基于抗凝血活性的丹紅注射液生物效價(jià)測(cè)定方法的建立

張宇航，楊 靜，吳宿慧*，李寒冰，唐進(jìn)法

基于抗凝血活性的丹紅注射液生物效價(jià)測(cè)定方法的建立

張宇航1，楊 靜1，吳宿慧1*，李寒冰1，唐進(jìn)法2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省健康衰老產(chǎn)業(yè)工程研究中心，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省中藥臨床應(yīng)用、評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，河南 鄭州 450000

以凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）為指標(biāo)，建立丹紅注射液（Danhong Injection，DHI）抗凝血生物效價(jià)測(cè)定方法，以評(píng)價(jià)其質(zhì)量。收集10批次合格DHI，同時(shí)采用光照、高溫、暴露進(jìn)行穩(wěn)定性加速處理，共得樣品40批。工作參照物的制備采用丹酚酸B、羥基紅花黃色素A與輔料1∶1∶8混合，并調(diào)制成40 mg/mL。按照“量反應(yīng)平行線（3.3）法”設(shè)計(jì)抗凝血活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，所用的血漿為4只家兔等比混合的血漿，藥物劑間距為1∶0.8，半自動(dòng)凝血分析儀測(cè)定TT值，對(duì)線性關(guān)系、可靠性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行考察，優(yōu)化并確定檢測(cè)條件，即反應(yīng)體系為100 μL血漿＋工作參照物或樣品溶液50 μL＋凝血酶試劑100 μL，對(duì)樣品開展生物效價(jià)檢測(cè)。工作參照物和DHI在20～40 mg/mL時(shí)，與TT值線性關(guān)系良好，值分別為0.982 7、0.969 6。生物效價(jià)結(jié)果表明工作參照物和合格的DHI均具有顯著的抗凝血活性，且結(jié)果能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，10批次DHI的效價(jià)值范圍為3700～4300 U/mL；與加速處理的樣品生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果比較，暴露、光照處理DHI樣品可被全部檢出，高溫處理DHI檢出率80%。所建立的生物效價(jià)方法用于DHI的質(zhì)量評(píng)價(jià)，具有精密度高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠的特點(diǎn)。

生物效價(jià)；丹紅注射液；量反應(yīng)平行線；凝血酶時(shí)間；質(zhì)量評(píng)價(jià)

中藥注射劑（traditional Chinese medicine injection，TCMI）是遵循中醫(yī)藥理論，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，利用先進(jìn)技術(shù)手段從天然藥物的單方或復(fù)方中提取有效物質(zhì)精制而成的，可供注入體內(nèi)的溶液、乳狀液、臨用前配制為溶液的粉末或濃溶液的滅菌制劑[1]。中藥注射劑在心腦血管領(lǐng)域、呼吸系統(tǒng)均具有顯著成就，尤其是對(duì)中重型和危重型新冠肺炎患者的治療發(fā)揮著重要作用[2-4]，充分證明了中藥注射劑的卓著療效。但是隨著中藥注射劑的普及使用，不良反應(yīng)時(shí)有報(bào)道。中藥質(zhì)量可控是保證中藥臨床安全和有效的重要前提，“質(zhì)量可控、安全有效”也是我國(guó)藥品研發(fā)的首要原則[5]。目前，對(duì)于中藥及中藥注射劑，已經(jīng)建立了以指標(biāo)性成分檢測(cè)為核心的中藥質(zhì)量評(píng)控體系，然而，這種方法存在與臨床功效和安全性關(guān)聯(lián)不緊密的問(wèn)題，難以評(píng)控中藥及中藥注射劑的內(nèi)在質(zhì)量，故常受到業(yè)內(nèi)外的質(zhì)疑和詬病[6]。

