添加劑對萬壽菊莖葉青貯品質(zhì)的影響

侯志江，劉彥培，蔡 明，高月娥，張繼才，王 玲，劉建勇，黃必志

（1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高山經(jīng)濟(jì)植物研究所，云南 麗江 674199；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3. 云南省草地動物科學(xué)研究院，云南 昆明 650212）

隨著經(jīng)濟(jì)作物種植面積不斷增加，現(xiàn)有耕地生產(chǎn)的飼草已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足畜牧業(yè)的快速發(fā)展[1]，經(jīng)濟(jì)作物副產(chǎn)物飼用化儼然成為解決我國當(dāng)前飼草料不足的關(guān)鍵。萬壽菊（Tagetes erectaL）廣泛種植于世界各地，其產(chǎn)量已占到全球散花產(chǎn)量的1/2 以上[2]。在我國，萬壽菊作為鄉(xiāng)村振興的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，種植面積逐年增加。

目前，種植萬壽菊主要是利用花來提取葉黃素，而剩下的大量莖葉成為農(nóng)業(yè)廢棄物（約30 t/hm2）[3-4]，這些副產(chǎn)物除少部分被還田處理，剩余的均被丟棄或焚燒，不僅造成資源浪費，而且污染環(huán)境。研究表明，萬壽菊莖葉（除去花和種子）營養(yǎng)豐富，氨基酸和微量元素種類多且含量高，尤其是莖中含有較高的粗蛋白，而單寧含量相對較低[5-6]，作為潛在的飼料資源，極有必要開展萬壽菊莖葉的飼用化研究。

青貯作為一種重要方式廣泛應(yīng)用于各種飼草料的加工與貯藏。萬壽菊莖葉具有活性物質(zhì)多、可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）含量低等特點，單獨青貯難度較大，而青貯添加劑在促進(jìn)青貯發(fā)酵及提高青貯品質(zhì)等方面具有重要作用。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）因能降低青貯中的pH 值，增加乳酸產(chǎn)量，抑制有害微生物繁殖等作用，被廣泛用作青貯飼料添加劑[7]；葡萄糖（Glucose，GLU）所提供的碳源可為乳酸發(fā)酵提供底物，有助于青貯過程中pH 值降低，確保高質(zhì)量青貯[8]；甲酸（Formic acid，F(xiàn)A）可以抑制發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和可溶性碳水化合物分解，限制青貯過程中酵母和霉菌生長[9]。因此，本研究以萬壽菊莖葉為原料，分析不同添加劑在青貯過程中對其營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)的影響，綜合評價添加劑對萬壽菊莖葉青貯的調(diào)控效果，旨在找出合理的青貯方案，為萬壽菊經(jīng)濟(jì)作物副產(chǎn)物飼用化提供技術(shù)支持和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

萬壽菊莖葉取自云南省騰沖市某農(nóng)場。添加劑分別為乳酸菌（臺灣亞芯生物科技有限公司，總?cè)樗峋鷶?shù)為1.0×1011cfu/g）、葡萄糖（天津津北精細(xì)化工有限公司，分析純，含量≥90%）、甲酸（無錫亞盛化工有限公司，分析純，含量≥88%）。

1.2 試驗設(shè)計

萬壽菊莖葉采收標(biāo)準(zhǔn)為采摘完最后一批商業(yè)花朵后的莖葉，收割完成后及時進(jìn)行機(jī)械粉碎至1～3 cm，莖葉碎片晾干至含水量70%時與添加劑充分混合。添加劑的量以鮮質(zhì)量（Fresh weight，F(xiàn)W）為基礎(chǔ)。試驗共設(shè)4個處理:對照組（CK）；乳酸菌組（LAB），按5.0×106cfu/g 添加；葡萄糖組（GLU），按2 g/kg 添加；甲酸組（FA），按6 mL/kg 添加。每個處理21 個重復(fù)。所有試驗組裝入1 L 聚乙烯青貯袋（北京肉類加工公司）中，為了確保厭氧發(fā)酵環(huán)境，用真空包裝機(jī)（北京科友佳生物技術(shù)有限公司）抽真空密封，并在25 ℃下室內(nèi)避光保存，在青貯后第3、6、9、12、15、30、45 天取樣（3個重復(fù)）分析。

