秦嶺中蜂蜂蜜酚類提取物的鑒定及其抑菌活性研究

王銀,劉彩玲,茍心怡,岳田利,曹煒

(西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安,710069)

中蜂蜂蜜(Apisceranahoney)為我國蜜蜂品種“中華蜜蜂”所釀花蜜,較單花意蜂蜂蜜具有更高的藥用價值及生物活性,被廣泛地應(yīng)用于我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中。酚類化合物是蜂蜜中最主要抑菌成分之一,其物質(zhì)組成主要受地理位置、蜜源植物影響[1]。陜西省秦嶺沿麓具有豐富的藥用植被資源,整體花期較長,為中蜂養(yǎng)殖及蜂蜜品質(zhì)提供了獨(dú)特的資源條件[2]。雖然國內(nèi)外對植物酚類提取物抑菌作用做了大量研究,但對秦嶺中蜂蜂蜜中酚類物質(zhì)解析及抑菌作用研究較少。

大腸桿菌(Escherichiacoli)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)會引起人類腸道及皮膚感染,且極易獲得耐藥性,我國每年約有40%～65%的食源性疾病爆發(fā)由其引起[3]。由于抗生素在畜牧養(yǎng)殖、臨床治療上的過度使用,部分抗生素向食品原料發(fā)生遷移,大腸桿菌及金黃色葡萄球菌多重耐藥率在20年間提高了近2.5倍,對食品安全、人類臨床治療及畜牧養(yǎng)殖帶來巨大的威脅與挑戰(zhàn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)秦嶺沿麓中蜂蜂蜜中酚類物質(zhì)種類較多,但同一地區(qū)酚類指紋圖譜接近,具有明顯的地域代表性[2]。本文擬對秦嶺中蜂蜂蜜理化性質(zhì),酚類提取物組分及抑菌作用進(jìn)行進(jìn)一步分析,為秦嶺中蜂蜂蜜酚類物質(zhì)抑菌機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ),同時為高品質(zhì)中蜂蜂蜜的資源開發(fā)及藥理研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

秦嶺中蜂蜂蜜,陜西省略陽縣森林人家養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社;棗花蜜,老蜂農(nóng);標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌S.aureusATCC 29213、E.coliATCC 25922,均為本實(shí)驗室保存;甲醇(HPLC級),默克公司;甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水,LC-MS級,CNW Technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish超高效液相色譜儀、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)液相色譜柱、Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀,Thermo Fisher Scientific公司;Infinite M200Pro酶標(biāo)儀,瑞士TECAN;Carl Zeiss冷場發(fā)射掃描電鏡,美國SIGMA。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 中蜂蜂蜜的理化指標(biāo)

理化指標(biāo)：pH、水分含量、葡萄糖含量、果糖含量、蔗糖含量、淀粉酶活性測定參考《進(jìn)出口蜂蜜檢驗規(guī)程》(SN/T 0852—2012)。

總酚酸及總黃酮提取測定參照WANG等[4]的方法。

1.3.2 提取物超高效液相色譜串聯(lián)四極桿串聯(lián)軌道離子阱質(zhì)譜(UHPLC-QE-MS)組分測定

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)液相色譜柱。液相色譜A相為5 mmol/L乙酸銨水溶液,B相為乙腈。采用梯度洗脫：0 min,1% B;1 min,1% B;7～8 min,99% B;8～9 min,99% B;9～9.1 min,40%～95% B;9.1～12 min,1% B。流動相流速：0.5 mL/min,柱溫30 ℃,樣品盤溫度4 ℃,進(jìn)樣體積3 μL。

原始數(shù)據(jù)采用R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,與BiotreeDB(V2.1)自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋。

1.3.3 牛津杯抑菌試驗

將-80 ℃凍存菌株劃線接種于LB平板,37 ℃培養(yǎng)18 h后,挑取單克隆接種于20 mL LB肉湯中,37 ℃培養(yǎng)16 h。稀釋后取200 μL金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌懸液(106CFU/L)分別涂布于MHA平板,分別取20 μL秦嶺中蜂蜂蜜(2.5 mg/mL)及棗花蜜(2.5 mg/mL)酚類提取物加入牛津杯中,并以鏈霉素為對照,37 ℃培養(yǎng)14 h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,每組3次平行,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3.4 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)測定

在無菌96孔板中,分別加入10 μL大腸桿菌或金黃色葡萄球菌菌懸液(105CFU/mL)及酚類提取物,用MHB定容至終質(zhì)量濃度分別25、12.5、5、2.5、1、0.5 mg/mL,每組3個平行,37 ℃培養(yǎng)18 h。肉眼未見細(xì)菌生長的最低濃度即為MIC。

