小鼠半規(guī)管造模的實驗技術(shù)優(yōu)勢及其應用

王天穎 車慕瑤 李軼

首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院（北京 100730）

半規(guī)管開窗技術(shù)是指對半規(guī)管骨壁進行鉆孔并去除的一項耳外科手術(shù)技術(shù)，臨床上常利用此技術(shù)進行開窗后半規(guī)管阻塞，開窗后給藥、開窗后冷凍、開窗后化學迷路切除等手術(shù)，用于治療一些保守治療效果不佳的前庭周圍性眩暈。曾也有人通過半規(guī)管開窗進行某些疾病復雜情況下的手術(shù)，如先天性傳導聾、耳硬化癥的聽力重建等[1,2]。半規(guī)管開窗后阻塞尤其被認為是改善頑固性眩暈非常有效的方法[3-5]，但有臨床研究者發(fā)現(xiàn)此手術(shù)可能永久損傷殘余聽力，臨床上對此技術(shù)的安全性尚不明確[6]。

在動物實驗的研究中，有學者通過半規(guī)管開窗進行造模，開展相關內(nèi)耳病理生理學研究。豚鼠由于半規(guī)管結(jié)構(gòu)大，易于實施外科手術(shù)，常被用于半規(guī)管開窗造模[7-9]。但豚鼠繁殖周期長，耳科學遺傳背景不明晰等原因，其作為耳科學實驗動物存在諸多局限性。

隨著對小鼠遺傳背景認識增加，其在耳科學疾病和功能紊亂尤其是內(nèi)耳疾病的基因和靶向治療方面的研究價值日益凸顯，逐漸替代豚鼠成為研究人類遺傳性內(nèi)耳疾病有價值的模型。但小鼠微小的半規(guī)管結(jié)構(gòu)使得外科手術(shù)操作難度大，因此，目前國內(nèi)外相關文獻報道較少。有學者通過小鼠半規(guī)管開窗進行基因?qū)氩⒊晒υ趦?nèi)耳表達，但實驗中的基因表達模式仍然不明確[10,11]；也有研究者通過此技術(shù)向半規(guī)管內(nèi)注射耳毒性藥物進行損傷內(nèi)耳毛細胞造模的實驗[12-13]，但對于藥物完整分布情況以及機制也仍然未知[13]。

因此，本實驗以小鼠為研究對象，進行了小鼠半規(guī)管開窗后給藥或阻塞模型的可行性探究，對給藥后藥物在內(nèi)耳中的分布、阻塞后半規(guī)管的形態(tài)變化進行了觀察，以闡明經(jīng)小鼠半規(guī)管開窗技術(shù)進行實驗造模的可行性和優(yōu)勢。此種造模方法可以為今后研究半規(guī)管阻塞后內(nèi)耳的病理生理變化，以及通過半規(guī)管給藥進行耳毒性藥物或內(nèi)耳基因治療的研究提供更可靠的動物實驗技術(shù)和模型支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：20只兩月齡CBA小鼠由首都醫(yī)科大學動物部提供。主要試劑：Texas Red耦合的慶大霉素（Texas Red-conjugated AG，AGTR），火棉膠，鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）購于Invitrogen公司。所有熒光照片使用Leica激光共聚焦顯微鏡拍攝。

1.2 動物手術(shù)方法

所有動物均以左耳作為手術(shù)耳。小鼠經(jīng)腹腔注射甲芐噻嗪（7mg/kg）和氯胺酮（65mg/kg）麻醉后，用電動動物剪毛器剪去左側(cè)耳后區(qū)的毛發(fā)，紅霉素眼膏覆蓋小鼠眼部，術(shù)前皮下注射止痛劑美洛昔康(1 mg/kg)，并用75%的乙醇消毒三次。手術(shù)均在無菌手術(shù)臺的手術(shù)顯微鏡下進行。使小鼠右側(cè)臥位，左耳朝上，在距左耳耳后溝3mm處作1cm切口（圖1A），分離皮下組織及肌肉。