生物檢定是利用生物體包括整體動(dòng)物、離體組織、器官、細(xì)胞和微生物等評(píng)估藥物生物活性的一種方法。特別適用于成分不明確或未找到合適理化檢驗(yàn)方法的物質(zhì)，如中藥、生物制品?，F(xiàn)代意義上的生物檢定多開始于抗生素的生物檢定，但是并不局限于此[7]。采用生物檢定的方法來(lái)評(píng)價(jià)中藥或其制劑的質(zhì)量已被廣泛認(rèn)可。與傳統(tǒng)化學(xué)指標(biāo)性成分含量測(cè)定不同，生物檢定因具有藥效相關(guān)、整體可控等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制模式和方法，已經(jīng)成為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的重要發(fā)展方向之一[8]，“中藥生物活性指導(dǎo)原則”也得到國(guó)家藥典委員會(huì)的認(rèn)可，被收錄于《中國(guó)藥典》[9]。如有研究報(bào)道采用抗病毒活性的生物評(píng)價(jià)方法來(lái)控制板藍(lán)根的質(zhì)量[10]；采用抗血小板聚集的生物效價(jià)方法評(píng)價(jià)水蛭、當(dāng)歸、大黃等中藥的質(zhì)量[11-13]；采用生物毒價(jià)的方法評(píng)價(jià)雷公藤的肝毒性[14]。

本實(shí)驗(yàn)以療效確切、臨床用量大同時(shí)少見不良反應(yīng)報(bào)道的丹紅注射液（Danhong Injection，DHI）為示范，開展中藥注射液生物效價(jià)質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。DHI主要由中藥丹參與紅花配伍而成，具有活血化瘀、通脈舒絡(luò)的功效，常用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)，冠心病、淤血型肺心病、心絞痛、腦血栓等。常見的不良反應(yīng)有皮膚過(guò)敏、胸悶、心悸、頭痛等。因此，提高和完善DHI的現(xiàn)有質(zhì)量控制模式和方法，對(duì)于保證其臨床使用的安全有效至關(guān)重要。

生物評(píng)價(jià)的關(guān)鍵在于與藥效相關(guān)的評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇。臨床上，常通過(guò)凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）監(jiān)測(cè)凝血共同途徑、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）監(jiān)測(cè)內(nèi)源性凝血途徑、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）監(jiān)測(cè)外源性凝血途徑，凝血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能有出血的風(fēng)險(xiǎn)，過(guò)短則可能形成血栓阻礙血液流通。DHI具有活血化瘀，通脈舒絡(luò)的功效。故DHI的生物檢定評(píng)價(jià)指標(biāo)可選擇APTT、TT、PT等。TT是指在待測(cè)血漿中加入標(biāo)定的凝血酶溶液，在凝血酶的作用下，血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白絲所需的時(shí)間[15]。因此，本研究擬圍繞以上指標(biāo)開展DHI活血生物效價(jià)測(cè)定。

本研究收集10批DHI合格樣品，并根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部中原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則和文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行處理[9,16]，獲得高溫處理樣品10批、光照處理樣品10批、暴露處理樣品10批。利用生物檢定的原理，以TT為指標(biāo)，建立了測(cè)定DHI抗凝血活性的方法，為DHI的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的研究思路與方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SC40型半自動(dòng)凝血分析儀，泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司；BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，26.0版，美國(guó)IBM公司；BS2000生物統(tǒng)計(jì)軟件，中國(guó)食品藥品檢定研究院；Multifuge X1R型高速離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；FDU-1200型冷凍干燥儀，日本EYELA東京理化器械株式會(huì)社。

1.2 動(dòng)物

日本大耳白兔4只，雄性，體質(zhì)量約2.5 kg，由陜西西咸新區(qū)灃東新城實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2017-002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循河南中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 試劑與藥品

丹酚酸B（批號(hào)P13N11F130912，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑（批號(hào)J20GR152301），上海源葉生物科技有限公司；羥基紅花黃色素A，批號(hào)619F021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，北京索萊寶科技有限公司；TT測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50301-37-7）、APTT測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50201-36-1）、PT測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50101-30-1），泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司。10批次DHI，批號(hào)20061020、19101025、20031019、20071020、20111019、20011002、20031004、20061007、20041004、20101005，均來(lái)源于山東丹紅制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DHI穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)[9,16]

