基于CREB/Bcl-2信號通路探究當歸芍藥散改善Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡的作用機制

李 澤，尹 芳，楊 苗，于文靜，羅榮司慶，周金勇，李 平，宋禎彥，成紹武

基于CREB/Bcl-2信號通路探究當歸芍藥散改善Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡的作用機制

李 澤，尹 芳，楊 苗，于文靜，羅榮司慶，周金勇，李 平，宋禎彥*，成紹武*

湖南中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

探究當歸芍藥散對β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）誘導的膽堿能神經(jīng)元損傷的保護作用及相關機制。以30 μmol/L Aβ25-35誘導基底前腦膽堿能神經(jīng)元損傷模型，給予2.5%、5.0%和10.0%當歸芍藥散含藥血清進行干預，采用MTT法檢測細胞存活率；TUNEL法和碘化丙啶（PI）/Hoechst熒光雙染檢測神經(jīng)元凋亡情況；采用膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）/磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB）和ChAT/剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）熒光雙染檢測當歸芍藥散對膽堿能神經(jīng)元的抗凋亡情況；采用Western blotting法檢測CREB/B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）信號通路相關蛋白的表達情況。5.0%和10.0%當歸芍藥散含藥血清可顯著增加Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元存活率（＜0.01），改善Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡（＜0.01），降低Caspase-3活化水平（＜0.01）；10%當歸芍藥散含藥血清能逆轉Aβ誘導p-CREB水平的降低（＜0.01），增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達（＜0.05）。當歸芍藥散可能通過CREB/Bcl-2信號通路改善Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡。

當歸芍藥散；β淀粉樣蛋白；膽堿能神經(jīng)元；細胞凋亡；環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白；B淋巴細胞瘤2

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關的神經(jīng)退行性疾病，其特征為記憶力的進行性喪失和高級認知功能的惡化。目前，導致AD進行性記憶喪失的的具體機制仍不清楚[1]。在許多關于AD發(fā)病機制的假說中，膽堿能假說是唯一將記憶喪失與特定神經(jīng)元子集聯(lián)系在一起的假說。基底前腦膽堿能神經(jīng)元是記憶功能的基礎，無論是β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）富集的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結的特征性改變，還是突觸的炎癥，最終都會匯集到AD廣泛的基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失[2]。環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是參與大腦發(fā)育、神經(jīng)存活和神經(jīng)發(fā)生的主要轉錄因子，大量的研究發(fā)現(xiàn)CREB介導的信號通路在記憶的形成過程和AD的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，激活CREB途徑能抑制膽堿能神經(jīng)元凋亡，改善AD大鼠的記憶障礙[4]。針對膽堿能系統(tǒng)的AD藥物干預也主要作用于CREB相關通路[5]，美國食品和藥物管理局批準的AD膽堿酯酶抑制劑類藥物如多奈哌齊、利斯的明等能增加乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）水平，但它們的療效相對較低，且存在嘔吐、腹瀉、頭暈等不良反應[6]。當歸芍藥散出自張仲景《金匱要略》，經(jīng)臨床驗證其是治療AD的有效方劑[7-8]，實驗研究證明該方可通過抑制神經(jīng)炎癥、抑制神經(jīng)元凋亡、抗氧化等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并能改善AD動物模型的認知功能障礙[9-12]。已有研究表明，該方的君藥當歸提取物當歸多糖可通過激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF/酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase B，TrkB）/CREB途徑提高Ach和膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）水平改善AD大鼠的記憶障礙[13]。本研究以Aβ25-35誘導基底前腦神經(jīng)元構建AD細胞模型，探究當歸芍藥散含藥血清對Aβ25-35誘導的膽堿能神經(jīng)元損傷的保護作用及機制

1 材料

1.1 動物

SPF級妊娠SD大鼠5只，體質量380～420 g，7周齡；SPF級雄性SD大鼠10只，體質量220～260 g，5周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2013-0004。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室內溫度20～24 ℃，相對濕度35%～45%，室內光線12 h明暗交替。動物實驗通過湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批準號LL-2020071501）。

