紫云英苷誘導自噬減輕APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元損傷及老年斑沉積

楊翠珠，張潤恒，王姝涵，蔣裕蕓，劉 靖，李國營，馬宇昕

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院人體解剖與組織胚胎學系，廣東廣州 510006）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常見的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其典型特征是進行性認知能力減退。據(jù)AD 協(xié)會最新統(tǒng)計，AD導致患者死亡人數(shù)已超過乳腺癌和前列腺癌患者人數(shù)的總和，居世界第一位［1］。而在中國≥60 歲老年人中，約有983 萬人患AD［2］。盡管AD 發(fā)病機制尚未完全明確，但目前大部分研究表明自噬參與了AD的發(fā)生與發(fā)展。自噬是溶酶體介導的細胞自我處理系統(tǒng)，能夠清除衰老或異常聚集蛋白，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。既往研究表明在AD發(fā)病早期自噬被激活，進而抑制神經(jīng)細胞損傷來改善AD 癥狀，但隨著AD 病程的發(fā)展，自噬功能逐漸降低［3］。紫云英苷（astragalin，AST）作為一種天然小分子黃酮類化合物［4］，能夠通過調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮抗炎［5］、抗癌［6］、抗氧化［7］作用，但AST 是否能夠通過調(diào)節(jié)自噬來改善癡呆這類神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病尚未見相關(guān)體內(nèi)實驗報道。因此，本實驗將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，探究AST 對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元損傷的作用及機制，為AST作為治療AD 潛在藥物提供動物實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)

24 只 8 月齡 SPF 級 APP/PS1（APPswe，PSEN1dE9）雄性轉(zhuǎn)基因小鼠，及6 只同品系同月齡SPF 級C57BL/6 雄性小鼠，均購自廣東省實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002。動物均飼養(yǎng)于SPF 級屏障環(huán)境內(nèi)：將APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠單籠單只飼養(yǎng)，12 h 光照循環(huán)，飲水進食自由，室溫（22±2）℃，相對濕度（55±5）%。廣東藥科大學動物護理倫理和使用委員會批準（批準使用號為：SPF2017356）并通過本實驗所有動物實驗操作。

1.2 主要試劑與儀器

99.02%紫云英苷（wkq20032506）購于四川省維克奇生物科技有限公司，羧甲基纖維素鈉（MB1731）購于美侖生物技術(shù)有限公司，NeuN 抗體（ab104224）、LC3B 抗體（ab51520）、SQSTM1/p62 抗體（ab91526）、熒光兔二抗（ab150077）、熒光小鼠二抗（ab150116）、HRP 兔二抗（ab205718）、均購自于Abcam 公司，Beta amyloid（GT622）購于GeneTex 公司，β-actin（ac026）購于Abclonal 公司，HRP 小鼠二抗（E030110-02）購于EarthOx 公司。化學發(fā)光成像與分析系統(tǒng)Tanon-5200 購于上海天能科技有限公司，光學顯微鏡及成像系統(tǒng)AX-10 購于德國ZEISS生物公司。

1.3 實驗動物分組及給藥

實驗動物適應(yīng)環(huán)境一周后，將8月齡雄性APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為：APP/PS1 組、10 mg/kg AST（APP/PS1+AST 10）組、20 mg/kg AST（APP/PS1+AST 20）組、40 mg/kg AST（APP/PS1+AST 40）組。另將C57BL/6 小鼠設(shè)為WT 組。將AST 溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中制成10、20、40 mg/kg濃度的混懸液［5］。AST 藥物處理組小鼠腹腔注射不同劑量的AST 混懸液，WT 組和APP/PS1 組小鼠給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每日給藥1次，連續(xù)給藥1個月。

1.4 尼氏染色

每組選取3 只小鼠麻醉后，斷頭處死取出完整的大腦，于40 g/L 多聚甲醛溶液固定，組織脫水浸蠟后進行包埋，制作石蠟切片。選取小鼠腦組織切片，常規(guī)脫蠟脫水后，將切片完全浸入甲苯胺藍工作液中，于56 ℃恒溫干燥箱中染色45 min，之后進行梯度乙醇脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片，自然風干后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 免疫熒光單標染色方法