2.1.1 高溫處理樣品 取正常合格DHI樣品若干支，于（60±5）℃恒溫放置10 d制得。

2.1.2 光照處理樣品 取正常合格DHI樣品若干支，于（4000±500）lx條件下放置10 d制得。

2.1.3 暴露處理樣品 取正常合格DHI樣品若干支，開啟瓶口與室溫避光開放條件下放置10 d制得。

2.1.4 光照、高溫、暴露處理結(jié)果 DHI經(jīng)光照、高溫、暴露處理結(jié)果見圖1。DHI經(jīng)過(guò)光照、高溫處理后，顏色、氣味均與合格樣品無(wú)異，未見沉淀產(chǎn)生；經(jīng)暴露處理后，出現(xiàn)顏色發(fā)黑現(xiàn)象，部分瓶?jī)?nèi)有菌落或膠狀物質(zhì)產(chǎn)生。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法的選擇與條件優(yōu)化

2.2.1 TT測(cè)定的方法 取一次性血凝儀四聯(lián)測(cè)試杯，每通道加入血漿100 μL，待測(cè)藥液50 μL和測(cè)試珠1顆，輕輕搖動(dòng)，使血漿和藥物混合均勻，放置在預(yù)溫區(qū)，37 ℃預(yù)溫3 min，結(jié)束后迅速轉(zhuǎn)移至測(cè)試區(qū)，并加入100 μL的凝血酶試劑，立即開始計(jì)時(shí)。每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定4次[17-18]。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)體系條件優(yōu)化 為了獲得靈敏、穩(wěn)定、可靠的抗凝血活性測(cè)定結(jié)果，分別以純水和生理鹽水為溶媒對(duì)DHI稀釋，考察不同體積分?jǐn)?shù)DHI對(duì)TT的影響。結(jié)果表明（圖2），以純水為溶媒時(shí)DHI的體積分?jǐn)?shù)（）與TT值（）呈線性回歸關(guān)系為＝2.734 2＋10.954 0，＝0.992 9，表明線性關(guān)系良好，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故選擇純水作為溶媒。

圖1 光照、高溫、暴露處理DHI結(jié)果

圖2 不同溶劑對(duì)TT的影響

對(duì)DHI的凝血相關(guān)指標(biāo)APTT、PT、TT進(jìn)行考察，結(jié)果（圖3）表明，TT對(duì)DHI體積分?jǐn)?shù)變化更靈敏，線性關(guān)系更可靠（＝2.734 2，＝0.992 9），故最終選擇TT為DHI抗凝血活性測(cè)定指標(biāo)。

2.2.3 工作參照物的制備 工作參照物是本研究中測(cè)量供試樣品生物效價(jià)的基準(zhǔn)，是控制供試樣品質(zhì)量必不可少的工具。生物效價(jià)檢測(cè)用工作參照物應(yīng)符合同質(zhì)性、代表性、均一性、穩(wěn)定性、可延性的原則[19-21]。依據(jù)上述原則經(jīng)單因素考察，選擇丹酚酸B和羥基紅花黃色素A為活性成分，甘露醇為藥用輔料（經(jīng)考察甘露醇性質(zhì)穩(wěn)定，加入后可使工作參照物更易稱量和保存且不影響測(cè)定結(jié)果），制備成工作參照物。

圖3 DHI對(duì)APTT、PT、TT的影響(純水)

精確稱取丹酚酸B、羥基紅花黃色素A對(duì)照品各4 mg，精確稱取甘露醇32 mg，溶解于1 mL純水中，搖勻，得質(zhì)量濃度為40 mg/mL的工作參照物溶液，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，此質(zhì)量濃度下工作參照物與DHI所產(chǎn)生的生物效應(yīng)相當(dāng)。為方便計(jì)算，定義每毫克工作參照物效價(jià)為100 U。