1.2 藥品與試劑

Aβ25-35（批號A4559）、Forskolin（批號F6886）、ChAT鼠抗（批號MAB5270）、山羊抗兔二抗（批號AP132P）、山羊抗鼠二抗（批號AP124）購自美國Sigma-Aldrich公司；MTT（批號M8180）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號T1320）購自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D806645）購自上海麥克林生化科技有限公司；B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）兔抗（批號ab194583）購自英國Abcam公司；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cystein-asparate protease-3，cleaved Caspase-3）兔抗（批號9661）、CREB兔抗（批號9197）、p-CREB兔抗（批號9198）、β-actin鼠抗（批號3700）購自美國CST公司；驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（批號A-10680）、驢抗兔熒光二抗Cy3（批號A10520）、Hoechst 33258（批號H1398）、紅色熒光碘化丙啶（PI）染料（批號P1304MP）購自美國Invitrogen公司；Triton X-100（批號9002-93-1）、5×上樣緩沖液（批號P0015L）購自碧云天公司；RIPA裂解液（批號01408/504074）購自康為世紀生物科技有限公司；ProLong?玻璃抗淬滅封片劑（含NucBlue?染色劑，批號P36983）、BCA蛋白定量分析試劑盒（批號NCI3227CH）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

ChemiDoc XRS＋化學發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；Medifuge?小型臺式離心機、Series 8000 WJ CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Cytation3多功能酶標儀（美國BioTek公司）；A1+共聚焦激光顯微鏡（日本Nikon公司）；AxioVert.A1倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）。

2 方法

2.1 當歸芍藥散含藥血清制備

按照本課題組前期研究方法，當歸芍藥散采用水提法進行提取，通過旋轉蒸餾濃縮和凍干制備凍干粉并進行質量控制，以阿魏酸、芍藥苷、藁本內酯、白術內酯I和乙酰澤瀉醇B為對照品鑒定當歸芍藥散凍干粉主要成分含量，當歸芍藥散提取液中阿魏酸、芍藥苷、藁本內酯、白術內酯I和乙酰澤瀉醇B的質量分數(shù)分別為148.2、5320、400.7、7.2和26.7 mg/kg[14]。100 g生藥制備凍干粉為12.6 g，根據(jù)動物體質量配制質量濃度為生藥2 g/mL（凍干粉0.252 g/mL）的口服液。取雄性SD大鼠10只隨機分為當歸芍藥散含藥血清組和對照組，每組5只，當歸芍藥散含藥血清組大鼠ig當歸芍藥散口服液（生藥24 g/kg），對照組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后ip 10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，暴露腹主動脈，用負壓采血管采集全血5 mL至無抗凝劑的普通采血管中，靜置過夜，3000 r/min離心10 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 膽堿能神經(jīng)元的提取

原代膽堿能神經(jīng)元取自胚胎期16～18 d的SD大鼠，妊娠大鼠ip 50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，斷頭處死。取出胚胎，解剖分離基底前腦，放入解剖緩沖液中（HBSS、10 mmol/L HEPES、1%青霉素/鏈霉素）。組織用0.25%胰蛋白酶消化15 min后，加入脫氧核糖核酸酶/胰蛋白酶抑制劑溶液研磨分解，臺盼藍篩選活細胞。神經(jīng)元以1.5×105/cm2的密度于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)液含有2% B-27和1%青霉素/鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境37 ℃、5% CO2。以5 μmol/L阿糖胞苷作用48 h抑制非神經(jīng)元細胞生長。

2.3 Aβ誘導膽堿能神經(jīng)元模型的構建

Aβ25-35用PBS溶液配制成100 mg/mL的母液，于37 ℃老化48 h。提取基底前腦神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7 d后，在含有不同濃度Aβ25-35（15、30、60 μmol/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，構建Aβ誘導模型。

2.4 MTT檢測細胞存活率

膽堿能神經(jīng)元以5×103/孔接種于96孔板中，設置對照組、模型組和當歸芍藥散（2.5%、5.0%、10.0%）組，模型組給予30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，各給藥組在構建Aβ誘導模型后，分別加入2.5%、5.0%、10.0%當歸芍藥散含藥血清處理24 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。吸棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入含5 mg/mL MTT的DMEM培養(yǎng)基，同時設置調零孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，搖勻后采用酶標儀測定490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－調零)/(對照－調零)

2.5 神經(jīng)元凋亡的測定

膽堿能神經(jīng)元以5×104/孔接種于12孔板中，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，當歸芍藥散（5%、10%）組在構建Aβ誘導模型后，分別加入5%、10%當歸芍藥散含藥血清處理24 h。吸棄培養(yǎng)液，用預冷的含5%冰醋酸的甲醇于4 ℃固定45 min，PBS洗滌3次，用3%牛血清白蛋白于室溫封閉1 h；用Hoechst 33258和PI染色以及TUNEL檢測細胞凋亡。采用A1＋共聚焦激光顯微鏡和AxioVert.A1倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡特征并拍照。