1.2.1 保留膜迷路的外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管開窗后阻塞

定位并暴露外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管（圖1B），在暴露的外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管中部分別用動物手術(shù)電鉆進行如圖示的鉆孔，有透明液體涌出，同時經(jīng)鉆孔處觀察到骨壁破壞后呈現(xiàn)近白色半透明組織（圖1C），用鈍頭鑷輕觸此組織，確認為軟組織。取一小塊事先準備的肌肉（使其蒸發(fā)掉部分水分）分別將孔填塞（圖1D），并取骨蠟和生物膠封閉。關閉切口，縫合皮膚。動物放入溫箱自然蘇醒后置于飼養(yǎng)箱，正常進食。整個手術(shù)過程需嚴格避免出血，以免血液經(jīng)半規(guī)管鉆孔處混入淋巴液，影響模型的可靠性。手術(shù)時間控制為20min。

圖1 小鼠外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管開窗及阻塞的手術(shù)方法。A：小鼠右側(cè)臥位，手術(shù)切口距耳后約3mm；B：鈍性分離肌肉后定位并暴露的外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管；C：經(jīng)動物手術(shù)電鉆磨除部分骨壁后的半規(guī)管（外側(cè)半規(guī)管），黑色箭頭所示為鉆孔處，可見近白色半透明組織；D：經(jīng)肌肉和筋膜阻塞的外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管（左耳）。Fig.1 Fenestration and occlusion of lateral semicircular ca-nal and posterior semicircular canal in mice.A:the mouse was placed in the right lying position,and the surgical inci-sion was made about 3mm behind the ear.B:the lateral semi-circular canal and the posterior semicircular canal were locat-ed and exposed after separation of the muscle;C:semicircular canal after partial removal of the bone wall by an animal sur-gical drill(lateral semicircular canal).The hole shown by the black arrow shows nearly white translucent tissue;D:the mus-cle-filled hole in the lateral semicircular canal and posterior semicircular canal(left ear).

1.2.2 經(jīng)后半規(guī)管開窗注射Texas Red耦合的慶大霉素（AGTR）

如文獻中報道的方法[14]，暴露后半規(guī)管，同時取一塊肌肉晾干（用于后續(xù)封閉孔洞）。在暴露的后半規(guī)管中部鉆孔，觀察到液體流出，過程中注意避免損傷血管。將微型管尖端經(jīng)孔插入后半規(guī)管約1-2mm（尖端朝向半規(guī)管總角），將AGTR（慶大霉素濃度為50μM）通過微量進樣器泵入（每次手術(shù)給藥量為1μl）。注射完成后將備好的肌肉填塞進孔內(nèi)，將孔進行封堵，確保孔洞完全密封，無液體流出。復位組織，縫合皮膚。手術(shù)結(jié)束后30min處死，取出顳骨組織，進行處理，并用熒光顯微鏡拍攝。

1.3 半規(guī)管的火棉膠切片制備

小鼠經(jīng)阻塞手術(shù)后1月，麻醉成功后斷頭處死。取出聽泡，在解剖顯微鏡下去除鐙骨，開放圓窗、卵圓窗，并在蝸頂處打孔，進行4%多聚甲醛液灌注。將處理好的組織置于4%多聚甲醛溶液中于4℃冰箱固定24h，再以10%EDTA溶液中脫鈣3天，隨后分別進行乙醇的分級梯度脫水，后置于1:1酒精乙醚溶液中12h，兩次。取出后將樣品進行分級濃度的火棉膠包埋，共6周，放置密封皿中使其硬化。對包埋并硬化好的顳骨組織進行修剪，分別沿著堵塞半規(guī)管的長軸進行厚度為20μm的連續(xù)組織切片，將切片置于80%乙醇溶液中，隨后進行HE染色，取有代表性的組織片進行拍攝。

1.4 前庭組織和耳蝸基底膜組織的標本制備

將1.2.2得到的部分顳骨組織用4%多聚甲醛溶液固定2h，用PBS沖洗3次后，仔細解剖，取出橢圓囊及壺腹，并分離出耳蝸基底膜。耳蝸基底膜標本以0.3%Triton X-100處理，用鬼筆環(huán)肽（1:100，30min）避光孵育，DAPI（4’6-二脒基-2苯基吲哚，1:1000）進行細胞核染色5min，樣品用PBS漂洗后，封片。用Leica激光共聚焦顯微鏡進行觀察照相。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)開窗并阻塞后的半規(guī)管形態(tài)學

