基于Akt/GSK-3β通路研究紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦保護作用及血管內(nèi)皮間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化的影響

汪 寧，高 軍，白方會，劉圓方，溫昌明*

基于Akt/GSK-3β通路研究紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦保護作用及血管內(nèi)皮間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化的影響

汪 寧1，高 軍1，白方會1，劉圓方2，溫昌明1*

1. 南陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科腦血管病介入病區(qū)，河南 南陽 473000 2. 南陽市中心醫(yī)院 兒外科，河南 南陽 473000

研究紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠的腦保護作用，并考察其對血管內(nèi)皮間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化與蛋白激酶B/糖原合成激酶-3β（protein kinase B/glycogen synthesizing kinase-3β，Akt/GSK-3β）通路的影響。建立腦缺血再灌注大鼠模型，給予紫檀茋和硫酸氫氯吡格雷片干預(yù)6 d后，檢測大鼠神經(jīng)功能缺損程度；采用ELISA法檢測各組大鼠血清血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、血小板源性CD40配體（CD40L）和血小板P選擇素（P-slelctin，CD62P）水平；采用試劑盒檢測各組大鼠腦組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠腦皮質(zhì)病理變化；采用免疫熒光染色法檢測各組大鼠腦血管內(nèi)皮和間質(zhì)標志物血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達；采用Western blotting法檢測各組大鼠腦血管CD31、α-SMA和腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達情況；采用免疫組化法檢測各組大鼠腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（＜0.05）；血清PAF、CD40L和CD62P水平顯著升高（＜0.05）；腦組織SOD活性顯著降低，MDA水平升高（＜0.05）；腦皮質(zhì)細胞形態(tài)破壞，呈空泡樣壞死，細胞間隙增大，染色變淺，殘存細胞體積縮小，細胞核固縮、深染，細胞邊界不清；腦血管CD31表達減弱，α-SMA表達增強；腦血管CD31和腦皮質(zhì)p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），腦血管α-SMA蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（＜0.05）；血清PAF、CD40L和CD62P水平降低（＜0.05）；腦組織SOD活性升高（＜0.05），MDA水平降低（＜0.05）；腦皮質(zhì)細胞形態(tài)、排列、細胞核清晰度以及間質(zhì)染色均勻度等均改善；腦血管CD31表達增強，α-SMA表達減弱；腦血管CD31和腦皮質(zhì)p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），腦血管α-SMA蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠具有腦保護作用，可抑制血管內(nèi)皮-間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化，其作用機制可能與激活A(yù)kt/GSK-3β通路有關(guān)。

紫檀茋；腦缺血再灌注；血管內(nèi)皮-間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化；蛋白激酶B；糖原合成激酶-3β

缺血性腦血管病為常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦血液循環(huán)障礙為主要特征。腦缺血再灌注是指缺血性腦血管病患者腦部缺血一段時間后恢復(fù)血供，但腦功能非但沒有恢復(fù)，反而出現(xiàn)更嚴重的腦機能障礙的現(xiàn)象[1]。腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的動態(tài)生理病理過程，主要原因是氧化應(yīng)激損傷、細胞炎癥損傷等造成病理級聯(lián)反應(yīng)[2]。Pan等[3]發(fā)現(xiàn)缺血性腦血管疾病與個體血小板功能異常有關(guān)；Chen等[4]發(fā)現(xiàn)缺血性腦血管病可誘導(dǎo)血管的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與血管纖維化，并認為內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腦血管病的潛在治療靶點。腦缺血再灌注后過量自由基攻擊重獲血液供應(yīng)的組織細胞，導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細胞受損，發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