2.2.4 DHI供試品溶液的配制 取各批次正常及光照、高溫、暴露DHI，以純水為溶劑，按照1∶0.8的劑間距配制成3個(gè)連續(xù)的不同質(zhì)量濃度的DHI供試樣品[22]。

2.2.5 血漿的制備 取健康家兔，取血前禁食12 h，兔耳緣靜脈取血，加枸櫞酸鈉溶液與血液以1∶9抗凝，上下輕輕顛倒混勻，使抗凝劑與血液充分混合均勻，于冰上靜置至少30 min，4 ℃，3000×離心10 min，取上層血漿即得。經(jīng)考察使用等比混合血漿更易于測(cè)定且結(jié)果誤差小、穩(wěn)定性高。

2.3 樣品生物效價(jià)測(cè)定

2.3.1 線性關(guān)系考察 取20031004批次DHI，使用純水分別稀釋成40、32、24、16、8、4 mg/mL的DHI溶液；取工作參照物溶液，使用純水分別稀釋至40、35、30、25、20 mg/mL，按照“2.2.1”項(xiàng)中TT測(cè)定方法測(cè)定每個(gè)質(zhì)量濃度的TT值。

結(jié)果如圖4，以工作參照物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），TT值為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.244＋8.02，＝0.982 7。結(jié)果表明，工作參照物質(zhì)量濃度在20～40 mg/mL與TT值的線性關(guān)系良好；以DHI的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），所得TT值為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝0.104 1＋12.336，＝0.969 6。結(jié)果表明，DHI在4～40 mg/mL與TT值的線性關(guān)系良好。

圖4 工作參照物與DHI線性關(guān)系

2.3.2 可靠性檢驗(yàn) 取20031004批次DHI，按照“2.2”項(xiàng)中工作參照物和DHI供試品制備方法制備工作參照物和DHI供試品，檢測(cè)二者TT，并通過(guò)生物統(tǒng)計(jì)軟件BS2000進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。可靠性檢驗(yàn)是檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品（S）和供試品（T）的2條直線是否平行的檢驗(yàn)，即驗(yàn)證S和T的劑量反應(yīng)關(guān)系是否顯著偏離直線、平行，對(duì)不是顯著偏離直線、平行的結(jié)果，認(rèn)為可靠性成立，方可計(jì)算T的效價(jià)和可信限[24]。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部中量反應(yīng)平行線法可靠性檢驗(yàn)結(jié)果成立的判別要求，量反應(yīng)平行線（3.3）法可靠性測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，回歸項(xiàng)應(yīng)非常顯著（＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線各項(xiàng)均應(yīng)不顯著（＞0.05）。DHI抗凝血活性可靠性檢驗(yàn)中回歸項(xiàng)和二次曲線項(xiàng)用來(lái)檢驗(yàn)S和T是直線還是二次曲線關(guān)系，結(jié)果中回歸項(xiàng)極顯著（＜0.01），說(shuō)明隨著工作參照物S和DHI T的給藥劑量的增加，TT也逐漸有規(guī)律的增加，即量效呈直線關(guān)系。偏離平行項(xiàng)和反向二次曲線用來(lái)檢驗(yàn)S和T的平行性，回歸項(xiàng)極顯著，偏離平行以下各項(xiàng)都不顯著，則S和T為平行直線。結(jié)果中偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著（＞0.05），說(shuō)明S和T 2條直線是平行關(guān)系（表1）。說(shuō)明本方法能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，可認(rèn)為S和T具有同質(zhì)性，所以T的生物效價(jià)可看作為稀釋或濃縮一定倍數(shù)的S的生物效價(jià)。

2.3.3 精密度考察 取20031004批次DHI，按照“2.2”項(xiàng)中DHI供試品制備方法制作DHI供試品溶液，檢測(cè)TT，并通過(guò)BS2000進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，連續(xù)6次測(cè)定均能夠通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，求得效價(jià)值的RSD值為5.19%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