2.6 當歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元Caspase-3活化的影響

2.6.1 免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元ChAT和cleaved Caspase-3蛋白表達 在12孔板中放置圓形蓋玻片，接種5×104個細胞使細胞爬片，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，5%、10%當歸芍藥散組在構建Aβ誘導模型后，分別加入5%、10%當歸芍藥散含藥血清處理24 h。按“2.5”項下方法固定細胞并封閉，PBS清洗3次，分別加入ChAT鼠抗（1∶100）和cleaved Caspase-3兔抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，分別加入驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（1∶600）、驢抗兔Cy3（1∶600），室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，從孔板中撈出圓形蓋玻片，反向扣于載玻片上，用抗淬滅封片劑封片固定，采用A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察和拍照。

2.6.2 圖像獲取與計數(shù) ChAT/Caspase-3雙染色免疫熒光實驗采用基底前腦細胞重復培養(yǎng)3次。對于每次重復，每個條件至少分析2個玻片。細胞計數(shù)時，每張玻片隨機獲得10個目標區(qū)域（20×物鏡，每個視野含有約40～50個細胞）。不同階段A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察，每個通道采集參數(shù)設置（增益、曝光時間、激光強度）保持固定。計數(shù)具有完整的細胞核、共定位胞質cleaved Caspase-3和ChAT的細胞。最終結果顯示cleaved Caspase-3陽性細胞與ChAT陽性神經(jīng)元或ChAT陰性神經(jīng)元的百分比。

2.6.3 Western blotting檢測膽堿能神經(jīng)元cleaved Caspase-3蛋白表達 按“2.6.1”項下方法分組并處理細胞，收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液勻漿，4 ℃孵育30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清。用BCA蛋白定量分析試劑盒測定上清液的總蛋白含量。加入5×上樣緩沖液，100 ℃金屬浴20 min，使蛋白變性，于?80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h；分別加入兔抗cleaved Caspase-3（1∶1000）和鼠抗β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，TBST洗滌3次，每次10 min，孵育對應二抗，37 ℃孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗滌3次，每次10 min，加入顯影液，采用凝膠成像儀成像分析。

2.7 當歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元CREB/Bcl-2通路相關蛋白表達的影響

2.7.1 免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元ChAT和p-CREB蛋白表達 在12孔板中放置圓形蓋玻片，接種5×104個細胞使細胞爬片，模型組用30 μmol/L Aβ25-35處理16 h，F(xiàn)orskolin組和10%當歸芍藥散組在構建Aβ誘導模型后，分別加入10 μmol/L Forskolin、10%當歸芍藥散含藥血清處理24 h。吸棄培養(yǎng)液，用預冷的含5%冰醋酸的甲醇于4 ℃固定45 min，PBS洗滌3次，用3%牛血清白蛋白于室溫封閉1 h；PBS清洗3次，分別加入ChAT鼠抗（1∶100）和p-CREB兔抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，分別加入驢抗鼠熒光二抗Alexa Fluor 488（1∶600）、驢抗兔Cy3（1∶600），室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，從孔板中撈出圓形蓋玻片，反向扣于載玻片上，用抗淬滅封片劑封片固定，采用A1＋共聚焦激光顯微鏡觀察和拍照。

2.7.2 Western blotting檢測膽堿能神經(jīng)元p-CREB、CREB和Bcl-2蛋白表達 按“2.7.1”項下方法分組并處理細胞，提取細胞總蛋白，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，于室溫封閉1 h；分別加入鼠抗p-CREB（1∶1000）、兔抗CREB（1∶1000）、兔抗Bcl-2（1∶1000）和鼠抗β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，TBST洗滌3次，每次10 min，孵育對應二抗，37 ℃孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗滌3次，每次10 min，加入顯影液，采用凝膠成像儀成像分析。

2.8 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

采用SPSS 26.0軟件進行采用單因素方差分析，計量資料以表示，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 當歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元細胞存活率的影響

采用MTT檢測不同濃度Aβ25-35（15、30、60 μmol/L）作用于膽堿能神經(jīng)元細胞的存活率，細胞活率分別為82%、51%、40%，因此選取30 μmol/L Aβ25-35作為Aβ誘導膽堿能神經(jīng)元損傷模型濃度。當歸芍藥散含藥血清對Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元細胞存活率的影響如圖1所示，2.5%、5.0%、10.0%當歸芍藥散作用于Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元的細胞存活率分別為60%、87%和92%，與模型組相比，5.0%、10.0%當歸芍藥散組膽堿能神經(jīng)元細胞存活率顯著升高（＜0.01），提示當歸芍藥散能夠提升Aβ?lián)p傷膽堿能神經(jīng)元的細胞存活率，且呈劑量相關性。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.2 當歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡

