件處理數據，數據以均值±標準差表示，所有實驗均進行至少3次。應用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗、重復測量方差分析、Bonferroni檢驗進行分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。Pearson相關系數檢驗SNHG1、miR-195-5p相關性。

2 結果

2.1 SNHG1在OA中下調，而miR-195-5p在OA中上調

SNHG1在OA患者軟骨組織中下調，而miR-195-5p在OA患者軟骨組織中上調，二者在大鼠OA模型中也具有相似表現。相關性分析發(fā)現，二者還具有顯著負相關(r=-0.713，P<0.001)。見圖1。

注：A～B：在OA患者軟骨組織中SNHG1水平較低，miR-195-5p水平較高；C：在大鼠OA模型軟骨組織中SNHG1低表達，miR-195-5p高表達；D：在OA患者軟骨組織中，SNHG1與miR-195-5p呈負相關。與對照組或兩組比較，**P<0.01，***P<0.001。圖1 SNHG1、miR-195-5p的表達Fig.1 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.2 SNHG1過表達可降低軟骨細胞中LPS誘導下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境

細胞分析顯示，LPS誘導下，軟骨細胞的凋亡水平以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達以及蛋白水平顯著上升，細胞增殖能力受到明顯抑制。通過轉染過表達質粒到軟骨細胞中，實現SNHG1的過表達后，以上軟骨細胞的表現得到顯著改善，但是和對照組相比還具有顯著差異。以上結果均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A：SNHG1轉染效率；B：LPS誘導下軟骨細胞的凋亡率顯著提高，而SNHG1可抑制細胞凋亡水平，及其流式細胞圖；C～D：LPS誘導下軟骨細胞的炎癥因子表達與蛋白水平均顯著提高，而SNHG1可改善這種炎性狀態(tài)，及其蛋白圖；E：LPS誘導下軟骨細胞的增殖受到抑制，而SNHG1可解除這種抑制作用。與Control相比，*P<0.05，**P<0.01；與LPS相比，#P<0.05，##P<0.01。圖2 SNHG1對LPS誘導下軟骨細胞的影響Fig.2 Effect of SNHG1 on LPS-induced chondrocytes

2.3 敲低miR-195-5p可降低軟骨細胞中LPS誘導下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境

細胞功能試驗結果顯示，LPS干預下，軟骨細胞表現出了較高凋亡率與高水平炎性因子(包括轉錄與蛋白水平)，較低的細胞增殖水平。通過轉染miR-195-5p抑制劑至軟骨細胞，實現miR-195-5p表達敲低后，以上結果均向對照組靠近，但離對照組還具有一定程度。以上結果差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 miR-195-5p是SNHG1的直接靶目標

我們經過生物信息學分析發(fā)現，miR-195-5p與SNHG1存在潛在靶向位點。雙熒光素酶報告分析中，miR-195-5p模擬物僅顯著調低SNHG1-Wt(而非SNHG1-Mut)。RNA免疫沉淀分析中，含有Ago2的miR-195-5p復合物中高度募集SNHG1。下拉實驗中，SNHG1僅被生物素標記的miR-195-5p-WT拉下。此外，我們還發(fā)現轉染SNHG1過表達序列的軟骨細胞中存在較低水平miR-195-5p。以上結果差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A：miR-195-5p-SNHG1潛在結合位點；B：雙熒光素酶報告；C：RNA免疫沉淀實驗；D：RNA下拉實驗；E：miR-195-5p-SNHG1關系。與miR-NC/pcDNA3.0相比，**P<0.01，***P<0.001；與LPS相比，###P<0.001。圖4 SNHG1、miR-195-5p的表達Fig.4 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.5 SNHG1-miR-195-5p調控軸可在體內改善OA大鼠的凋亡相關因子水平與炎癥微環(huán)境

對OA大鼠模型注射SNHG1促進劑與miR-195-5p抑制劑進行治療，結果發(fā)現凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2的轉錄與蛋白水平均顯著低于模型組，但是仍顯著高于對照組。此外，炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α也具有相似結果。以上結果差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