表1 DHI抗凝血活性可靠性檢驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Reliability test results of DHI anticoagulant activity

變異來(lái)源自由度差方和方差F值P值 試品間10.0420.042＜1.000＞0.05 回歸115.01615.01620.814＜0.01 偏離平行11.8911.8912.621＞0.05 二次曲線10.0350.035＜1.000＞0.05 反向二次曲線10.0050.005＜1.000＞0.05 劑間516.9893.3984.710＜0.01 誤差1812.9860.721

2.3.4 重復(fù)性考察 取20031004批次DHI，按照“2.2”項(xiàng)中DHI供試品制備方法平行制備6份DHI供試品溶液，檢測(cè)TT，并通過(guò)BS2000進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液均通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，效價(jià)值的RSD值為4.91%，表明所用方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取20031004批次DHI，按照“2.2”項(xiàng)中DHI供試品溶液制備方法制作DHI供試品溶液，分別于制備好后的0、1、2、3、4 h檢測(cè)TT，并通過(guò)BS2000進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。結(jié)果，5次測(cè)定的效價(jià)值RSD為8.06%。這說(shuō)明為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，供試品最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3.6 DHI抗凝血活性生物效價(jià)測(cè)定 按照“2.2.3”和“2.2.4”項(xiàng)下方法分別制備工作參照物和供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下TT檢測(cè)方法測(cè)定。以工作參照物溶液為S組，各DHI供試品溶液為T組，按照《中國(guó)藥典》2020年版四部和《藥品生物檢定》中量反應(yīng)平行線（3.3）法[9,23]，將各劑量組所得的TT時(shí)間填入BS2000，設(shè)定相鄰劑量間比值為0.8，并估計(jì)DHI效價(jià)值4000 U/mL，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)可靠性檢驗(yàn)的結(jié)果判斷S和T是否平行，計(jì)算DHI的效價(jià)（Pt）及可信限率（FL）。結(jié)果表明（表2），10批次合格樣品均可以通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，平均效價(jià)值為3 998.5 U/mL與估計(jì)效價(jià)值4000 U/mL相近，說(shuō)明對(duì)DHI的估計(jì)效價(jià)值準(zhǔn)確。正常DHI效價(jià)值為3700～4300 U/mL。

表2 10批次正常DHI可靠性檢驗(yàn)及生物效價(jià)結(jié)果

Table 2 Reliability test and biological potency results of 10 batches of normal DHI

批號(hào)P值效價(jià)值/(mg?mL?1)平均效價(jià)/(mg?mL?1)可信限率/% 回歸偏離平行二次曲線反向二次曲線 20061020＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 018.03 998.514.3 19101025＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 711.9 17.6 20031019＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 863.4 11.0 20071020＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 833.9 14.7 20111019＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 100.0 15.9 20011002＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 268.6 15.6 20031004＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 733.7 11.5 20061007＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 843.6 18.1 20041004＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 120.2 12.2 20101005＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 284.2 13.6

2.3.7 光照、高溫、暴露處理DHI抗凝血活性生物效價(jià)測(cè)定結(jié)果 光照、高溫、暴露處理的DHI樣品的可靠性結(jié)果和效價(jià)的結(jié)果如表3。結(jié)果表明，光照處理的DHI樣品8個(gè)批次的可靠性檢驗(yàn)偏離平行項(xiàng)、二次曲線項(xiàng)或反向二次曲線項(xiàng)均有出現(xiàn)極顯著差異（＜0.01）或顯著差異者（＜0.05），說(shuō)明這些批次的S和T 2直線不能平行，即不能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，不符合《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)量反應(yīng)平行線（3.3）法可靠性檢驗(yàn)的規(guī)定。而通過(guò)可靠性檢驗(yàn)的L20011002、L19101025 2個(gè)批次效價(jià)值較合格樣品有顯著降低，均低于正常DHI效價(jià)范圍。造成這種結(jié)果的原因可能是因?yàn)楣庹帐沟闷渲谢钚猿煞职l(fā)生變化有關(guān)。比如酚酸類成分多含有酯鍵、呋喃環(huán)、羧基、鄰二酚羥基、羥基、雙鍵和酚羥基結(jié)構(gòu)，光照條件下易產(chǎn)生自由基，進(jìn)而引發(fā)鏈反應(yīng)，促進(jìn)C-C或C＝C斷裂[25]，或酚酸類成分中，酯鍵、不飽和鍵、酚羥基等因光照發(fā)生氧化縮合反應(yīng)[26]。上述原因均可破壞DHI的原本物質(zhì)內(nèi)涵，改變其化學(xué)成分組成，并在生物效價(jià)中得以體現(xiàn)。