我們用CBA小鼠進行了半規(guī)管骨壁開窗并阻塞的手術(shù)，實驗中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠的上半規(guī)管被顱骨遮蓋，無法通過肌肉的鈍性分離進行暴露，而外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管暴露充分（圖1B）。而臨床中，后半規(guī)管和/或外側(cè)半規(guī)管的開窗填塞也相對常見[14]，因此，我們進行了小鼠外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管開窗后填塞的手術(shù)。

我們對術(shù)后的小鼠進行了前庭功能方面的觀察，手術(shù)后第1天、第3天、第7天、第28天均未觀察到打轉(zhuǎn)、頭偏、步態(tài)異常等前庭功能障礙的情況。術(shù)后第28天，顳骨組織的切片及染色顯示（圖2BE），后半規(guī)管（圖2B，D）和外側(cè)半規(guī)管（圖2C，E）已被完全阻塞，阻塞部位可見與周圍組織走形及密度不同的已經(jīng)機化的不規(guī)則團塊狀軟組織（圖2D，E黃色箭頭所示）,可觀察到膜迷路仍然保留（圖2D，E藍色箭頭所示）。結(jié)果表明，用本研究的手術(shù)方法可以使得小鼠外側(cè)半規(guī)管和后半規(guī)管填塞確切，可能保持膜迷路的完整性。

圖2 小鼠半規(guī)管開窗阻塞后的形態(tài)學。A：未經(jīng)開窗阻塞的正常半規(guī)管形態(tài)；B，D：阻塞后的后半規(guī)管形態(tài)；C，E：阻塞后的外側(cè)半規(guī)管形態(tài)（黃色箭頭所示為填塞位置與周圍組織走形和密度不同的已經(jīng)機化的不規(guī)則團塊狀軟組織、藍色箭頭所示為保持完整的膜迷路）。A、B、C標尺為200μm；D、E標尺為100μm。Fig.2 Morphology of mouse semicircular canal after fenestra-tion and occlusion.A:normal semicircular canal shape with-out occlusion;B,D:posterior semicircular canal shape after occlusion;C,E:lateral semicircular canal shape after packing.(The yellow arrow shows the location of the occlusion and the irregular mass of soft tissue that is different from the surround-ing tissue in shape and density,and the blue arrow shows the intact membrane labyrinth.)Bars in A,B and C:200μm;bars in D,E:100μm.

2.2 經(jīng)半規(guī)管開窗注射后的慶大霉素分布

為了探究半規(guī)管給藥能否成功將藥物送達前庭和耳蝸。本研究采用Texas Red耦合慶大霉素（AGTR）作為藥物示蹤方式，來觀察經(jīng)示蹤劑耦合的慶大霉素（本實驗中的慶大霉素濃度幾乎不造成毛細胞丟失）通過后半規(guī)管注射后，在內(nèi)耳中的分布情況，以及被前庭感受器及耳蝸細胞攝取的情況。AGTR注射進入后半規(guī)管30min后，我們立即進行了顳骨組織的取材，進行激光共聚焦顯微鏡拍攝觀察，結(jié)果如圖3所示。我們發(fā)現(xiàn)，此時，熒光劑已充滿了整個內(nèi)耳（圖3A，B）。我們又分離出了橢圓囊、壺腹和耳蝸基底膜進行觀察，在前庭感受器中的橢圓囊和壺腹上的毛細胞均清晰檢測到了熒光（圖3C），同時，發(fā)現(xiàn)耳蝸基底膜也有熒光的攝取，即使在頂轉(zhuǎn)中也檢測到了熒光（圖3D），且高亮的區(qū)域與毛細胞和纖毛的位置相匹配（圖3E）。我們保留了兩只小鼠進行前庭感覺方面的觀察，與2.1半規(guī)管阻塞實驗結(jié)果中不同的是，在術(shù)后第1天、第3天均觀察到了打轉(zhuǎn)、頭偏和步態(tài)不穩(wěn)的情況，術(shù)后第7天上述現(xiàn)象消失。結(jié)果顯示，慶大霉素在經(jīng)小鼠后半規(guī)管注射30min后，即可導入并灌注整個內(nèi)耳，可成功到達前庭、耳蝸，尤其是可以被耳蝸頂轉(zhuǎn)的毛細胞攝取。