3 討論

OA是較常見的骨關節(jié)慢性疾病，影響世界人口15 %以上，最新研究表明，中國現在的膝骨性關節(jié)炎患者達1.1億，這給社會帶來了很大的經濟負擔[19]。目前的研究表明OA與細胞因子、信號通路、基質金屬蛋白酶及免疫因素等有關，但具體的發(fā)病機制仍不清楚[20]。有研究[21]表明，LncRNA-miRNA集成網絡可調控OA進展，對其進行動態(tài)監(jiān)測以及人為干預可能有利于OA病情的逆轉。在Lei等[22]的研究中，強化SNHG1表達可通過靶向抑制miR-16-5p并介導p38 MAPK-NF-κB信號通路減輕OA的代謝功能障礙與炎性狀態(tài)，提示SNHG1在OA的進程中可起緩解作用。又有Shu等[17]的報導中，miR-195-5p在OA中高表達，敲低其表達可通過靶向REGγ降低軟骨細胞的凋亡水平與炎性程度，提示開發(fā)miR-195-5p抑制劑有助于遏制OA進程。在本研究中，我們發(fā)現SNHG1可以改善LPS誘導的軟骨細胞代謝異常并降低促炎細胞因子的表達，抑制了OA的發(fā)展。發(fā)現SNHG1在OA患者軟骨組織中下調，而miR-195-5p上調，SNHG1和miR-195-5p的表達呈負相關，兩者可能介導了OA的病理過程，這可能成為治療新靶點。

注：A～B：SNHG1-miR-195-5p調控軸對OA大鼠凋亡相關因子轉錄與蛋白水平的影響，及其蛋白圖；C～D：SNHG1-miR-195-5p調控軸對OA大鼠炎性因子轉錄與蛋白水平的影響，及其蛋白圖。與Control相比，*P<0.05，**P<0.01；與Model相比，##P<0.01。圖5 SNHG1-miR-195-5p調控軸對OA大鼠的影響Fig.5 Effect of SNHG1-miR-195-5p regulatory axis on OA rats

OA治療藥物的抗炎性往往體現于對炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌抑制[23]。我們在軟骨細胞中上調了SNHG1的表達，發(fā)現高水平SNHG1可顯著降低細胞凋亡率，抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌，從而改善軟骨細胞炎性微環(huán)境，還可恢復細胞的增殖水平。同樣我們通過轉染miR-195-5p抑制序列到軟骨細胞，實現miR-195-5p表達的敲低，可降低軟骨細胞中LPS誘導下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境?？梢婇_發(fā)SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑有助于通過維護軟骨細胞分子微環(huán)境，包括調節(jié)凋亡、增殖能力與炎性狀態(tài)等，實現OA病情的改善。我們還發(fā)現SNHG1與miR-195-5p存在結合位點，miR-195-5p模擬物可顯著調低SNHG1-Wt，含有Ago2的miR-195-5p復合物可募集SNHG1，僅生物素標記的miR-195-5p-Wt被SNHG1下拉。此外，過表達SNHG1還可敲低miR-195-5p水平。綜合以上結果，SNHG1作為內源性RNA，可充當miR-195-5p的分子海綿，實現對其表達的負向調控，兩者之間存在確切靶向關系。SNHG1可靶控miR-195-5p介導OA軟骨細胞的發(fā)展，并且主要從軟骨細胞凋亡、增殖以及炎性微環(huán)境中發(fā)揮調控作用。

我們還進行了體內研究，驗證了SNHG1促進劑與miR-195-5p抑制劑在OA小鼠中的作用。結果表明，模型組大鼠軟骨組織出現了較高水平的Caspase-3、Bax/Bcl-2(轉錄與蛋白水平)以及較高水平的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，提示模型組大鼠已表現出了明顯的軟骨凋亡與炎性微環(huán)境等OA進展情況。而當我們對模型組大鼠進行SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑干預后，以上結果均出現了明顯改善，提示SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑可在轉錄與蛋白水平上顯著抑制模型組大鼠體內的凋亡因子與炎性因子，有助于阻止軟骨凋亡并修復炎性微環(huán)境。在Hu等[24]的研究中，證實了細胞凋亡因子在OA大鼠體內的影響，下調促凋亡因子Caspase-3、Bax以及上調抗凋亡因子Bcl-2對于抑制軟骨細胞凋亡從而發(fā)揮保護作用具有重要效力，這也與本研究的結果相吻合。

綜上所述，存在SNHG1-miR-195-5p調控網絡介導軟骨細胞的凋亡與炎性微環(huán)境，開發(fā)SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑可能有利于OA的治療。