表3 光照、高溫、暴露DHI可靠性檢驗(yàn)與生物效價(jià)結(jié)果

Table 3 Reliability test and biological potency results of DHI exposed to illumination, high temperature and exposure

處理因素批號(hào)P值效價(jià)值/(mg?mL?1)平均效價(jià)/(mg?mL?1)可信限率/% 回歸偏離平行二次曲線反向二次曲線 光照樣品L20111019＜0.01＞0.05＜0.05＜0.05?3 529.1? L20101005＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05? ? L20061020＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05? ? L20071020＜0.01＞0.05＜0.01＞0.05? ? L20031019＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05? ? L20061007＜0.01＜0.01＜0.05＜0.01? ? L20041004＜0.01＜0.01＞0.05＜0.01? ? L20031004＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05? ? L20011002＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 406.1 16.0 L19101025＜0.01＞0.05＞0.05＞0.053 652.0 15.4 高溫樣品T20111019＜0.01＜0.05＞0.05＞0.05?4 106.6? T20101005＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 138.2 9.6 T20061020＜0.01＞0.05＜0.01＜0.05? ? T20071020＜0.01＜0.05＜0.05＜0.05? ? T20031019＜0.01＜0.01＜0.05＜0.05? ? T20061007＜0.01＜0.05＜0.01＜0.01? ? T20041004＜0.01＜0.01＜0.05＜0.05? ? T20031004＜0.01＜0.01＞0.05＜0.01? ? T20011002＜0.01＞0.05＞0.05＜0.05? ? T19101025＜0.01＞0.05＞0.05＞0.054 075.0 14.0 暴露樣品E20111019＜0.01＜0.05＜0.01＜0.01??? E20101005＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05? ? E20061020＜0.01＜0.01＞0.05＞0.05? ? E20071020＜0.01＜0.05＜0.05＜0.05? ? E20031019＜0.01＞0.05＜0.01＜0.05? ? E20061007＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05? ? E20041004＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05? ? E20031004＜0.01＞0.05＜0.05＞0.05? ? E20011002＜0.01＞0.05＞0.05＜0.05? ? E19101025＜0.01＞0.05＜0.05＜0.05? ?

“?”表示樣品未通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，故不做生物效價(jià)及可信限率計(jì)算

“?” it indicated that the sample failed the reliability test, so the biological potency and credible limit rate were not calculated

高溫處理的DHI樣品8個(gè)批次的可靠性檢驗(yàn)偏離平行項(xiàng)、二次曲線項(xiàng)或反向二次曲線項(xiàng)均有出現(xiàn)極顯著差異（＜0.01）或顯著差異者（＜0.05），說(shuō)明這些批次的S和T 2直線不能平行，即不能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)，不符合《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)量反應(yīng)平行線（3.3）法可靠性檢驗(yàn)的規(guī)定。而通過(guò)可靠性檢驗(yàn)的T20101005、T19101025 2個(gè)批次DHI樣品效價(jià)值與正常DHI相比無(wú)明顯差異。造成這種結(jié)果的原因可能是由于成分受溫度變化較小引起，比如多糖在超過(guò)80 ℃會(huì)發(fā)生降解；丹酚酸B的含量在超過(guò)60 ℃時(shí)會(huì)大大降低，而丹參素、原兒茶醛的含量會(huì)相應(yīng)增加，使得最終酚酸類成分沒有顯著變化甚至可能有些提高[27]?；蛘呒t花中的成分可能在高溫的情況下發(fā)生降解，生成較多的對(duì)香豆酸產(chǎn)物，香豆酸的積累使得總的生物效應(yīng)沒有顯著變化[28]。

