承德市25,205例新生兒聾病易感基因分子流行病學(xué)調(diào)查分析

薛秀麗翼楠 張嬌李春美程云趙艷紅王大勇薛涵

1承德市婦幼保健院兒童醫(yī)院(承德 067000)

2隆化鎮(zhèn)醫(yī)院(承德 067000)

3承德市中心醫(yī)院(承德 067000)

4解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部解放軍耳鼻咽喉研究所(北京 100853)

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）最新發(fā)布的《世界聽力報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，全球現(xiàn)有聽力障礙4.32億人，其中兒童約3,400萬[1]。我國是世界上聽力障礙人數(shù)最多的國家，其中聽力障礙超過了肢體殘疾、智力殘疾，位于殘疾人總數(shù)之首（33.51%）[2]。每年新發(fā)出生缺陷兒童中先天性聽力障礙從2012年的3.5萬例（3.89%）[3]上升到2019年的6～8萬例[4]，已成為僅次于先天性心臟病的第二大出生缺陷。

新生兒聽力篩查在發(fā)現(xiàn)先天性聽力損失方面取得了很好的成績，但是不能發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性遺傳性耳聾。因此，新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的方法應(yīng)運(yùn)而生[5，6]，并在以北京、天津?yàn)榇淼亩鄠€(gè)省市應(yīng)用[7-9]。多項(xiàng)研究顯示新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查可有效提高新生兒聽力缺陷的早期檢出率[10]。因此，本研究首次針對(duì)承德地區(qū)2019年4月至2021年10月間出生的25,205名新生兒進(jìn)行聽力與基因聯(lián)合篩查，并綜合分析承德地區(qū)新生兒的聾病易感基因的分子流行病學(xué)特征，全面評(píng)估河北省承德市新生兒中遺傳性耳聾基因的變異頻率和類型，為承德地區(qū)新生兒人群的聾病易感基因攜帶情況提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年4月至2021年10月，承德市11個(gè)區(qū)（縣）出生的25,205名新生兒，女12,094例，男13,111例?；蚝Y查前新生兒監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 聽力篩查

新生兒出生后72小時(shí)內(nèi)采用耳聲發(fā)射（oto-acoustic emissions，OAE）法，在新生兒自然睡眠或安靜狀態(tài)下，進(jìn)行客觀、快速和無創(chuàng)的聽力初篩。初篩未通過者于出生后42天采用自動(dòng)聽性腦干誘發(fā)電位（automatic auditory brainstem response,AABR）法進(jìn)行聽力復(fù)篩，>20 dB nHL判定為不通過。

1.2.2 血樣采集

新生兒出生后采集足跟血，在按摩或熱敷新生兒足跟外側(cè)采血部位并用75%酒精完全消毒皮膚后，使用一次性采血針刺采血部位(深度<3mm)，用干棉球拭去第1滴血，從第2滴血開始將濾紙片血圈中心與之接觸并自然滲透至濾紙背面（切勿觸及皮膚），如此采集至少2個(gè)血斑，自然晾干呈深褐色制成干血片。操作過程符合衛(wèi)生部《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》（2019年版），晾干過程中避免陽光及紫外線照射、烘烤、受潮以及揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)污染。采集后的合格干血片樣本單獨(dú)置于封口袋內(nèi)密封，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因篩查

應(yīng)用華大基因聯(lián)合探針錨定聚合測序法針對(duì)遺傳性耳聾相關(guān)的24基因208位點(diǎn)進(jìn)行篩查，根據(jù)基因變異位點(diǎn)序列信息設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增人基因組DNA中的靶序列，并同時(shí)引入用于樣本識(shí)別的樣本標(biāo)簽序列，制備文庫。采用BGISEQ-500基因測序儀對(duì)測序樣本進(jìn)行序列信息讀取，經(jīng)文庫接頭序列及樣本標(biāo)簽序列比對(duì)拆分，測序樣本中每一條DNA的測序結(jié)果將被精確定位到每一個(gè)樣本中。測序結(jié)果使用遺傳性耳聾基因分析軟件（版本號(hào):HCS-2 V1.0）進(jìn)行貝葉斯定理和受試者工作特征曲線（receiver operat-ing characteristic curve，ROC曲線）進(jìn)行計(jì)算分析。