紫檀茋是白藜蘆醇同系衍生物，是從黑莓、藍莓等漿果中提取的一類非黃酮類多酚化合物。Song等[5]發(fā)現(xiàn)紫檀茋可抑制肝細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Malik等[6]發(fā)現(xiàn)紫檀茋可減少氧化應(yīng)激性損傷；Liu等[7]經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)紫檀茋可通過抗炎減輕腦缺血再灌注損傷。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/糖原合成激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）信號通路參與調(diào)節(jié)細胞凋亡，其中GSK-3β是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和凋亡等生物學行為，在腦缺血再灌注時可誘導(dǎo)細胞凋亡，放大級聯(lián)反應(yīng)，加重腦血管細胞凋亡損傷。本研究旨在探究紫檀茋對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用，并考察其對血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，7周齡，體質(zhì)量260～270 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于動物房，溫度24～26 ℃，相對濕度40%～60%，晝夜周期為12 h，自由攝食飲水，實驗開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗操作均符合3R原則，經(jīng)實驗動物倫理委員會批準（批準號2020042216-007）。

1.2 藥品與試劑

紫檀茋（質(zhì)量分數(shù)98.0%，批號20190811）購自寶雞市國康生物科技有限公司，用時以含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水溶解成混懸液；硫酸氫氯吡格雷片（批號20191105）購自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，用時研碎成粉末，溶于蒸餾水，超聲溶解定容到1 mg/mL；大鼠血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、血小板源性CD40配體（CD40L）和血小板P選擇素（P-slelctin，CD62P）ELISA試劑盒購自上海科順生物科技有限公司，批號分別為20190513、20190814、20191108；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號20190712）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號20190917）購自南京建成生物工程研究所；尼龍線栓購自北京西濃科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號ab6721）、熒光血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31）抗體（批號ab28364）、熒光α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號ab232784）、Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗兔二抗（批號ab150077）、兔抗大鼠蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）抗體、糖原合成激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）抗體、p-GSK-3β抗體、CD31抗體、α-SMA抗體、GAPDH抗體（批號分別為ab8805、ab18785、ab141295、ab145937、ab108424、ab8425、ab9485）購自英國Abcam公司。

1.3 儀器

Infinite M20 Pro多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；Light Cycler 96 qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）；Kestrel 200型光學測量顯微鏡（英國Vision公司）；PowerPacUniversal通用電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

取50只大鼠建立腦缺血再灌注大鼠模型[8]：大鼠麻醉后，在頸部正中取切口，暴露右頸內(nèi)、外動脈以及總動脈，眼科剪將頸總動脈剪1個小口，插入線栓直至頸內(nèi)動脈，深度為距離動脈分叉2 mm，結(jié)扎頸內(nèi)動脈，栓塞2 h后拔出線栓。剩余10只大鼠作為假手術(shù)組，其操作同上，但不實施栓塞處理。拔出線栓再灌注24 h，大鼠清醒后，參考Zea-Longa評分法[9]評估大鼠神經(jīng)功能缺損程度，評分為1～3分表示造模成功，納入實驗。共40只大鼠造模成功，隨機分為模型組及紫檀茋低、高劑量（5、10 mg/kg）[10]組和硫酸氫氯吡格雷（6.8 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ip相應(yīng)藥物，模型組和假手術(shù)組ip含0.5%聚山梨酯80的生理鹽水，1次/d，連續(xù)6 d。

2.2 神經(jīng)行為學檢測

末次給藥2 h后，參考Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分標準[9]，評估大鼠神經(jīng)行為學。評分標準：無神經(jīng)功能缺損征象為0分，提尾時病灶對側(cè)前肢收縮為1分，向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，向病灶對側(cè)跌倒為3分，無自發(fā)活動和意識障礙為4分。

2.3 ELISA檢測血清PAF、CD40L和CD62P水平

完成神經(jīng)行為學檢測后處死大鼠，腹主動脈采血10 mL，離心取血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平。

2.4 腦組織SOD活性和MDA水平的檢測

各組大鼠采血后，斷頭取腦，快速沖洗后濾紙吸干水分，于冰上快速分離右側(cè)額極后3～5 mm處大腦皮層，用超聲波細胞粉碎機制成組織勻漿，3500 r/min離心15 min，取上清液，按照試劑盒說明書采取黃嘌呤氧化酶法檢測腦組織SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA水平。

2.5 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠腦皮質(zhì)病理變化

取各組大鼠腦組織，于4%多聚甲醛固定2 d，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，制作4 μm厚的石蠟切片，進行HE染色，經(jīng)脫水、透明后，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察腦皮質(zhì)組織染色結(jié)果。