選取各組小鼠腦組織切片，常規(guī)脫蠟脫水后，進行中高火微波抗原修復，切片冷卻至室溫后，滴加免疫染色封閉液，37 ℃封閉20 min 后，滴加小鼠抗Aβ1-42（1：300）后4 ℃孵育過夜；復溫30 min后，PBST 清洗后，滴加Alexa Flour? 594 標記的山羊抗小鼠IgG（1：800）于37 ℃下孵育1 h；PBST清洗后滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑，封片；利用光學顯微鏡觀察圖像并拍照。

1.6 免疫熒光多重染色方法

選取各組小鼠腦組織切片，常規(guī)脫蠟脫水后，進行中高火微波抗原修復，切片冷卻至室溫后，滴加免疫染色封閉液，37 ℃封閉20 min 后，滴加兔抗LC3B（1：600）和小鼠抗NeuN（1：500），兔抗p62（1：100）和小鼠抗NeuN（1：500）后4 ℃孵育過夜；復溫30 min后，PBS清洗后，加入Alexa Flour?488標記的山羊抗兔IgG（1：800）和Alexa Flour ? 594 標記的山羊抗小鼠IgG（1：800）于37 ℃下孵育1 h；PBST清洗后滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑，封片；利用光學顯微鏡觀察圖像并拍照。

1.7 Western blot法

每組選取3 只小鼠麻醉后，斷頭取出皮質(zhì)組織放于含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA 裂解液中，冰上充分研磨后，轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃高速離心后取上清。用BCA 蛋白定量試劑盒測定每組組織的蛋白含量，接著進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入下述一抗：兔抗LC3B（1：3 000），兔抗p62（1：1 000），兔抗β-actin（1：3 000），4 ℃過夜孵育。復溫20 min，于室溫下用TBST 洗膜3次后，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG（1：10 000）或HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1：3 000）室溫下孵育80 min，于室溫下用TBST 洗膜3 次。將ECL 超敏發(fā)光液滴加到膜上，于1～2 min 進行顯影曝光成像。采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行灰度測定分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 8.0 分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示；所有定量資料滿足正態(tài)分布，且通過方差齊性檢驗后采用單因素方差分析（one way-ANOVA），組間兩兩進行比較采用Turkey法。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 紫云英苷對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量的影響

為了觀察紫云英苷對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量變化的影響，在造模期間稱重并記錄小鼠的體質(zhì)量。經(jīng)過10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg AST 藥物處理后，各組小鼠體質(zhì)量與APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠相比均無統(tǒng)計學意義（P=0.889 8；P=0.634 7；P=0.991 8，圖1）。上述結(jié)果表明，本實驗中不同給藥濃度的AST均未對小鼠體質(zhì)量造成明顯影響。

圖1 不同濃度的紫云英苷對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of astragalin at different concentrations on body weight of APP/PS1 mice

2.2 紫云英苷對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)老年斑的影響

免疫熒光組織化學結(jié)果顯示（圖2）：Aβ斑塊主要分布在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)，形狀多呈橢圓形或不規(guī)則形。與WT 組小鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)內(nèi)Aβ 斑塊數(shù)量增多，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。而經(jīng)20 mg/kg、40 mg/kg AST 藥物處理后，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)內(nèi)Aβ 斑塊數(shù)量明顯減少，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1；P＜0.000 1）。

圖2 免疫熒光檢測各組大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ1-42表達情況Fig.2 Detection of Aβ1-42 in the cortex among groups by immunofluorescent method

2.3 紫云英苷對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的影響

尼氏染色結(jié)果顯示（圖3A-F），WT組小鼠尼氏體結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻；APP/PS1 組小鼠皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)清晰，與WT 組小鼠尼氏體數(shù)量相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）；與APP/PS1 組相比，20、40 mg/kg AST 藥物處理后尼氏體數(shù)量增多（P＜0.000 1；P＜0.000 1）。進一步通過Western blo（t圖3G）檢測NeuN 蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)，與WT組小鼠相比，APP/PS1 組小鼠皮質(zhì)中NeuN 蛋白表達量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1）。而給予20、40 mg/kg AST 藥物處理后，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)中的NeuN 蛋白含量均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.012 1；P＜0.000 1）。