暴露處理的10批DHI可靠性檢驗(yàn)中回歸項(xiàng)、偏離平行項(xiàng)、二次曲線項(xiàng)和反向二次曲線項(xiàng)均有出現(xiàn)極顯著（＜0.01）或顯著（＜0.05）的情況，說(shuō)明這些暴露處理的DHI均不能通過(guò)可靠性檢驗(yàn)。這可能是由于長(zhǎng)期暴露于空氣中，注射液中的多糖等成分使得微生物滋生，微生物或空氣中的氧氣使丹參中酚酸類成分發(fā)生氧化、開環(huán)等反應(yīng)造成的。

3 討論

生物檢定的方法有量反應(yīng)平行線和質(zhì)反應(yīng)平行線的方法，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的TT屬于量反應(yīng)，適合使用量反應(yīng)平行線的方法進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。《中國(guó)藥典》2020年版量反應(yīng)檢定主要有（2.2）法、（3.3）法、（4.4）法[9,23]。（2.2）法中，因?yàn)镾和T均是兩個(gè)劑量，而2點(diǎn)間又總是直線，因此當(dāng)S和T實(shí)際上是二次曲線的關(guān)系時(shí)，（2.2）法便不能準(zhǔn)確的反應(yīng)受檢藥物的量效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)選用的（3.3）法反應(yīng)點(diǎn)較（2.2）法更多，比（2.2）法更能準(zhǔn)確的反應(yīng)受檢藥物的量效關(guān)系，一旦劑量超出回歸的劑量范圍，就可能出現(xiàn)偏離直線、偏離平行、二次曲線、反向二次曲線等不符合可靠性檢驗(yàn)的結(jié)果，由此可見（3.3）法更能反映出因劑量安排不當(dāng)所存在的問(wèn)題，所得結(jié)果更為可靠[23]。量反應(yīng)平行線（4.4）法反應(yīng)點(diǎn)更多，但是條件苛刻，步驟繁瑣，未被廣泛采用，而（3.3）法應(yīng)用廣泛。

生物效價(jià)測(cè)定要與其功效密切相關(guān)，DHI抗凝活性的測(cè)定與其活血化瘀的功效直接相關(guān)，經(jīng)上述條件測(cè)定和方法條件優(yōu)化，本研究以TT為DHI抗凝血活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，并配置工作參照物標(biāo)定了其抗凝血活性，通過(guò)對(duì)條件的探索與優(yōu)化，建立了量反應(yīng)平行線（3.3）法測(cè)定DHI抗凝血活性的方法。分別對(duì)10批正常DHI及光照、高溫、暴露處理的DHI進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所使用的方法可用于正常DHI生物效價(jià)測(cè)定，DHI的效價(jià)值為3700～4300 U/mL；與正常DHI相比，可將光照及暴露處理的DHI全部檢出，對(duì)高溫處理的DHI檢出率為80%。