圖3 后半規(guī)管開窗并注射AGTR 30min后的熒光分布和免疫熒光染色。A，B:充滿紅色熒光的內(nèi)耳組織及其明場中所見；C：AGTR被橢圓囊及壺腹毛細胞攝取；D，E：AGTR被耳蝸基膜中的細胞和組織攝?。▓D為基底膜頂轉(zhuǎn)），高亮區(qū)基本與毛細胞和纖毛匹配。圖中紅色代表AGTR，綠色代表鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）染色的F肌動蛋白、纖毛，藍色代表DAPI染色的細胞核。A、B的標尺為2mm；C的標尺為100μm；D、E的標尺為25μm。Fig.3 Fluorescence distribution and immunofluorescent staining after fenestration and injection with AGTR of the pos-terior semicircular canal for 30 min.A,B:Inner ear filled with red fluorescence and its view in bright field;C:AGTR is taken up by the hair cells in the utricle and ampulla;D,E:AG-TR is taken up by cells and tissues in the cochlear basement membrane(the image shows the apex),the highlighted area basically matches with hair cells and cilia.Red:AGTR;green:Phalloidin;blue:DAPI.Bars in A,B:2mm;bars in C:100μm;bars in D,E:25μm.

3 討論

隨著近年來對內(nèi)耳疾病的深入研究，經(jīng)半規(guī)管開窗的手術(shù)操作也被重新認識并應用。經(jīng)半規(guī)管開窗的相關技術(shù)，可用于耳科學中許多相關的臨床和基礎研究。進行半規(guī)管開窗主要有兩個目的：內(nèi)耳給藥或行半規(guī)管阻塞[15,16]。

在耳科學基礎研究中，常見的使藥物到達內(nèi)耳的動物給藥方式有三種：全身給藥，經(jīng)圓窗膜給藥以及經(jīng)半規(guī)管開窗給藥。全身給藥常常有著難以避免的全身性副作用。經(jīng)圓窗膜給藥及病毒輔助的基因轉(zhuǎn)導效率相對較低，有效的藥物劑量及基因轉(zhuǎn)導僅在耳蝸底部的毛細胞有效，且導入劑量不能準確控制[17]，另外，小鼠的耳蝸底部常有鐙骨動脈走行穿過鐙骨，為圓窗給藥操作帶來額外的困難。而經(jīng)半規(guī)管開窗給藥相比前兩者，有著給藥劑量可控的優(yōu)勢，同一個體可進行多次手術(shù)給藥[14]。同時，無需通過血迷路屏障，可避免藥物經(jīng)全身代謝后代謝產(chǎn)物的作用和影響。且半規(guī)管開窗給藥有保留耳蝸功能和聽力的優(yōu)勢[12]，對耳蝸和前庭的損傷較小[14,17]。因此，經(jīng)半規(guī)管開窗給藥逐漸流行，主要用來導入藥物或者進行基因轉(zhuǎn)導，進行多種模型的建立，以滿足不同的實驗需求。同時，對此技術(shù)最大的期待和展望，是其作為一種基因轉(zhuǎn)導路徑，在內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)導實驗中的應用。有國內(nèi)研究團隊經(jīng)小鼠半規(guī)管開窗進行基因轉(zhuǎn)導，成功在前庭和內(nèi)耳毛細胞表達了GFP[14]；他們還通過半規(guī)管開窗給藥的方式進行了多種實驗模型的建立和研究[14,18-21]。

豚鼠由于其半規(guī)管體積相對較大，操作更方便的特點，曾一度成為了用于此類手術(shù)造模的主流實驗動物[10]。而小鼠與豚鼠相比，有著繁殖速度快，飼養(yǎng)簡單，且人們對其基因組遺傳背景了解更加透徹，基因突變更加容易追蹤的優(yōu)勢，同時，人類的許多遺傳性內(nèi)耳疾病已有了與之匹配的同源基因小鼠模型。除了其內(nèi)耳結(jié)構(gòu)體積小，對術(shù)者操作要求更高之外，顯然是一個理想的半規(guī)管開窗相關模型的實驗動物選擇。我們的實驗中，用示蹤劑的方法直觀地展示了藥物在小鼠半規(guī)管給藥后的分布情況，結(jié)果顯示注射熒光示蹤劑耦合的慶大霉素30min后，整個前庭和耳蝸即充滿了熒光，因此，我們的實驗證實了通過小鼠半規(guī)管開窗導入進行內(nèi)耳給藥的方法是確切可行的，其高效性更是顯而易見的，且證實了此方法相較于圓窗給藥作用的范圍更廣，藥物可到達蝸頂。