2.6 免疫熒光染色法檢測大鼠腦血管內(nèi)皮和間質(zhì)標志物CD31和α-SMA表達

取大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟至水，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，TBS沖洗，進行抗原修復(fù)，加入3% H2O2阻斷，用10%山羊血清封閉30 min，棄血清，滴加50 μL CD31抗體（1∶800），4 ℃孵育過夜；TBST沖洗，滴加50 μL HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（1∶4000），37 ℃孵育45 min；滴加50 μL CY3工作液（1∶200），室溫孵育10 min；以pH 6.0檸檬酸抗原修復(fù)5 min，蒸餾水浸洗3 min，加入10%山羊血清，室溫封閉30 min；棄血清，滴加50 μL α-SMA抗體（1∶200），4 ℃孵育過夜；滴加50 μL Alexa Fluor 488偶聯(lián)的驢抗兔二抗（1∶400），37 ℃孵育45 min；滴加50 μL DAPI工作液（1∶500），避光染核5 min；加入熒光封片劑進行封片，避光保存。經(jīng)熒光、明場掃描系統(tǒng)Tissue FAXS PLUS掃描，隨機采集CD31/α-SMA陽性染色大鼠腦組織微血管照片，采用Image J軟件測定α-SMA熒光強度，進行半定量分析。

2.7 Western blotting檢測大鼠腦血管CD31和α-SMA蛋白表達

取各組大鼠腦血管組織，加入裂解液提取蛋白，加入上樣緩沖液，沸水浴使蛋白變性，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入CD31、α-SMA和GAPDH抗體，孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，孵育1 h；加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件檢測蛋白條帶灰度值。

2.8 免疫組化法檢測大鼠腦組織Akt和GSK-3β蛋白表達

取各組大鼠腦組織石蠟切片，脫蠟至水，加檸檬酸，用微波爐進行抗原修復(fù)，加入3% H2O2室溫孵育，分別加入Akt、GSK-3β抗體，孵育過夜；加入二抗孵育1 h，DAB染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，于光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 Western blotting檢測大鼠腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達

取假手術(shù)組、模型組和紫檀茋低、高劑量組大鼠腦皮質(zhì)組織，按“2.6”項下方法提取蛋白，檢測Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達情況。

2.10 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響

如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著降低（＜0.05）。

3.2 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平的影響

如表2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平顯著降低（＜0.05）。

表1 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損評分的影響(, n = 10)

Table 1 Effect of pterostilbene on scores of neurological deficits in rats with cerebral ischemia-reperfusion (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)評分 假手術(shù)—0 模型—3.44±0.39* 紫檀茋52.55±0.18# 101.96±0.22# 硫酸氫氯吡格雷6.81.14±0.11#

與假手術(shù)組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05，下表同

*< 0.05sham group;#< 0.05model group, same as below tables

表2 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平的影響(, n = 10)

Table 2 Effect of pterostilbene on PAF, CD40L and CD62P levels in serum of rats with cerebral ischemia-reperfusion (, n = 10)

組別劑量/ (mg·kg?1)PAF/(ng·mL?1)CD40L/(ng·mL?1)CD62P/(ng·mL?1) 假手術(shù)—0.03±0.0113.42±1.294.15±0.82 模型—0.18±0.03*30.45±2.78*11.49±1.18* 紫檀茋50.15±0.02#25.17±2.16#9.42±0.95# 100.11±0.02#20.39±1.47#7.58±0.81# 硫酸氫氯吡格雷6.80.07±0.01#16.88±1.12#6.55±0.45#

3.3 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性和MDA水平的影響

如表3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOD活性顯著降低（＜0.05），MDA水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織SOD活性顯著升高（＜0.05），MDA水平顯著降低（＜0.05）。