1.3.5 生長曲線

無菌96孔板中,分別加入10 μL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌懸浮液(105CFU/mL)。加入酚類提取物,調(diào)整終濃度分別為1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC,每組3個平行,37 ℃培養(yǎng)。采用酶標(biāo)儀每隔1 h測定一次OD600,連續(xù)測定12 h。以測定值減去各濃度下0 h的吸光度扣除背景值繪制生長曲線。

1.3.6 細(xì)胞形態(tài)

用無菌MHB將提取物濃度分別調(diào)整至0、1/2、1和2 MIC。取200 μL 108CFU/mL金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌懸液,5 000 r/min離心10 min,去上清液后分別加入500 μL 0、1/2、1、2 MIC提取物,37 ℃培養(yǎng)4 h。5 000 r/min離心10 min,PBS洗滌2次,將細(xì)胞重懸于2.5%戊二醛溶液中,-4 ℃固定12 h,離心后分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液梯度脫水、干燥。真空下噴金,在冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡下成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 中蜂蜂蜜理化指標(biāo)

秦嶺中蜂蜂蜜水分含量為(17.86±0.06)%,遠(yuǎn)低于馬來西亞Kelulut蜂蜜(29.8±0.9)%～(30.42±0.68)%、Tualang蜂蜜(22.96±0.89)%～(24.8±0.36)%[5]及海南無刺蜂蜂蜜(26.3±0.1)%[6],與塞爾維亞的多種單花蜂蜜(15.7%～17.3%)[7]及巴西意蜂蜂蜜(16.2%～20.87%)接近[8]。水分含量與蜂蜜穩(wěn)定性與儲存特性密切相關(guān),不同地區(qū)品種蜂蜜含水量差異主要受產(chǎn)區(qū)當(dāng)?shù)貧夂驐l件與地理環(huán)境影響[7]。秦嶺中蜂蜂蜜總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.78%,其中葡萄糖含量為32.04%,果糖含量36.33%,蔗糖含量1.41%。其葡萄糖及果糖含量明顯高于婆羅洲無刺蜂蜂蜜[葡萄糖(14.9±0.7)%～(21.0±1.7)%,果糖(12.01±1.1)%～(19.5±1.3)%][9]。與巴西圣卡塔琳娜州意蜂蜂蜜[8]接近。蜂蜜中糖含量主要與蜜源植物有關(guān),氣候條件、來源以及加工和儲存條件對其影響較小。淀粉酶是評估蜂蜜新鮮度的重要指標(biāo),秦嶺中蜂蜂蜜淀粉酶活性值為26.4°Gothe,高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中優(yōu)級蜜(8°Gothe)指標(biāo)。

中蜂蜂蜜總酚酸含量為(377.85±1.33) mg GA/kg。與ZHAO等[2]報道的中蜂蜂蜜平均TPC(408.9 mg GA/kg)及巴西無刺蜂蜂蜜[10](375 mg GA/kg)接近,高于土耳其蜂蜜[11],莫桑比克蜂蜜(106 mg GA/kg)及Tualang蜂蜜[(139.42±13.7)～(183.93±24.1)mg GA/kg][8]。不同地區(qū)的總酚酸含量存在明顯差異,這與植被分布及氣候條件顯著相關(guān),日照及植被豐富地區(qū)花蜜總酚酸含量明顯高于其他地區(qū)[10]。

秦嶺中蜂蜂蜜總黃酮含量為(109.38±0.05) mg RUE/kg,低于巴西蜂蜜(152.2～304.5 mg RUE/kg)[12]。高于Kelulut蜂蜜[(97.88±10.1)～(101.5±11.4)mg RUE/kg]、Tualang蜂蜜[(64.72±11.4)～(66.98±7.32)mg RUE/kg][5]和巴西無刺蜂蜜[(1.9±0.1)～(4.2±0.6)mg RUE/kg][10]。不同緯度地區(qū)總黃酮含量主要受蜜源植物分布影響,同一緯度總黃酮含量則與光照水分,濕度及當(dāng)?shù)丨h(huán)境有關(guān)。本文中總酚酸及總黃酮含量與ZHAO等[2]前期對中蜂蜂蜜相關(guān)研究略有差異,可能與樣品來自秦嶺沿麓不同區(qū)縣,地理環(huán)境與植被分布不同有關(guān)。不同地理環(huán)境與蜜源植物種類直接決定蜂蜜中酚類物質(zhì)的種類與含量,而蜂蜜抑菌作用與總酚酸及總黃酮含量呈正相關(guān),二者主要可通過破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu),抑制酶活力,降低能量代謝,抑制基因合成等作用抑制細(xì)菌生長。同時還會進(jìn)一步影響細(xì)菌黏附、毒力基因、生物膜形成等耐藥相關(guān)基因表達(dá)[13]。