TUNEL染色和PI/Hoechest細胞凋亡染色結果見圖2，與模型組相比，5%、10%當歸芍藥散能夠明顯減少神經(jīng)細胞凋亡數(shù)（＜0.01），PI陽性細胞率也顯著降低（＜0.01），且呈劑量相關性，表明當歸芍藥散含藥血清能抑制Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡。

3.3 當歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元Caspase-3活化的影響

為了進一步明確當歸芍藥散是否對膽堿能神經(jīng)元凋亡有抑制作用，采用膽堿能神經(jīng)元標志物ChAT與凋亡標志物cleaved Caspase-3進行免疫熒光雙染。如圖3所示，Aβ毒性作用下基底前腦神經(jīng)元ChAT表達明顯減少，神經(jīng)元相連的胞體崩解破碎，cleaved Caspase-3表達明顯增加；給予當歸芍藥散含藥血清干預后，神經(jīng)元形態(tài)結構趨于完整，ChAT表達明顯增加，cleaved Caspase-3表達明顯減少。進一步檢測了基底前腦神經(jīng)元cleaved Caspase-3表達情況，結果如圖3所示，與對照組相比，模型組促凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達水平明顯升高（＜0.01），5%、10%當歸芍藥散含藥血清能夠顯著降低cleaved Caspase-3蛋白表達水平（＜0.01），且呈劑量相關性。

圖2 當歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡

圖3 當歸芍藥散含藥血清減少Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元cleaved Caspase-3蛋白表達

3.4 當歸芍藥散含藥血清通過CREB/Bcl-2通路抑制Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡

ChAT/p-CREB熒光雙染結果如圖4所示，Aβ毒性作用下基底前腦神經(jīng)元胞體內p-CREB表達明顯減少，給予腺苷酸環(huán)化酶激動劑Forskolin后p-CREB表達顯著增加，10%當歸芍藥散含藥血清組p-CREB表達顯著增加，與Forskolin效果類似。進一步檢測CREB/Bcl-2通路相關蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組p-CREB和Bcl-2蛋白表達水平明顯降低（＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)orskolin和10%當歸芍藥散含藥血清組p-CREB和Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖4 當歸芍藥散含藥血清對Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元CREB/Bcl-2通路的影響

4 討論

中藥含藥血清是方劑藥理學細胞實驗常用的媒介，當歸芍藥散全方由當歸、芍藥、川芎、茯苓、白術和澤瀉6味中藥組成，其中主要藥效成分有單萜苷類成分芍藥苷和芍藥內酯苷，機酸類成分阿魏酸、三萜類成分24-乙酰澤瀉醇A和24-乙酰澤瀉醇B，以及白術內酯I和茯苓酸。本課題組前期已有研究用HPLC-MS/MS技術測定當歸芍藥散提取物和含藥血清中阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸的含量，用于該方提取物及含藥血清的質量控制[15]，并驗證了當歸芍藥散含藥血清具有減少氧化損傷、抗神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)保護作用[10-11]。因此，本研究以此為基礎來驗證當歸芍藥散含藥血清改善Aβ誘導的膽堿能神經(jīng)元凋亡的作用機制。

越來越多的證據(jù)表明Aβ的過度積累是導致AD的最重要的病理事件，Aβ具有直接的神經(jīng)元毒性，同時Aβ的過度沉積會引起神經(jīng)元炎癥反應間接損害神經(jīng)元，最終表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡[16]。膽堿能功能障礙是AD患者記憶加工障礙的主要原因之一。Ach是一種神經(jīng)遞質，在組織內迅速被膽堿酯酶破壞。在神經(jīng)細胞中，Ach由膽堿和乙酰輔酶A在ChAT的催化作用下合成，ChAT是參與Ach合成的關鍵膽堿能標記物[17]。研究認為，人體內Ach含量增多與阿爾茲海默病的癥狀改善顯著相關，Ach的維持對正常功能至關重要，AD患者中ChAT的缺陷和酶活性降低會導致大腦中Ach水平顯著降低[18]。過表達ChAT的人類神經(jīng)干細胞可以通過釋放Ach恢復膽堿能神經(jīng)元功能，同時能恢復小膠質細胞功能，減少Aβ沉積，從而改善AD動物的認知功能[19]。本研究結果表明，Aβ毒性作用下可顯著降低基底前腦神經(jīng)元ChAT蛋白表達，同時誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，提示所觀察到的神經(jīng)元凋亡是膽堿能功能障礙所致。而當歸芍藥散含藥血清可明顯減輕Aβ介導的膽堿能功能障礙，發(fā)揮與腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin類似的作用。

