木薯葉片多肽的制備與抗氧化功能研究

張作達(dá),王琴飛,吳若娜,牛曉磊*,張振文*

1(海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院,海南 ?？?570228)2(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所,海南 ?？?571101)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是大戟科木薯屬植物,其葉片含有豐富的蛋白質(zhì)(9.2%～12.5%,鮮重)[1],在非洲,木薯葉是人們膳食蛋白質(zhì)的重要來源[2]。隨著我國(guó)特色熱帶作物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物資源綜合開發(fā)利用成為研究熱點(diǎn),植物源功能活性多肽產(chǎn)品的開發(fā)倍受關(guān)注。木薯作為我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展的熱帶作物,開展木薯葉片的資源化開發(fā)利用技術(shù)研究是服務(wù)熱區(qū)、鄉(xiāng)村振興、推動(dòng)木薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和服務(wù)“一帶一路”倡議的重要舉措,具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

目前,植物源多肽的制備方法主要有酶解法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和直接提取法,其中酶解法具有反應(yīng)條件溫和,專一性較強(qiáng)的特點(diǎn),是當(dāng)前最常用的多肽制備方法[3]?；钚远嚯牡纳砉δ茌^多,包括抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓和抗腫瘤等[4],其中抗氧化是其重要的生理功能之一[5]。本研究通過優(yōu)化木薯葉片的蛋白質(zhì)提取方法,利用3種常用蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶),對(duì)提取的木薯葉蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解優(yōu)化,對(duì)目標(biāo)活性多肽進(jìn)行初步分離和抗氧化功能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木薯葉,品種為華南9號(hào),中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)圃;中性蛋白酶100 U/mg、堿性蛋白酶200 U/mg、胰蛋白酶250 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;BCA試劑盒、超濾管、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、水楊酸和DPPH等常規(guī)試劑,?？邶埲A衍生生物科技中心;三水合乙酸鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、石油醚,氫氧化鈉、鹽酸、乙腈、2,4-二硝基氟苯,?？谟顖D科技有限公司。

1.2 主要儀器

電子天平、梅特勒pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-6000DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋,國(guó)華(常州)儀器制造有限制造公司;酶標(biāo)儀、真空冷凍干燥機(jī),建發(fā)(廣州)有限公司;Agilent 1 260高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品脫脂

參照殷丹等[6]的脫脂方法,并加以改進(jìn)。木薯葉片通過液氮研磨,并于50 mL錐形瓶中稱取1 g木薯葉片粉末,加入5 mL石油醚,用保鮮膜封口,30 ℃超聲15 min,置于150 r/min的搖床中室溫反應(yīng)2 h,用1層紗布將石油醚濾出,氮吹15 min除去剩余石油醚,冷藏備用。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取

參考張燦[7]的蛋白質(zhì)提取方法,并稍作修改。稱取1 g脫脂木薯葉片粉末,加入20 mL去離子水,用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值,置于搖床中于一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間,4 000 r/min離心20 min,取上清液。用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH酸沉,靜置30 min,5 000 r/min離心30 min,提取的蛋白質(zhì)真空冷凍干燥后稱重。

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響因素溫度(20～60 ℃)、堿溶pH值(9.0～11.0)、酸沉pH值4.0～5.2和反應(yīng)時(shí)間0.5～2.5 h進(jìn)行單因素試驗(yàn),稱取1 g脫脂木薯葉片粉末,固定任意3個(gè)因素,改變另外1個(gè)因素,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。所提取到的木薯葉片蛋白質(zhì)冷凍干燥后進(jìn)行稱重并計(jì)算得率。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

以溫度、堿溶pH值、酸沉pH值和反應(yīng)時(shí)間作為影響因素,設(shè)計(jì)4因素5水平的正交試驗(yàn),優(yōu)化木薯葉片蛋白質(zhì)提取方法,各因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.2.3 蛋白質(zhì)純度測(cè)定

參考張妮[8]的方法,采用BCA法測(cè)定粗蛋白中的蛋白含量。蛋白質(zhì)純度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 蛋白質(zhì)酶解