同時(shí)，本課題組對(duì)上述樣品同步開展了化學(xué)指紋圖譜測(cè)定，結(jié)果為經(jīng)光照、高溫處理的樣品化學(xué)指紋圖譜與正常樣品相似度均＞0.90，但多數(shù)特征峰的峰面積有所下降，而暴露處理的樣品化學(xué)指紋圖譜與正常樣品存在較大差異（相似度＜0.90）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)樣品指紋圖譜與效價(jià)結(jié)果存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性：光照處理樣品中的某些成分如丹酚酸類易發(fā)生水解、開環(huán)等反應(yīng)，藥物化學(xué)成分的改變是導(dǎo)致指紋圖譜改變和效價(jià)值降低的重要原因。另?yè)?jù)報(bào)道在較高溫度下（一般為80 ℃以上）可使丹酚酸類成分降解為丹參素、咖啡酸等小分子酚酸類活性成分[25,29]，而本研究測(cè)定的高溫處理的樣品與正常樣品的化學(xué)指紋圖譜相似度在0.90以上，可能的原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)高溫加速條件按有關(guān)要求設(shè)定為60 ℃，同時(shí)高溫造成的酚酸類降解過(guò)程中存在逆反應(yīng)過(guò)程[25]。

盡管如此，生物效價(jià)測(cè)定仍能檢出80%的高溫加速處理樣品。暴露處理的樣品化學(xué)指紋圖譜中丹酚酸A缺失，由于該成分是重要活性成分之一，因此這些樣品在指紋圖譜相似度及效價(jià)方面均與正常樣品有較大差異。以上表明生物效價(jià)的質(zhì)量評(píng)控方法可提高加速處理樣品的檢出率，并且所得結(jié)果與DHI的活血化瘀的功效更相關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以TT值為抗凝血活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)量反應(yīng)平行線（3.3）法建立了DHI抗凝血生物效價(jià)測(cè)定方法，該方法精密度、重復(fù)性好，結(jié)果可靠。然而，生物效價(jià)檢測(cè)用工作對(duì)照品的制備有待規(guī)范，所建立的測(cè)定條件和方法的穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步提高，本課題組將進(jìn)一步深入研究，最終將建立規(guī)范的基于生物效價(jià)檢測(cè)的DHI質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Danhong Injection based on anticoagulant biological potency

ZHANG Yu-hang1, YANG Jing1, WU Su-hui1, LI Han-bing1, TANG Jin-fa2

1. Henan Health-Aging Engineering Research Center, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Province Engineering Research Center for Clinical Application, Evaluation and Transformation of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To establish a method for determining the anticoagulant biological potency of Danhong Injection (DHI) with thrombin time (TT) as an index, so as to evaluate its quality.Ten batches of qualified DHI were collected and subjected to stability acceleration under illumination, high temperature and exposure, yielding 40 batches of samples. The working reference substances were prepared by mixing salvianolic acid B, hydroxysafflor yellow A and excipients (1:1:8), and preparing to a concentration of 40 mg/mL. According to the “quantitative reaction parallel line (3.3) method” to design anticoagulant activity determination experiment, the plasma used was the plasma of four rabbits mixed in an equal ratio, the interval between drugs was 1:0.8, and the TT value was measured by a-automatic coagulation analyzer. The linear relationship, reliability, precision, repeatability and stability were investigated, and the detection conditions were optimized and determined. That is, the reaction system was 100 μL plasma + working reference substances or sample solution 50 μL + 100 μL thrombin reagent, and the biological potency of the samples was detected.The linear relationship with TT was good when the working reference substance and DHI were in the range of 20—40 mg/mL, with thevalues being 0.982 7 and 0.969 6. The biological activity test results showed that the working reference and qualified DHI had significant anticoagulant activity, and the results could pass the reliability test. The biological potency values of 10 batches of DHI were in the range of 3700—4300 U/mL. Compared with the results of biological potency of samples after accelerated treatment, the samples treated with exposure and light could be detected completely, and the detection rate of high temperature treatment of DHI was 80%.The established biological potency method can be used for the determination of biological potency and quality evaluation of DHI. The method has high precision, good repeatability and reliable result.

biological potency; Danhong Injection; quantity reaction parallel lines; thrombin time; quality evaluation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)08 - 2348 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.011

2021-11-16

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)（20-21ZY1001）

張宇航，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制。E-mail: 1159861886@qq.com

吳宿慧，女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail: wusuhui@hactcm.edu.cn

唐進(jìn)法，男，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)及合理應(yīng)用。E-mail: a0519@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]