1.2.4 電話隨訪

對(duì)常染色體隱性遺傳雙等位基因突變個(gè)體和常染色體顯性單等位基因突變個(gè)體的監(jiān)護(hù)人進(jìn)行電話隨訪，獲取新生兒相關(guān)信息，監(jiān)護(hù)人自述新生兒的健康狀況及聽力篩查結(jié)果“通過”或“未通過”（單側(cè)或雙側(cè)）、目前聽力狀況、聽力損失干預(yù)情況。如果獲知新生兒對(duì)聲音反應(yīng)不靈敏，告知其到河北省項(xiàng)目定點(diǎn)聽力篩查診治中心耳鼻喉科進(jìn)行聽力檢測。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合篩查總體情況

在25,205例新生兒中，88.81%（22,385/25,205）通過聯(lián)合篩查，99.32%（25,034/25,205）通過聽力篩查，89.34%（22,518/25,205）通過基因篩查。10.51%（2,649/25,205）通過聽力篩查，未通過基因篩查（詳見表1）?；蚝Y查檢出2,687例攜帶耳聾致病基因變異，攜帶率10.66%（2,687/25,205），其中男嬰1,368例（5.43%，1,368/25,205），女嬰1,319例（5.23%，1,319/25,205）。

表1 25,205例新生兒基因和聽力聯(lián)合篩查結(jié)果Table 1 Results of genetic screening and associations between hearing and genetic screening of 25,205 neonates

2.2 耳聾基因突變的分布

承德地區(qū)25,205例新生兒進(jìn)行了遺傳性耳聾相關(guān)的24基因208位點(diǎn)檢測，共檢出2,687例新生兒至少攜帶一種基因變異，變異攜帶率由高到低依次為：GJB2、SLC26A4、MT-RNR1、GJB3、TMPRSS3、USH2A、OTOF、MARVELD2、MYO15A、MYO7A、DFNA5、LRTOMT基因（詳見表2）。其中，中國人群攜帶的聾病易感基因變異中以GJB2、SLC26A4、GJB3以及線粒體的MT-RNR1為主，這4個(gè)基因的179個(gè)位點(diǎn)在本研究中共發(fā)現(xiàn)2,634例變異，其中含一個(gè)以上突變位點(diǎn)的變異122例，例如：GJB2（c.109G>A）/SLC26A4（c.919-2A>G）雙基因雜合突變。篩查GJB2基因的94個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)基因變異1,812例，總變異率為7.19%。其中，c.109G>A位點(diǎn)變異最多為1,127例（變異率4.47%），包括單基因純合突變10例、單基因雜合突變1,048例，含一個(gè)以上突變位點(diǎn)69例。GJB2c.235delC位點(diǎn)變異483例（變異率1.92%），包括單基因純合突變1例、單基因雜合突變442例，含一個(gè)以上突變位點(diǎn)40例；GJB2c.299_300delAT位點(diǎn)變異126例（變異率0.50%）均為雜合突變。GJB2基因c.109G>A位點(diǎn)和c.235delC位點(diǎn)單基因純合的基因型受累者11例，6例通過新生兒聽力篩查，5例未通過聽力篩查的新生兒中2例進(jìn)行了聽力診斷結(jié)果未及異常，2例未進(jìn)行聽力診斷自述目前聽力正常，1例診斷為神經(jīng)性耳聾并植入人工耳蝸。

表2 2,687例變異攜帶者基因型Table 2 The genotype of 2,687 positively detected patients

有關(guān)Pendred綜合征和大前庭水管綜合征（EVA;OMIM#600791）的常染色體隱性遺傳基因SLC26A4（又稱PDS基因）在本研究中篩查發(fā)現(xiàn)562例變異，總變異率為2.23%。其中c.919-2A>G變異306例（變異率1.21%），包括單基因雜合突變266例，含一個(gè)以上突變位點(diǎn)40例，未通過聽力篩查6例均為雜合突變；c.2168A>G變異68例（變異率0.27%），包括單基因雜合突變58例，含一個(gè)以上突變位點(diǎn)10例，3例未通過聽力篩查的新生兒中有2例是雙胞胎，經(jīng)母親基因型驗(yàn)證雙胞胎基因型為SLC26A4基因c.2168A>G/c.281C>T復(fù)合雜合突變。與氨基糖甙類藥物引起藥物型耳聾有關(guān)的線粒體MT-RNR1基因變異共發(fā)現(xiàn)247例，總變異率為0.98%，無論均質(zhì)和異質(zhì)突變所有個(gè)體均受累。其中m.1095T>C變異184例，m.1555A>G變異57例，m.1494C>T變異6例，變異率分別為0.73%、0.23%和0.02%。篩查發(fā)現(xiàn)GJB3基因變異97例，總變異率為0.38%，其中c.538C>T變異84例（變異率0.33%），c.547G>A變異例數(shù)13例（變異率0.05%）。