參考李素云等[9]和肖懷秋等[10]的酶解方法,并加以改進(jìn)。稱取100 mg脫脂蛋白粉,溶于20 mL去離子水中,分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶3種蛋白酶,加酶量為10 000 U/g,將其混合均勻,反應(yīng)一定時(shí)間后,95 ℃水浴10 min滅酶,4 000 r/min離心15 min,收集上清液,以多肽濃度為考察指標(biāo),進(jìn)行酶解條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化。

利用Design expert 軟件,以溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間為自變量,以多肽濃度為因變量。對(duì)中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化3種酶各自的酶解條件,因素水平見表2。

表2 三種蛋白酶酶解因素水平表Table 2 Factors and levels enzymatic hydrolysis by three proteases

1.3.4 多肽分離和多肽測(cè)定

采用超濾法對(duì)多肽混合液進(jìn)行分離,選用Millipore的超濾離心管(15 mL,3 kDa),超濾離心后收集外管溶液。多肽濃度采用Biosharp的BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

多肽得率測(cè)定參考王子秦[11]的方法,按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.5 游離氨基酸測(cè)定

游離氨基酸的提取參考ZANG等[12]的方法并稍作修改,移取15 mL多肽溶液,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的三氯乙酸定容至20 mL,超聲提取30 min后,12 000 r/min離心15 min,取上清液過0.45 μm的微孔濾膜后,4 ℃保存。

以2,4-二硝基氟苯作為柱前衍生試劑,參考李艷[13]的衍生方法并稍作修改,取氨基酸混標(biāo)、NaHCO3緩沖溶液與體積分?jǐn)?shù)0.5%的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液各0.5 mL,混勻后于60 ℃水浴暗反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后避光冷卻至室溫,再加入pH值為7.0的磷酸緩沖溶液0.5 mL,靜置15 min,取10 μL進(jìn)樣分析。

色譜柱：氨基酸專用色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A：稱取13.6 g三水合乙酸鈉,溶于1 000 mL水中,采用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5。流動(dòng)相B：V(乙腈)∶V(水)=4∶1;流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序如表3所示。

表3 梯度洗脫程序Table 3 Gradient elution procedure

1.3.6 多肽抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性

參考夏吉安等[14]的測(cè)定方法,并稍作修改。分別取0.2 mL不同濃度的待測(cè)樣品與等體積0.2 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液混合均勻,常溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)其吸光度,記為A1;測(cè)定0.2 mL樣品與0.2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光度,記為A2;將0.2 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液與0.2 mL蒸餾水的吸光度記為A3。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。每組3個(gè)重復(fù),DPPH自由基清除率按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3.6.2 ·OH清除活性

參考袁艷超等[15]和趙旭彤[16]的方法,并稍加改進(jìn)。分別配制不同濃度的木薯葉多肽提取液,取0.2 mL的多肽提取液依次加入3 mmol/L FeSO4溶液,6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和6 mmol/L H2O2各0.2 mL,混勻后常溫反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后于517 nm處測(cè)定吸光值,記為A1;以去離子水代替樣品測(cè)其吸光值,記為A0?！H清除活性按公式(4)計(jì)算：

(4)

1.3.6.3 總還原力測(cè)定

參考夏吉安等[14]和馬菲菲[17]的方法,并稍作改進(jìn)。配制不同濃度的木薯葉多肽溶液,取0.2 mL樣品溶液,依次加入0.2 mL PBS緩沖液和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴反應(yīng)30 min后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液0.2 mL,混合均勻,靜置10 min,3 000 r/min離心5 min,取0.4 mL上清液,加入0.4 mL去離子水和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液,混勻后靜置10 min,在700 nm處測(cè)其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和正交分析;酶解實(shí)驗(yàn)利用Design expert對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)提取

2.1.1 單因素試驗(yàn)