圖3 尼氏染色及Western blot法檢測AST對腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的影響Fig.3 Nissl staining and Western blot methods to detect the effect of AST on neurons in the cortex

2.4 紫云英苷對APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)LCB和p62的影響

免疫熒光多重標記染色結(jié)果顯示：WT 組小鼠和APP/PS1 組小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)中均可檢測到LC3B 和p62 陽性細胞，且主要表達于小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元的胞膜和胞質(zhì)中（圖4-5）。與WT 組小鼠相比，APP/PS1 組小鼠皮質(zhì)中LC3B 陽性細胞較少（圖4），p62陽性細胞數(shù)較多（圖5）；與APP/PS1組小鼠相比，經(jīng)10、20、40 mg/kg AST 藥物處理后，LC3B 陽性細胞呈劑量依賴性增加，而p62 陽性細胞呈劑量依賴性減少。Western blot 實驗進一步證實了上述取得的免疫熒光染色結(jié)果：LC3B、p62 條帶分析結(jié)果顯示如下（圖6），APP/PS1 組LC3B 和p62 蛋白表達量與WT 組小鼠相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.000 1；P＜0.000 1）。經(jīng)20、40 mg/kg AST 藥物處理后，LC3B和p62蛋白表達量與APP/PS1組小鼠差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.007，P＜0.000 1；P＜0.000 1，P＜0.000 1）。

圖4 免疫熒光多重染色法檢測腦皮質(zhì)中LC3B和NeuN共表達情況Fig.4 Detection of co-expression of LC3B and NeuN in the cortex by immunofluorescent multiple staining

圖5 免疫熒光多重染色法檢測腦皮質(zhì)中p62和NeuN共表達情況Fig.5 Detection of co-expression of p62 and NeuN in the cortex by immunofluorescent multiple staining

圖6 Western blot檢測腦皮質(zhì)中LC3B和p62蛋白表達情況Fig.6 The expressions of LC3B and p62 protein in the cortex were detected by Western blot

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，10、20、40 mg/kg AST 藥物干預APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠一個月，各組動物體質(zhì)量變化并未出現(xiàn)明顯的變化，表明AST對動物無明顯毒副作用。同時，AST 藥物干預后可減少APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ 斑塊沉積及減輕神經(jīng)元損傷，可能是通過促進腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元自噬發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