3.4 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)病理變化的影響

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細胞形態(tài)完整，排列整齊，邊緣清晰，細胞核與間質(zhì)著色均勻；模型組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細胞形態(tài)破壞，呈空泡樣壞死，細胞間隙增大，染色變淺，殘存細胞體積縮小，細胞核固縮、深染，細胞邊界不清；與模型組比較，各給藥組大鼠腦皮質(zhì)細胞形態(tài)、排列、細胞核清晰度以及間質(zhì)染色均勻度等均改善。

表3 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦組織SOD活性和MDA水平的影響(, n = 10)

Table 3 Effect of pterostilbene on SOD activity and MDA level in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)SOD/(U·mg?1)MDA/(mmoL·mg?1) 假手術(shù)—43.69±3.181.22±0.25 模型—24.99±2.47*3.88±0.41* 紫檀茋531.28±3.24#2.98±0.32# 1036.94±2.12#2.35±0.27# 硫酸氫氯吡格雷6.840.82±2.55#1.77±0.16#

圖1 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)病理變化的影響(HE, ×400)

3.5 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦血管CD31和α-SMA蛋白表達的影響

CY3標記CD31為血管內(nèi)皮細胞標記物，呈紅色熒光；Alexa Fluor 488標記的α-SMA為血管間質(zhì)細胞標記物，呈綠色熒光。如圖2、3所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦血管CD31表達減弱，α-SMA熒光強度顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦血管CD31表達增強，α-SMA熒光強度顯著降低（＜0.05）。Western blotting結(jié)果如圖4和表4所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦血管CD31蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），α-SMA蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦血管CD31蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），α-SMA蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。

白色箭頭為α-SMA陽性表達，黃色箭頭為CD31陽性表達

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05

圖4 Western blotting檢測各組大鼠腦血管CD31和α-SMA蛋白表達

3.6 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)Akt、GSK-3β陽性表達較少；與模型組比較，紫檀茋組大鼠腦皮質(zhì)Akt、GSK-3β陽性表達較多。Western blotting結(jié)果如圖6和表5所示，各組大鼠腦皮質(zhì)Akt、GSK-3β蛋白表達水平無統(tǒng)計學意義。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，紫檀茋組大鼠腦皮質(zhì)p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。

表4 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦血管CD31和α-SMA蛋白表達的影響(, n = 10)

Table 4 Effect of pterostilbene on CD31 and α-SMA protein expressions in cerebral blood vessels of rats with cerebral ischemia-reperfusion (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)蛋白相對表達量 CD31α-SMA 假手術(shù)—0.91±0.080.09±0.01 模型—0.16±0.02*0.89±0.07* 紫檀茋50.33±0.03#0.65±0.05# 100.45±0.03#0.36±0.04# 硫酸氫氯吡格雷6.80.66±0.04#0.21±0.03#

4 討論

腦缺血再灌注損傷時，缺血大腦恢復(fù)血供后出現(xiàn)的腦部超微結(jié)構(gòu)、功能與代謝等方面進一步損傷，是缺血性腦損傷的延續(xù)與惡化。隨著對神經(jīng)細胞死亡分子機制的深入研究，腦缺血后氧化應(yīng)激損傷和炎癥損傷已被證明是導(dǎo)致再灌注損傷的重要原因。紫檀茋作為一種天然、多功能抗氧化劑，可清除體內(nèi)氧自由基，Keser等[11]研究表明紫檀茋在急性腎缺血再灌注損傷治療中有輔助作用。故本研究選擇紫檀茋為實驗藥物，為紫檀茋在腦缺血再灌注治療中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

圖5 免疫組化法檢測大鼠腦組織Akt和GSK-3β蛋白表達 (×400)

圖6 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達的影響

表5 紫檀茋對腦缺血再灌注大鼠腦皮質(zhì)Akt和GSK-3β蛋白表達的影響(, n = 10)

Table 5 Effect of pterostilbene on Akt and GSK-3β protein expressions in brain cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion (, n = 10)

組別劑量/(mg·kg?1)蛋白相對表達量 Aktp-AktGSK-3βp-GSK-3β 假手術(shù)—0.93±0.130.85±0.090.81±0.080.49±0.04 模型—0.99±0.110.07±0.01*0.82±0.090.03±0.01* 紫檀茋50.97±0.120.15±0.03#0.79±0.090.11±0.02# 101.01±0.130.36±0.03#0.78±0.080.23±0.03#