2.2 中蜂蜂蜜酚類提取物的UHPLC-QE-MS分析

UHPLC-QE-MS在正、負(fù)離子模式下共表征出40種酚類化合物(表1、表2),其中有3種分別在2種離子模式下均有檢出,整體結(jié)果負(fù)離子模式響應(yīng)較好。正離子模式下共檢出18種酚類化合物,其中酚酸類3種(7、16、17),黃酮類15種(圖1、表1)。負(fù)離子模式下共檢出25種酚類化合物,其中酚酸類9種(2、5、7、9、11、12、15、18、21),黃酮類16種(表2)。本樣品中山奈素及山奈酚(表2)相對含量高于前期研究中其他秦嶺中蜂蜂蜜提取物。山奈素與山奈酚均廣泛的存在于植物中,是蜂膠及蜂蜜中較常見的黃酮醇類化合物,具有良好的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、酶抑制活性等功能,被廣泛應(yīng)用于臨床治療及功能性食品開發(fā)中[9]。黃酮類物質(zhì)抑菌主要通過破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使蛋白、核酸及內(nèi)容物溢出,抑制核酸生物合成、抑制細(xì)胞質(zhì)膜功能、抑制能量代謝[14]。黃酮類化合物可促使細(xì)菌抗性基因表達(dá)上調(diào),生物合成及能量代謝相關(guān)基因下調(diào)。雖然山奈素及山奈酚對多種細(xì)菌具有抑制作用,但其對革蘭氏陽性菌,尤其是金黃色葡萄球菌抑菌作用顯著優(yōu)于革蘭氏陰性菌。此類甲基化黃酮類物質(zhì)可靶向作用于細(xì)菌細(xì)胞膜,改變其通透性,降低ATP合成能力和膜運(yùn)輸能力,有研究表明其可通過下調(diào)RNAIII及Hla蛋白轉(zhuǎn)錄抑制金黃色葡萄球菌生長。同時可協(xié)同其他黃酮類組分加速細(xì)胞裂解,破壞細(xì)菌細(xì)胞膜通透性抑制細(xì)菌生長[15]。實(shí)驗室在前期對中蜂蜂蜜提取物抑菌作用篩選研究中發(fā)現(xiàn),雖然本樣品總酚酸及總黃酮含量略低,但其對金黃色葡萄球菌抑制作用顯著優(yōu)于其他樣品。因此推測其良好的革蘭氏陽性菌抑制作用可能與高含量的山奈素與山奈酚有關(guān),但此推測仍需進(jìn)一步實(shí)驗確定。

續(xù)表1

表2 UHPLC-QE-MS負(fù)離子模式下秦嶺中蜂蜂蜜酚類提取物Table 2 Bioactive components in Qinling A.cerana honey extracts by UHPLC-QE-MS on negative ion mode

2.3 中蜂蜂蜜酚類提取物的抑菌效果

酚類提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑大小為鏈霉素﹥中蜂蜂蜜酚類提取物﹥棗花蜜酚類提取物(表3)。提取物對金黃色葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng),抑菌直徑達(dá)(14.08±0.14)mm,顯著優(yōu)于棗花蜜提取物(P<0.05)。秦嶺中蜂蜂蜜中總黃酮含量(109.38±0.05)mg RUE/kg遠(yuǎn)高于陜西地區(qū)棗花蜜(30.75±10.50)mg RUE/kg,棗花蜜提取物含量較高的代表物質(zhì)為原兒茶酸、綠原酸及咖啡酸,但黃酮類物質(zhì)較少[16],而黃酮類物質(zhì)對革蘭氏陽性菌具有顯著的抑制作用。因此推測秦嶺中蜂蜂蜜提取物中高總黃酮含量可能是其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著優(yōu)于棗花蜜提取物的主要影響因素。另一方面,中蜂蜂蜜酚類提取物對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)抑菌效果顯著優(yōu)于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)(表3),這與馬來西亞無刺蜂蜂蜜[9]和巴西單花蜂蜜[10]研究結(jié)果一致。