雖然半規(guī)管開窗后阻塞技術(shù)對前庭周圍性眩暈非常有效[4,5]，但有文獻指出有臨床患者在接受此手術(shù)后出現(xiàn)了聽力下降[5]，原因和機制尚不明確[22]。我國最新的梅尼埃病診療指南中，主要將半規(guī)管阻塞手術(shù)用于四期患者[23]?？梢娪捎诖耸中g(shù)可能造成聽力下降，因此在臨床中的應用受限。在動物實驗中，半規(guī)管開窗后阻塞的模型常用來研究兩個方面的問題：一是半規(guī)管阻塞后對聽覺系統(tǒng)的影響及其機制；二是研究半規(guī)管填塞后是否會帶來內(nèi)、外淋巴液環(huán)境的變化。有學者猜想過去的實驗中之所以不能明確半規(guī)管開窗阻塞手術(shù)是否影響聽力，可能在于手術(shù)過程復雜，手術(shù)所致的膜迷路損壞、淋巴液丟失等，使淋巴液環(huán)境變化超出了代償能力，影響聽力。也可能是某些術(shù)中出血進入了淋巴循環(huán)成為損害因素[9]。因此，我們嘗試從手術(shù)時長統(tǒng)一、手術(shù)步驟統(tǒng)一（鉆孔大小基本一致、盡量保持膜迷路完整），以及半規(guī)管形態(tài)學評估阻塞的確切性三個維度，來確保建立小鼠半規(guī)管阻塞模型的可靠性、可重復性和穩(wěn)定性。在技術(shù)上，我們選用了不同的材料進行嘗試，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)針對小鼠細小的半規(guī)管，蒸發(fā)掉部分水分的肌肉和筋膜填塞是最有效的。我們在切片中也觀察到了阻塞部位發(fā)生的軟組織增生，這種增生的團塊狀組織不規(guī)則，且密度和組織走形特點與周圍正常的呈線性結(jié)構(gòu)的迷路不同，但我們沒有觀察到骨質(zhì)增生和纖維化，我們猜想可能是由于肌肉填塞的操作創(chuàng)傷小，沒有對骨壁造成非常大的刺激和損傷。此模型為在今后實驗動物層面進行半規(guī)管阻塞后內(nèi)耳病理生理學改變的相關研究提供新的實驗模型參考。

本研究中，我們觀察到單耳半規(guī)管阻塞的小鼠和單耳半規(guī)管造口并給藥的小鼠在前庭功能上表現(xiàn)不同。后者出現(xiàn)了短暫的前庭功能障礙，與文獻報道也不一致[21]。出現(xiàn)上述不同表現(xiàn)，可能是由于實驗過程中，外淋巴液丟失程度不同，內(nèi)、外淋巴液環(huán)境壓力變化不同，也可能是藥物的一過性影響。但這一設想還有待進一步實驗探究。我們用小鼠作為實驗動物，其優(yōu)勢雖然明顯，但我們發(fā)現(xiàn)，小鼠的上半規(guī)管嵌于顱骨下方的切跡，通過手術(shù)鈍性分離組織的方法無法暴露，除非破壞顱骨結(jié)構(gòu)。因此，我們認為，小鼠成為上半規(guī)管手術(shù)的實驗動物有其局限性。

綜上所述，我們探究了兩種經(jīng)半規(guī)管開窗技術(shù)的小鼠模型建立方法：經(jīng)半規(guī)管開窗阻塞模型和經(jīng)半規(guī)管開窗注藥模型。本研究結(jié)果表明，經(jīng)小鼠半規(guī)管開窗進行相關造模在技術(shù)上是可行的，具有一定的可靠性、穩(wěn)定性和可重復性，同時相較于其他的造模方式有著很多優(yōu)勢，這為今后進行相關內(nèi)耳生理、病理學研究，耳毒性藥物相關研究以及內(nèi)耳病基因治療等研究的動物模型建立提供了新的選擇和技術(shù)參考。