動物神經(jīng)功能變化是檢測腦缺血再灌注大鼠模型的宏觀指標，神經(jīng)功能缺損評分可反映其神經(jīng)系統(tǒng)破壞程度。本研究結(jié)果顯示，紫檀茋組大鼠神經(jīng)功能缺損評分低于模型組，提示紫檀茋可優(yōu)化腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)效果。腦皮質(zhì)是腦缺血再灌注容易損傷的區(qū)域，大鼠腦皮質(zhì)的HE染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)細胞質(zhì)、細胞核和細胞形態(tài)等均發(fā)生明顯的病理改變，而紫檀茋組大鼠腦皮質(zhì)細胞變性、壞死等病理改善，提示紫檀茋可減輕大鼠腦皮質(zhì)細胞損傷，這對減少腦部神經(jīng)細胞凋亡、保護神經(jīng)功能有一定作用。Khan等[12]發(fā)現(xiàn)紫檀茋可通過抗氧化應(yīng)激作用，改善全腦缺血再灌注和氧化損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)行為改變。腦缺血發(fā)生時腦組織氧供減少，產(chǎn)生大量自由基，引起神經(jīng)元死亡，酶活性喪失。SOD為機體內(nèi)重要的抗氧化酶，對體內(nèi)抗氧化平衡有重要作用。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物，可反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映了細胞受損程度。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，紫檀茋組大鼠腦組織SOD活性增強，MDA水平降低，提示紫檀茋可減輕大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)血小板活化與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生有關(guān)。PAF為內(nèi)源性磷酸介質(zhì)，Belayev等[14]研究表明PAF可誘導(dǎo)血小板聚集，快速促進血小板活化。CD40L是腫瘤壞死因子超家族成員，血清中CD40L含量升高是血小板活化標志，也是預(yù)測心腦血管事件的獨立指標。CD62P為選擇素家族成員，是血小板活化的高靈敏度、特異度指標之一。本研究結(jié)果顯示，紫檀茋組大鼠血清PAF、CD40L和CD62P水平低于模型組，提示紫檀茋可抑制血小板活化。除血小板活化外，血管功能的穩(wěn)定性也是腦缺血再灌注發(fā)生的重要原因。腦缺血后，內(nèi)皮細胞脫離血管內(nèi)皮，經(jīng)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，導(dǎo)致血管周圍間質(zhì)中產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)，從而產(chǎn)生間質(zhì)細胞，減弱內(nèi)皮功能，破壞血管微環(huán)境，減少血供。因此，保護血管內(nèi)皮細胞、減輕內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度，可能對缺血再灌注的腦組織有益。為考察紫檀茋對大鼠腦血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，進行CD31/α-SMA免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)紫檀茋組大鼠腦血管CD31表達增強，α-SMA表達減弱，且經(jīng)半定量檢測發(fā)現(xiàn)α-SMA熒光強度降低，提示紫檀茋對內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有抑制作用。

Akt信號通路是膜受體信號向細胞內(nèi)傳導(dǎo)的主要途徑轉(zhuǎn)移，在心、肺等多種器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮了抑制細胞凋亡的作用[15-16]。Akt蛋白是一種在腦缺血后發(fā)揮保護作用的促生存激酶，可通過磷酸化Ser473殘基而激活，從而磷酸化其下游蛋白如GSK-3β。GSK-3β是廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被激活后，可抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開口，減少線粒體膜電位，從而減少自由基產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。Li等[17]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷的改善與Akt/GSK-3β的激活有關(guān)，Li等[18]發(fā)現(xiàn)Akt可能是結(jié)腸癌細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，白藜蘆醇可能通過Akt/GSK-3β/Snail信號通路逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平降低，提示腦缺血再灌注的發(fā)生抑制了大鼠腦組織Akt、GSK-3β蛋白表達；與模型組比較，紫檀茋組大鼠腦組織p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平升高，提示紫檀茋可促進p-Akt、p-GSK-3β蛋白磷酸化，激活A(yù)kt/GSK-3β通路，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，抑制血小板活化和內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮腦保護作用，這可能是其改善腦缺血再灌注損傷的作用機制。