表3 酚類提取物對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑菌圈直徑 單位：mm

由于酚類物質(zhì)可通過改變細(xì)胞膜通透性、抑制DNA解旋酶活性、螯合金屬離子鈍化酶活性等方式抑制細(xì)菌生長,而革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁層的外膜系統(tǒng)具有滲透屏障作用,可有效抑制酚類物質(zhì)與細(xì)胞作用靶位點(diǎn)的結(jié)合,降低其抑菌效果。

2.4 中蜂蜂蜜酚類提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長曲線及MIC測定

中蜂蜂蜜酚類提取物對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的MIC分別為2.5、5 mg/mL。其生長曲線如圖2所示,抑菌作用隨著酚類提取物濃度增高而增強(qiáng)。

當(dāng)酚類提取物濃度為1/8 MIC時,金黃色葡萄球菌生長對數(shù)期出現(xiàn)延緩,但抑制作用不明顯,當(dāng)達(dá)到1/2 MIC時,金黃色葡萄球菌對數(shù)期延緩1 h,且對數(shù)期細(xì)菌增長速率顯著減緩,當(dāng)濃度達(dá)到1 MIC時,其生長被完全抑制(圖2-a)。大腸桿菌在提取物濃度<1/2 MIC時,隨著提取物濃度增加其生長曲線均在6 h進(jìn)入對數(shù)期,雖然細(xì)菌增長速度放緩,但整體變化不大,當(dāng)提取物濃度達(dá)1 MIC時其生長在12 h內(nèi)被完全抑制(圖2-b)。酚類提取物對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用優(yōu)于大腸桿菌,這可能與金黃色葡萄球菌對滲透效應(yīng)的敏感性及革蘭氏陽性和陰性菌間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異有關(guān),受脂多糖外膜保護(hù)的革蘭氏陰性菌更耐受[17]。

a-金黃色葡萄球菌;b-大腸桿菌圖2 秦嶺中蜂蜂蜜酚類提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長曲線抑制作用Fig.2 Growth curves of Qinling A.cerana honey extracts against S.aureus and E.coli

2.5 細(xì)胞形態(tài)變化

如圖3所示,正常的金黃色葡萄球菌形態(tài)圓潤飽滿,在1/2 MIC提取物作用下,細(xì)胞表面發(fā)生部分破裂及脫落,但仍具有正常細(xì)胞形態(tài),在1 MIC作用下,細(xì)胞發(fā)生破裂,細(xì)胞內(nèi)容物溢出,當(dāng)濃度達(dá)2 MIC時,大部分細(xì)胞表面完全坍塌破裂(圖3-a)。

a-金黃色葡萄球菌;b-大腸桿菌圖3 酚類提取物對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌形態(tài)的影響Fig.3 Effects of phenolic extracts against S.aureus and E.coli on cell morphology

大腸桿菌在1 MIC提取物作用下細(xì)胞表面發(fā)生明顯皺縮,部分細(xì)胞裂解,當(dāng)濃度達(dá)2 MIC時,細(xì)胞表面嚴(yán)重皺縮(圖3-b)。秦嶺中蜂蜂蜜酚類提取物對裂解細(xì)胞壁膜作用明顯,具有顯著的抑菌效果,且革蘭氏陽性菌對其的耐受程度遠(yuǎn)小于革蘭氏陰性菌。

3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示,秦嶺中蜂蜂蜜pH為5.61,水分含量(17.86±0.06)%,果糖36.33%,葡萄糖32.04%、蔗糖1.41%、淀粉酶活性26.4°Gothe、總酚酸含量(377.85±1.33)mg GAE/kg,總黃酮含量為(109.38±0.05)mg RUE/kg。相比西方意蜂蜂蜜及單花蜂蜜具有水分含量低,糖度高,淀粉酶活性高、總酚含量高等特點(diǎn)。UHPLC-QE-MS分析共鑒定出40種酚類組分,其中酚酸類11種,黃酮類29種,山奈素及山奈酚為代表性組分。秦嶺中蜂蜂蜜酚類提取物對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的MIC分別為2.5、5.0 mg/mL。提取物能夠顯著抑制2種食源性致病菌的生長,破壞細(xì)胞壁細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),引起細(xì)菌死亡。相比意蜂棗花蜜,中蜂蜂蜜提取物抑菌效果更強(qiáng),且對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑制作用大于革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)。研究結(jié)果為秦嶺中蜂蜂蜜抑菌機(jī)理探索及資源開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。