AD 作為一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床上仍缺乏有效針對其病因進行靶向治療的藥物，因而，根據(jù)病因?qū)ふ矣行ьA防及治療AD 的藥物十分重要。腦內(nèi)Aβ 淀粉樣蛋白過度沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)及神經(jīng)元損傷是AD 重要的病理特征，是導致患者學習記憶功能障礙的主要原因［8-10］。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在6 月齡時腦內(nèi)會出現(xiàn)Aβ 斑塊沉積，并可穩(wěn)定表達定位于神經(jīng)元的小鼠/人APP 和突變的人PS1［11］。因此，本實驗選擇8 月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象。AST作為一種新型小分子天然黃酮類藥物，對其抗炎、抗癌、抗氧化的生物學功能目前均有研究報道，大多研究主要集中在其抗炎作用方面。Wang 等［12］研究報道在神經(jīng)病理性大鼠疼痛模型中，AST 通過下調(diào)P2X4 受體，抑制膠質(zhì)細胞活化，從而減輕模型大鼠的疼痛行為。同時，AST 能夠抑制NF-κB 通路，降低IL-6、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，改善小鼠結(jié)腸炎［13］。但AST在阿爾茨海默病此類神經(jīng)退行性疾病中的作用研究相對較少，且集中在體外細胞層面。Yuan 等［14］在對小葉金露梅中黃酮類化合物藥理作用分析時發(fā)現(xiàn)，AST 能夠改善SH-SY5Y 細胞損傷。同時，有研究報道AST 通過激活ER-P38/MAPK 信號通路減少Aβ25-35 損傷PC12 細胞的凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護作用［15］。在體內(nèi)AD動物模型中AST是否同樣具備神經(jīng)保護作用尚未有明確報道。因此，本實驗將具體研究AST對AD動物模型的作用及機制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)存在大量Aβ 斑塊沉積，而在不同濃度AST 藥物干預后，Aβ 斑塊沉積均有所減少，其中以40mg/kg AST 藥物處理最為明顯。尼氏體是神經(jīng)元體內(nèi)嗜堿性顆粒，尼氏體數(shù)量減少及形態(tài)結(jié)構(gòu)改變是神經(jīng)元損傷的表現(xiàn)。本研究采用尼氏染色觀察各組小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)量及形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)WT 組小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)尼氏體結(jié)構(gòu)清晰完整，APP/PS1 組小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)量減少、排列稀疏；但隨著AST 濃度增加，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)尼氏體數(shù)量呈劑量依賴性增加，細胞排列緊密。與WT 小鼠相比，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)NeuN 蛋白表達量降低，而AST用藥處理后逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果。上述結(jié)果共同表明，AST 可以減輕APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ斑塊沉積并改善尼氏體丟失和神經(jīng)元損傷。有研究報道AST 通過抑制氧化劑暴露的氣道上皮細胞和氣道組織中自噬體的形成，有效緩解活性氧促進的支氣管纖維化［16］。同時，通過抑制二氫二醇脫氫酶（DDH）誘導細胞凋亡和自噬，從而增強抗癌效果［17］。那么，AST 改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ 斑塊沉積及神經(jīng)元損傷，是否通過調(diào)控自噬這一途徑發(fā)揮作用仍需進一步探討。

AD 病人或相關(guān)動物模型腦中，致病性的錯誤折疊蛋白出現(xiàn)聚集，囤積在細胞質(zhì)中無法清除，從而對細胞表現(xiàn)出高毒性；而這些蛋白能夠很好地被自噬泡所識別，從而通過溶酶體內(nèi)的酸性水解酶清除。因此，激活自噬可用來抵抗這些聚集蛋白對細胞的毒性。細胞中存在兩種形式的LC3B：LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ。當自噬體形成時，LC3B-Ⅰ被剪切和泛素化修飾后與磷脂酰胺乙醇胺偶聯(lián)后轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ是一種膜結(jié)合蛋白，位于自噬體膜［18］。因此，LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值大小可用來評判自噬水平的高低［19-21］。p62/SQSTM1 作為自噬選擇性底物，在自噬功能正常時可被降解［22］，因此本研究選用LC3Ⅱ和p62 這兩個指標評價自噬功能。自噬功能被抑制可能是AD 致病的因素之一［23-24］。有研究學者檢測APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)自噬相關(guān)因子發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達量降低，而p62 蛋白表達量升高，自噬正常功能被抑制而無法清除腦內(nèi)的堆積的老年斑［25］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)LC3B 蛋白的表達量減少，p62 蛋白表達量增加，而AST 用藥處理能夠逆轉(zhuǎn)這一變化，激活自噬，尤以40 mg/kg AST 藥物處理最為明顯。以上結(jié)果提示，AST 能夠激活腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元自噬，從而減少APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ 沉積及改善神經(jīng)元損傷。但是，AST 能否改善APP/PS1 小鼠認知功能障礙，以及AST 通過激活自噬改善APP/PS1 小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ 斑塊沉積及神經(jīng)元損傷相關(guān)機制，我們?nèi)孕枰M行深入研究和探討。同時，需要根據(jù)藥物劑量和持續(xù)作用時間，對AST 臨床用藥進行安全性評估，以期AST 最終成為臨床有效候選藥提供更多的理論支撐。

綜上所述，AST 能夠升高LC3B 的蛋白表達水平及降低p62 蛋白表達水平，誘導APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元自噬，減少Aβ 沉積和減輕神經(jīng)元損傷。本研究為AST 通過調(diào)控自噬關(guān)鍵環(huán)節(jié)改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ 斑塊沉積，進而改善認知功能障礙提供實驗依據(jù)，為AST將應(yīng)用于臨床AD治療提供新思路。