綜上所述，紫檀茋可能通過激活A(yù)kt/GSK-3β通路，從而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護作用，并抑制腦血管內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of pterostilbene on brain protection and vascular endothelial mesenchymal transition in rats with cerebral ischemia-reperfusion based on Akt/GSK-3β pathway

WANG Ning1, GAO Jun1, BAI Fang-hui1, LIU Yuan-fang2, WEN Chang-ming1

1. Interventional Ward of Cerebrovascular Disease, Department of Neurology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, China 2. Department of Pediatric Surgery, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, China

To study the cerebral protective effect of pterostilbene on cerebral ischemia-reperfusion rats, and investigate its effect on vascular endothelial mesenchymal transition and protein kinase B/glycogen synthesizing kinase-3β (Akt/GSK-3β) pathway.A rat model of cerebral ischemia-reperfusion was established, and after 6 d of intervention with pterostilbene and clopidogrel hydrogen sulfate tablets, degree of neurological deficit in rats was detected; Platelet activating factor (PAF), platelet-derived CD40 ligand (CD40L) and platelet P-selectin (CD62P) levels in serum were detected by ELISA; Kits were used to detect superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) level in brain tissue of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of cerebral cortex of rats in each group; Immunofluorescence staining was used to detect the cerebral vascular endothelial and interstitial markers platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1, also known as CD31) and α-smooth muscle actin (α-SMA) expressions of rats in each group; Western blotting was used to detect CD31 and α-SMA protein expressions in cerebrovascular, Akt and GSK-3β protein expressions in cerebral cortex of rats; Akt and GSK-3β expressions in cerebral cortex of rats in each group were detected by immunohistochemistry.Compared with sham group, neurological deficit score of rats in model group was significantly increased (< 0.05); Levels of PAF, CD40L and CD62P in serum were significantly increased (< 0.05); SOD activity in brain tissue was significantly decreased, and MDA level was increased (< 0.05); Cerebral cortical cells were morphologically damaged, showing vacuolar necrosis, intercellular space was increased, staining was lighted, residual cell volume was reduced, nuclei were pyknotic and hyperchromatic, and cell boundaries were unclear; CD31 expression in cerebral blood vessels was weakened, α-SMA expression was enhanced; CD31 protein expression in cerebrovascular, p-Akt and p-GSK-3β protein expressions in cerebral cortex of rats were significantly decreased (< 0.05), α-SMA protein expression in cerebrovascular was significantly increased (< 0.05). Compared with model group, neurological deficit score of rats in each administration group were significantly decreased (< 0.05); Levels of PAF, CD40L and CD62P in serum were decreased (< 0.05); SOD activity in brain tissue was increased (< 0.05), MDA level of cerebral cortex was decreased (< 0.05); Morphology, arrangement, nuclear clarity and interstitial staining uniformity of cerebral cortex were improved; CD31 expression in cerebral blood vessels was increased, and α-SMA expression was decreased; CD31 protein expression in cerebrovascular, p-Akt and p-GSK-3β protein expressions in cerebral cortex of rats were significantly increased (< 0.05), α-SMA protein expression in cerebrovascular was significantly decreased (< 0.05).Pterostilbene has cerebral protective effect on cerebral ischemia-reperfusion rats, and can inhibit the excessive transition of vascular endothelium to mesenchyme, and its mechanism may be related to the activation of Akt/GSK-3β pathway.

pterostilbene; cerebral ischemia-reperfusion; endothelial-mesenchymal excessive transition; protein kinase B; glycogen synthesis kinase-3β

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2399 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.017

2021-12-24

河南省科技發(fā)展計劃項目（192102310349）

汪 寧（1983—），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向為神經(jīng)內(nèi)科腦血管介入。E-mail: 17165864481@163.com

溫昌明（1974—），男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向為神經(jīng)內(nèi)科腦血管介入。E-mail: qtxvjh@163.com

[責任編輯 李亞楠]