由圖1-a可知,隨著堿溶pH的升高,蛋白質(zhì)得率隨之增加,可能是由于堿性條件下蛋白質(zhì)與水分子之間的作用增大,蛋白質(zhì)的溶解性隨之升高[18];然而,據(jù)報(bào)道,當(dāng)pH>11.0時(shí),蛋白質(zhì)提取率不會(huì)有顯著性增加,而且蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生褐變[19]。在本研究中,為了避免提取的蛋白質(zhì)褐變和過高的pH值導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解,影響蛋白質(zhì)酶解效果,故選擇pH 11.0為最佳堿溶pH。從提取溫度看(圖1-b),隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)提取率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),并在溫度60 ℃時(shí),蛋白質(zhì)提取量達(dá)到最大值。然而,溫度過高容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[20],影響后期蛋白質(zhì)的酶解效果,故將60 ℃作為最佳提取溫度。從提取時(shí)間看(圖1-c),在2.5 h時(shí),蛋白質(zhì)提取量達(dá)到了最大值,然而提取時(shí)間在2.0、2.5 h所得蛋白質(zhì)的質(zhì)量差別不大,為提高效率、降低成本,選擇2.0 h為最佳提取時(shí)間。從酸沉pH看(圖1-d),隨著酸沉pH的升高,所得蛋白質(zhì)的質(zhì)量先增加后下降,在pH為4.6時(shí),蛋白質(zhì)提取量達(dá)到了最大值,故選擇4.6為最佳酸沉pH值。

2.1.2 正交試驗(yàn)與蛋白質(zhì)純度

采用正交設(shè)計(jì)對(duì)蛋白質(zhì)的提取條件進(jìn)行分析,方差分析結(jié)果表明(表4),溫度和堿溶pH均對(duì)蛋白質(zhì)的提取量具有極顯著影響,但提取時(shí)間和酸沉pH對(duì)蛋白質(zhì)提取量影響不顯著。在25組正交試驗(yàn)中(表5),第7組的蛋白質(zhì)提取量最高,除酸沉pH外,均與單因素試驗(yàn)結(jié)果相同,因?yàn)樗岢羛H對(duì)蛋白質(zhì)提取量無(wú)顯著影響,綜上,蛋白質(zhì)提取最佳條件為堿溶pH 11.0,溫度60 ℃,反應(yīng)時(shí)間2 h,酸沉pH 4.6。所提取的蛋白質(zhì)純度達(dá)到了92.57%。

a-堿溶pH;b-溫度;c-反應(yīng)時(shí)間;d-酸沉pH圖1 各單因素對(duì)蛋白質(zhì)提取量的影響Fig.1 Effect of single factor on protein extraction

表4 蛋白質(zhì)提取正交試驗(yàn)分析結(jié)果Table 4 Orthogonal test analysis results of protein extraction

表5 蛋白質(zhì)提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of protein extraction

續(xù)表5

2.2 蛋白質(zhì)酶解

選擇反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素作為3種酶Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素,以多肽濃度為響應(yīng)值,對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。采用Design expert軟件分別對(duì)3種酶的酶解結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到的二次多項(xiàng)回歸模型：

中性蛋白酶：Y=6.37-0.225A-0.405B+0.290C-0.115AB-0.065AC+0.035BC-0.016A2-0.346B2-1.09C2

堿性蛋白酶：Y=6.62-0.575A-0.255B-0.278C-0.068AB-0.018AC+0.228BC-0.334A2-0.454B2-0.684C2

胰蛋白酶：Y=5.18-0.13A+0.191B+0.286C-0.083AB+0.133AC+0.035BC-0.305A2-0.282B2+0.003C2。

3個(gè)模型的方差分析結(jié)果表明(表6),回歸模型的P值均小于0.01,說明回歸模型達(dá)到了顯著水平,失擬項(xiàng)的P值均大于0.05,說明不顯著。中性、堿性和胰蛋白酶方差分析的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2分別為0.988 2、0.946 4和0.952 4,校正系數(shù)R2adj分別為0.973 0、0.877 4和0.891 1,說明模型的擬合度好,可以分別解釋3種蛋白酶的酶解效果,并用于預(yù)測(cè)3種蛋白酶酶解的實(shí)際情況。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Regression model analysis of variance