除上述四個(gè)熱點(diǎn)基因外，本研究還發(fā)現(xiàn)涉及眼耳兩個(gè)感覺器官最常見的尤塞氏（Usher）綜合征相關(guān)的USH2A基因（c.99_100insT）和MYO7A基因（c.3719G>A）單基因雜合突變攜帶者共11例；非綜合征型耳聾相關(guān)TMPRSS3基因（c.916G>A）、OTOF基 因（c.2977_2978delAG）、MARVELD2基 因（c.858dupT）、LRTOMT基因（c.655C>T）、MYO15A基因（c.9690+1G>A）共41例單基因雜合突變攜帶者以及1例DFNA5基因（c.991-15_991-13delTTC）常染色體顯性基因雜合突變攜帶者，其中TM-PRSS3基因攜帶者最多32例。具有遲發(fā)漸進(jìn)性高頻聽力下降表型的DFNA5（OMIM#600994）雜合突變受累者通過了新生兒聽力篩查，父母自述未進(jìn)行聽力診斷，至10月齡隨訪時(shí)尚未出現(xiàn)聽力下降。

在承德地區(qū)的25,205例新生兒中，民族人數(shù)由多到少依次為滿族、漢族、蒙古族、回族等。其中滿族和漢族的陽性檢出率分別為10.57%（1,927/18,224）和 11.18%（679/6,074），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（c2=1.6779，P=0.1952）。GJB2的 c.299_300delAT突變位點(diǎn)在漢族和滿族人群中攜帶率分別為0.63%和0.40%，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（c2=4.5909，P=0.03214）。SLC26A4的c.919-2A>G突變位點(diǎn)在漢族和滿族人群中攜帶率為1.33%和0.97%，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（c2=5.3526，P=0.02069）。而在漢族人群未發(fā)現(xiàn)GJB2的c.598G>A、SLC26A4的c.1707+5G>A、c.1746delG和c.334C>T以及GJB2（c.109G>A）/TMPRSS3（c.916G>A）突變位點(diǎn)，在滿族人群中分別篩出多于3例。

3 討論

目前世界范圍內(nèi)常規(guī)使用的新生兒聽力篩查基于電生理學(xué)技術(shù)，受環(huán)境因素影響大，對(duì)遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾檢出率低。自2006年，美國哈佛醫(yī)學(xué)院教授Cynthia Morton提出耳聾基因篩查的倡議，截至2018年底，國內(nèi)開展新生兒基因篩查超過320萬，王秋菊等[11]認(rèn)為將聽力篩查與基因篩查聯(lián)合應(yīng)用在語前性聽力損失、遲發(fā)性聽力損失或者致聾基因的攜帶者，并結(jié)合定期隨診及監(jiān)測，是目前最為有力的篩查策略。

本研究首次在承德市開展新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查，初步獲得了承德市新生兒人群遺傳性耳聾的基因變異攜帶情況。25,205名新生兒中檢測到2,687例耳聾基因變異攜帶者，攜帶檢出率10.66%（2,687/25,205），顯著高于北京、天津、山西、成都、武漢、珠海、廣州、嘉興、淄博等地基于芯片法檢測的攜帶檢出率4.51%、5.40%、5.15%、4.03%、3.08%、4.15%、3.68%、4.89%、4.91%[12-15,22]。國內(nèi)各地新生兒耳聾基因篩查基因數(shù)、檢測變異位點(diǎn)數(shù)雖然存在差異，但對(duì)本研究中承德地區(qū)的新生兒基因篩查數(shù)據(jù)集中與芯片法檢測相同的20個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)統(tǒng)計(jì)，則攜帶檢出率為4.94%（1,244/25,205），與上述國內(nèi)各地檢測攜帶率基本一致，由此考慮本研究發(fā)現(xiàn)的承德地區(qū)新生兒耳聾基因的高攜帶率主要是基于基因檢測范圍的擴(kuò)大，因而發(fā)現(xiàn)了更多的常規(guī)篩查未能檢測到的耳聾基因的變異攜帶狀態(tài)。