CREB介導的轉錄可由膜受體刺激并激活細胞內通路將信號傳遞到細胞核來啟動，被認為是學習和記憶所需的分子開關，CREB磷酸化被認為是導致轉錄激活的原因，可產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）等細胞因子，在突觸可塑性和認知功能中起關鍵作用[20]。CREB磷酸化過程受損是神經(jīng)退行性疾病的一個已知病理因素，通過促進凋亡的過程觸發(fā)海馬和皮層神經(jīng)元的丟失[21]。CREB的抑制會影響各種記憶測試中的行為表現(xiàn)。相反，CREB的過度表達抑制了神經(jīng)細胞凋亡，并通過激活CREB/神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）信號通路恢復膽堿能和抗凋亡活性，從而改善東莨菪堿毒性所致的小鼠認知功能障礙[22]。因此在與認知相關的大腦區(qū)域中通過藥物干預誘導CREB磷酸化，可能成為開發(fā)治療AD藥物的新途徑。Bcl-2的上游啟動子區(qū)域有1個CREB結合位點，該位點已被證明是由CREB的激活引起B(yǎng)細胞活化來挽救細胞凋亡，說明CREB/Bcl-2通路具有抗凋亡作用[23]。本研究結果顯示，當歸芍藥散含藥血清顯著增加了CREB在基底前腦神經(jīng)元的磷酸化水平。此外，與對照組相比，當歸芍藥散含藥血清治療后基底前腦神經(jīng)元抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著增加，凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3的表達顯著降低。TUNEL染色實驗表明，當歸芍藥散含藥血清治療后，基底前腦神經(jīng)元凋亡明顯減少。這些結果表明當歸芍藥散含藥血清可能通過激活CREB磷酸化和CREB/Bcl-2通路抑制神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮膽堿能神經(jīng)元保護作用。

綜上，本研究證明了當歸芍藥散含藥血清對Aβ所致基底前腦神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)損傷具有保護作用，其機制可能是激活CREB/Bcl-2信號通路和抑制凋亡相關通路，從而對膽堿能系統(tǒng)發(fā)揮保護作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Danggui Shaoyao San on ameliorating Aβ-induced apoptosis of cholinergic neurons based on CREB/Bcl-2 signaling pathway

LI Ze, YIN Fang, YANG Miao, YU Wen-jing, LUO Rong-si-qing, ZHOU Jin-yong, LI Ping, SONG Zhen-yan, CHENG Shao-wu

Hunan Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To study the protective effect and mechanism of Danggui Shaoyao San (當歸芍藥散, DSS) on amyloid β-protein (Aβ)-induced cholinergic neuron injury.Basal forebrain neuron injury model was induced by 30 μmol/L Aβ25-35, 2.5%, 5.0% and 10.0% DSS containing serum were given for intervention, MTT assay was used to detect cell survival rate; TUNEL and PI/Hoechst fluorescence staining were used to detect neuronal apoptosis; Choline acetyltransferase (ChAT)/phosphorylated cAMP-response element binding protein (p-CREB) and ChAT/cleaved cystein-asparate protease-3 (Caspase-3) fluorescence double staining were used to detect the anti-apoptotic effect of DSS on cholinergic neurons; Western blotting was used to detect the expressions of CREB/B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) signaling pathway related proteins.DSS serum (5.0% and 10.0%) significantly increased the cell survival rate of Aβ-injured cholinergic neurons (< 0.01), improved Aβ-induced apoptosis (< 0.01) and decreased activation level of Caspase-3 (< 0.01). DSS serum (10%) reversed Aβ-induced decrease in p-CREB level (< 0.01) and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 (< 0.05).DSS may ameliorate Aβ-induced apoptosis of cholinergic neurons through CREB/Bcl-2 signaling pathway.

Danggui Shaoyao San; amyloid β-protein; cholinergic neuron; apoptosis; cAMP-response element binding protein; B-cell lymphoma 2

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2376 - 07

.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.014

2021-12-28

國家自然科學基金資助項目（81774129）；國家自然科學基金資助項目（82004184）；湖南省教育廳科研基金重點項目（21A0241）；2019年湖湘高層次人才聚集工程-創(chuàng)新人才（2019RS1064）；2021年度湖南省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202110541049）

李 澤，碩士，研究方向為中西醫(yī)結合神經(jīng)退行性疾病防治研究。E-mail: 769428761@qq.com

宋禎彥，碩士，高級實驗師，主要從事中西醫(yī)結合神經(jīng)退行性疾病防治研究。E-mail: songzhenyan2013@hnucm.edu.cn

成紹武，博士，教授，研究方向為中西醫(yī)結合防治神經(jīng)退行性疾病。E-mail: scheng@hnucm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]