通過軟件進(jìn)一步分析得到了3種酶的最適反應(yīng)條件,中性蛋白酶最適酶解反應(yīng)條件為：溫度35.00 ℃,pH 6.31,反應(yīng)時(shí)間2.18 h;堿性蛋白酶為：溫度36.75 ℃,pH 8.76,反應(yīng)時(shí)間2.44 h;胰蛋白酶為：酶解溫度36.45 ℃,pH 8.00,反應(yīng)時(shí)間3.82 h。

2.3 多肽得率

由圖2可知,3種酶酶解后多肽得率在40%左右,其中胰蛋白酶酶解所得多肽得率最高,為41.89%,與堿性蛋白酶相比,多肽得率無(wú)顯著差異;中性蛋白酶酶解所得多肽得率最低,為39.57%,顯著低于其他2種酶的多肽得率。

圖2 多肽得率Fig.2 Yield of polypeptide

2.4 游離氨基酸測(cè)定

由圖3可知,氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品有18個(gè)峰(a),其中第16個(gè)峰為衍生試劑與氨基酸反應(yīng)后產(chǎn)生的衍生峰,其中3號(hào)峰為絲氨酸,同時(shí)衍生試劑也會(huì)在這個(gè)位置出峰,當(dāng)衍生試劑被標(biāo)品中的氨基酸消耗后,3號(hào)峰的絲氨酸就會(huì)顯示出來。在多肽溶液中(b),由于其游離氨基酸含量極低,因此3號(hào)峰為衍生試劑的殘留峰。在3種酶的酶解樣品中僅檢測(cè)到了極少量的酪氨酸(16號(hào)峰),質(zhì)量濃度為9.90 μg/mL。

1-天冬氨酸;2-谷氨酸;3-絲氨酸;4-甘氨酸;5-組氨酸;6-精氨酸;7-蘇氨酸;8-丙氨酸;9-脯氨酸;10-酪氨酸;11-纈氨酸;12-蛋氨酸;13-半胱氨酸;14-異亮氨酸;15-亮氨酸;16-衍生峰;17-苯丙氨酸;18-賴氨酸a-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品;b-多肽溶液圖3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、多肽溶液衍生化后的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of standard and polypeptide solution after derivatization

2.5 抗氧化功能驗(yàn)證

以DPPH自由基清除率、·OH清除率和總還原力為指標(biāo),來評(píng)價(jià)多肽抗氧化成分的體外抗氧化活性,以維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。由圖4可知,當(dāng)酶解液的多肽質(zhì)量濃度為0.35 mg/mL時(shí),堿性蛋白酶所得多肽的DPPH自由基清除率最高,達(dá)了58.54%;但是,當(dāng)多肽質(zhì)量濃度高于0.35 mg/mL時(shí),3種酶解液DPPH自由基清除率無(wú)顯著差異,中性蛋白酶所得多肽的DPPH自由基清除率略高,且在多肽質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到了91.83%;3種酶所得多肽的DPPH自由基清除活性與維生素C相比仍有一定差距。

圖4 DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate

由圖5可知,中性蛋白酶所得多肽的·OH清除活性顯著高于堿性蛋白酶和胰蛋白酶所得多肽;當(dāng)中性蛋白酶所得多肽的質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí),其·OH清除活性達(dá)到了79.32%;當(dāng)維生素C質(zhì)量濃度低于1.5 mg/mL時(shí),其·OH清除活性顯著低于多肽溶液的·OH清除活性;當(dāng)維生素C質(zhì)量濃度達(dá)到1.5 mg/mL時(shí),其·OH清除活性明顯升高,顯著高于多肽溶液的·OH清除活性。吸光值越高總還原力越強(qiáng),由圖6可知,中性蛋白酶所得多肽的總還原力略高,在多肽質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí),吸光度達(dá)到了0.558,但與維生素C相比,總還原力較低。綜上所述,3種酶中,中性蛋白酶所得多肽抗氧化活性最強(qiáng)。