本研究擴(kuò)展篩查出的1,443例耳聾基因攜帶者中75.94%（1,095/1,442）是GJB2基因的c.109G>A位點(diǎn)變異。承德地區(qū)c.109G>A人群變異攜帶率約4.47%，符合我國漢族正常人群中攜帶率2.8～8.2%[15]。GJB2基因變異導(dǎo)致縫隙連接蛋白Con-nexin26（Cx26）的功能改變和對(duì)鉀離子循環(huán)通路形成干擾，導(dǎo)致聽力損失。GJB2基因變異為遺傳性耳聾最常見的病因，有超過100個(gè)等位基因已被鑒定與耳聾有關(guān)，例如歐洲人群中GJB2c.35delG變異約3%[16]，占GJB2誘導(dǎo)聽力損失的85%[17]；亞洲人群中c.235delC變異約2%[18,19]；在德系猶太人群中最常見的c.167delT約7%[20]。國內(nèi)一項(xiàng)覆蓋25省32個(gè)地級(jí)市的新生兒耳聾基因篩查調(diào)查中顯示GJB2c.35delG在中國耳聾人群中并不常見[12]。GJB2c.109G>A變異雖然在承德地區(qū)新生兒中攜帶率較高，但純合和復(fù)合雜合變異屬于非截短變異，通常只影響單個(gè)或多個(gè)氨基酸，具有相對(duì)溫和、外顯率低的特點(diǎn)，約20%表現(xiàn)出遲發(fā)性聽力損失[21]，且聽力表型差異較大。承德地區(qū)1,127例c.109G>A攜帶者統(tǒng)計(jì)量提示在以往研究中，國內(nèi)各地耳聾基因攜帶的實(shí)際情況應(yīng)高于目前文獻(xiàn)報(bào)道。向攜帶者及其配偶詳細(xì)介紹c.109G>A變異的特點(diǎn)非常必要，攜帶者夫婦生育二胎時(shí)子代出現(xiàn)GJB2c.109G>A純合變異的概率為25%。因此，對(duì)于早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防可阻止或延緩聽力損失的發(fā)展來講，社會(huì)、臨床以及攜帶耳聾致病基因的家庭都具有非常重要的價(jià)值。

本研究新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查發(fā)現(xiàn)的線粒體MT-RNR1基因或SLC26A4基因變異攜帶者共803例（3.18%，803/25,205)，其中8例未通過聽力篩查。線粒體MT-RNR1基因變異為母系遺傳，攜帶此變異患兒的母系家族成員同樣是藥物性耳聾敏感個(gè)體，接觸極小或治療劑量的氨基糖苷類藥物亦可誘發(fā)嚴(yán)重聽力損失。此外，線粒體基因相關(guān)的耳聾，除藥物致聾表型外，也可能在無藥物接觸史的情況下出現(xiàn)成年后聽力損失，作為一個(gè)單獨(dú)的非綜合征性耳聾類型對(duì)待。參照《遺傳性耳聾基因變異篩查技術(shù)專家共識(shí)》，需要強(qiáng)調(diào)檢出線粒體MT-RNR1基因無論是均質(zhì)或異質(zhì)狀態(tài)，均應(yīng)提示受檢者的藥物性耳聾風(fēng)險(xiǎn)極高，應(yīng)建議其本人以及母系家系成員均應(yīng)終身避免使用該類藥物。SLC26A4基因突變導(dǎo)致的大前庭水管綜合征是常染色體隱性遺傳疾病，前庭水管擴(kuò)大本身的特點(diǎn)決定了其遲發(fā)性聽力損失的高發(fā)性。本研究中聽力篩查未過且基因篩查確定為復(fù)合雜合突變的2例（雙胞胎），回訪時(shí)幼兒1歲7個(gè)月，父母自述幼兒目前聽力正常，但未進(jìn)一步檢查顳骨CT和MRI，建議應(yīng)盡早診斷是否存在內(nèi)耳發(fā)育畸形。其他新生兒通過聽力篩查但基因驗(yàn)證為復(fù)合雜合突變受累的，遲發(fā)于嬰幼兒期的約70%，遲發(fā)于學(xué)齡前期及學(xué)齡期的約30%[21]，因此應(yīng)高度警惕基因型受累者在未來成長階段因輕度顱腦外傷、劇烈運(yùn)動(dòng)或者感冒等造成的聽力下降。

非綜合征型常染色體顯性遺傳模式(DFNA)的聽力損失是遲發(fā)性聽力損失最為常見的臨床表型，本研究中篩查發(fā)現(xiàn)1例DFNA5正是這一遺傳模式里第五個(gè)被定位的基因。DFNA5共有10個(gè)外顯子，其第7內(nèi)含子的3堿基對(duì)缺失（c.991-15_991-13delTTC）導(dǎo)致第8外顯子轉(zhuǎn)錄缺失，截短所翻譯的蛋白最終致聾。DFNA5表型多為漸進(jìn)性的感音神經(jīng)性聽力損失，同家系受累成員的聽力下降曲線圖類似，發(fā)病年齡可延遲到40歲。這一DFNA5受累者的發(fā)現(xiàn)說明基因篩查的檢測基因數(shù)和位點(diǎn)數(shù)的擴(kuò)展不僅可以對(duì)人群攜帶率有更準(zhǔn)確的評(píng)估，還可以對(duì)各類型遲發(fā)性聽力損失做到應(yīng)篩盡篩。對(duì)于明確常染色體顯性遺傳模式的受累者及其父母應(yīng)進(jìn)行必要的遺傳咨詢，建議在生育二胎之前先進(jìn)行耳聾基因檢查，在婚配和生育時(shí)也需要明確其配偶耳聾基因攜帶情況，必要時(shí)要進(jìn)行產(chǎn)前診斷及干預(yù)。

承德地區(qū)的漢族和滿族的新生兒人群中GJB2（c.299_300delAT和 c.598G>A）、SLC26A4（c.919-2A>G、c.1707+5G>A、c.1746delG 和 c.334C>T）和GJB2（c.109G>A）/TMPRSS3（c.916G>A）等突變位點(diǎn)具有不同的等位基因頻率，在陽性檢出率無顯著差異的情況下，承德地區(qū)漢族和滿族常見耳聾基因突變存在異同。

針對(duì)43例基因型受累/復(fù)合雜合攜帶者追蹤回訪，其中26例初始聽力篩查通過且目前聽力正常，其余17例初始聽力篩查未過的新生兒中5例已通過聽力診斷，8例未進(jìn)行聽力診斷自述目前聽力正常，4例在早期（<2歲）出現(xiàn)了聽力損失并確診，其中3例神經(jīng)性耳聾已植入人工耳蝸。雖然基因篩查加速了遺傳性聽力損失高風(fēng)險(xiǎn)患兒的識(shí)別與耳聾患者的早期診斷，但是遲發(fā)性聽力損失是在成長發(fā)育過程中出現(xiàn)的，兒童3-6歲學(xué)齡前期是語言學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力發(fā)育的重要時(shí)期，聽力損失發(fā)生于該階段會(huì)嚴(yán)重影響兒童的語言發(fā)育、學(xué)習(xí)能力及社交、心理發(fā)育。因此下一步應(yīng)加強(qiáng)承德地區(qū)宣教、婚前孕前遺傳咨詢、完善耳聾基因篩查隨訪體系，盡早明確聽力損失的遺傳病因，做到精準(zhǔn)個(gè)性化干預(yù)康復(fù)。同時(shí)，下一步臨床建議增加孕前對(duì)育齡夫婦的產(chǎn)前篩查，配合耳聾基因的遺傳咨詢，預(yù)防先天性耳聾的發(fā)生。對(duì)于聽神經(jīng)、聽覺傳導(dǎo)通路以及聽覺語言中樞基本是正常的先天性和遲發(fā)性聽力損失，及時(shí)佩戴助聽器或是植入人工耳蝸都可以獲得良好的效果。

綜上，承德市聾病易感基因分子流行病學(xué)研究可以發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性和藥物性聾，這些攜帶者不易在嬰兒階段觀察到臨床表型，更需要在今后的耳聾出生缺陷防控工作中加強(qiáng)家庭養(yǎng)護(hù)方面的健康教育和科普，對(duì)攜帶致病基因的人群在婚前、孕前充分遺傳指導(dǎo)及耳毒性藥物的合理使用，減少和有效推遲耳聾發(fā)生。

致謝：感謝王曉玲和尹琳微對(duì)本文內(nèi)容所做的補(bǔ)充、修改，感謝艾雪、馬國靜對(duì)本項(xiàng)目數(shù)據(jù)進(jìn)行的收集與整理。