圖5 ·OH清除活性Fig.5 Hydroxyl radical scavenging rate

圖6 總還原力Fig.6 Total reducing force

3 討論與結(jié)論

大部分蛋白質(zhì)溶于稀鹽、稀堿和稀酸,部分與脂類相結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇等有機(jī)溶劑。本文采用堿溶酸沉法對(duì)木薯葉片中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取。呂凱波等[21]以紅花籽粕為原料,對(duì)鹽提、堿提、堿溶酸沉和超聲波輔助堿溶酸沉法進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明,超聲波輔助堿溶酸沉法蛋白提取率最高,堿溶酸沉法次之,蛋白質(zhì)提取率僅相差4%。值得注意的是,呂凱波的研究中堿溶酸沉法的反應(yīng)溫度為25 ℃,超聲輔助堿溶酸沉法的反應(yīng)溫度為50 ℃。然而,本研究結(jié)果表明反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率有顯著影響,因此在同等溫度下超聲輔助堿溶酸沉法不一定會(huì)比堿溶酸沉法提取率高。研究發(fā)現(xiàn)高溫條件下大豆分離蛋白的高溶解性是由于7S和11S之間的亞基通過二硫鍵重新結(jié)合,疏水作用力使得疏水性基團(tuán)向新聚合物中間聚集,形成可溶性聚合物,因此溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率有顯著影響[22]。

多肽的制備方法主要有酸堿水解法、酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和直接提取法。酸堿水解法會(huì)影響所得多肽的結(jié)構(gòu)與功能,目前很少使用;化學(xué)合成法成本高,并且反應(yīng)過程中容易產(chǎn)生殘留化合物;直接提取法所得多肽含量較低,難以滿足需求;酶解法和微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和,是目前最常用的多肽制備方法[3];袁艷超等[15]采用混菌發(fā)酵法制備芝麻多肽,芝麻多肽的質(zhì)量濃度為14.412 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到了87.622%;馬利華等[23]在不同菌種制備大豆抗氧化肽的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),不同菌種發(fā)酵的大豆肽DPPH自由基清除率的IC50分別為0.887、2.562、0.614 mg/mL;夏吉安等[14]的研究表明,在中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶中,由中性蛋白酶所制備的多肽DPPH自由基清除活性最高,與本文研究結(jié)果一致。

研究表明,在大多數(shù)情況下,肽段分子質(zhì)量越小,其抗氧化活性越高[24]。并且研究表明N端氨基酸的疏水性與抗氧化活性呈正相關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)多肽N端為疏水性氨基酸Val或Leu時(shí),其抗氧化活性較高[26];當(dāng)Pro、Tyr和His在肽段中的位點(diǎn)合適時(shí)也能在一定程度上提高抗氧化活性[27-29]。芳香族氨基酸的存在也會(huì)大大提高肽段的抗氧化活性,色氨酸側(cè)鏈中的吲哚環(huán)和脯氨酸側(cè)鏈中的吡咯烷環(huán)可以通過羥基作為供氫體,從而起到抗氧化的作用[30]。因此,中性蛋白酶所得多肽抗氧化活性最高,可能是中性蛋白酶酶解過程中產(chǎn)生了更多N端為疏水性氨基酸的肽段,或者產(chǎn)生了更多含有芳香族氨基酸的肽段。因此,后期實(shí)驗(yàn)中,將對(duì)分離后的多肽氨基酸進(jìn)行測(cè)序,進(jìn)一步研究多肽肽段大小和不同氨基酸組成對(duì)其功能活性的影響。

本研究表明,木薯葉片蛋白質(zhì)最佳提取條件為：溫度60 ℃、堿溶pH 11.0、提取時(shí)間2 h,酸沉pH 4.6,其所得蛋白質(zhì)的純度達(dá)到了92.57%。堿性、中性和胰蛋白酶3種酶酶解蛋白質(zhì)的最佳條件分別為溫度36.74、35.00、36.45 ℃;pH值8.76、6.31、8.00;反應(yīng)時(shí)間2.44、2.18、3.82 h,胰蛋白酶多肽得率最高,為41.89%。在中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶中,中性蛋白酶所得多肽的抗氧化活性最強(qiáng),更適合制備木薯葉抗氧化肽。