1.3 指標(biāo)測定及方法

1.3.1 樣品采集與處理方法 青貯前，取一定量萬壽菊莖葉樣品經(jīng)65 ℃烘干保存，用于常規(guī)養(yǎng)分含量測定，青貯階段的7 個時間點取樣，65 ℃烘干保存，用于測定干物質(zhì)（Dry matter，DM）和可溶性碳水化合物；青貯45 d后取樣，65 ℃烘干保存，用于測定粗蛋白（Crude protein，CP）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）、粗灰分（Crude ash，Ash）等含量，另取10 g 青貯料加入90 mL 去離子水，置于4 ℃浸提24 h，留取過濾后的浸提液進(jìn)行發(fā)酵指標(biāo)測定。

1.3.2 營養(yǎng)成分分析 干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪（Ether extract，EE）、粗灰分、可溶性碳水化合物含量分別采用烘干法、凱氏定氮法（GB/T 6432—94）、石油醚提取法（GB/T 6433—2006）、550 ℃高溫灼燒法（GB/T 6438—2007）、蒽酮-硫酸法測定；鈣（Ca）和磷（P）含量分別采用高錳酸鉀間接滴定法（GB/T 6436—2002）和鉬黃分光光度法（GB/T 6427—2002）測定；中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素和粗纖維含量采用濾袋分析法測定；相對飼用價值（Relative feed value，RFV）計算公式：RFV=[（88.9-0.779×ADF）×（120/NDF）]/1.29。

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)分析 pH 值采用精密pH 計測定。采用苯酚-次氯酸鈉比色法分析氨態(tài)氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）的含量。乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）以及丁酸（Butyric acid，BA）含量采用安捷倫1260 液相色譜儀測定，色譜條件：SB-AQ C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm×0.2 μm），pH 值2.70，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃。

1.3.4 感官評定 參照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（Deutche lan Dwirtschafts Geseutschaft）的青貯評分法［10］對樣品進(jìn)行嗅覺、結(jié)構(gòu)及色澤的評分，滿分以20分記，分別以一級優(yōu)良（16～20 分）、二級尚好（10～15 分）、三級中等（5～9分）、四級腐?。?～4分）作為評定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用Duncan 氏法進(jìn)行，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯前萬壽菊莖葉營養(yǎng)成分

青貯前萬壽菊莖葉營養(yǎng)成分測定結(jié)果如表1所示。萬壽菊莖葉粗蛋白含量較高，達(dá)到11.48%，酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維分別達(dá)到了44.71%和51.91%，可溶性碳水化合物含量僅為0.96%。

表1 萬壽菊莖葉營養(yǎng)成分Tab.1 The nutritional components of stems and leaves of marigold

2.2 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯感官品質(zhì)的影響

從表2 可以看出，單獨青貯萬壽菊莖葉的評分為7 分，等級為三級中等，3 種添加劑對萬壽菊莖葉青貯品質(zhì)提高較大，均達(dá)到了二級尚好。其中，添加乳酸菌效果要優(yōu)于添加葡萄糖和甲酸，主要表現(xiàn)為添加乳酸菌后在青貯氣味上有較大改善，評分結(jié)果為14分。

表2 不同添加劑處理對萬壽菊莖葉青貯感官品質(zhì)的影響Tab.2 Effects of different additives on the sensory evaluation of stems and leaves of marigold

2.3 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯不同階段干物質(zhì)的影響

不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯不同階段干物質(zhì)的影響如表3所示。對照組和各處理組隨著青貯時間延長，干物質(zhì)含量呈總體下降趨勢。青貯第3天，各試驗組干物質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）；青貯第6—30 天，乳酸菌組和葡萄糖組的干物質(zhì)含量顯著低于對照和甲酸組（P＜0.05）；青貯結(jié)束的第45天，所有處理組干物質(zhì)含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表3 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯不同階段干物質(zhì)的影響（FM）Tab.3 Effect of different additives on DM in silage process of stems and leaves of marigold（FM）%

2.4 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯不同階段可溶性碳水化合物的影響

由表4可知，隨著萬壽菊莖葉青貯時間延長，可溶性碳水化合物含量呈逐漸下降趨勢。青貯前6 d，各試驗組可溶性碳水化合物含量變化差異不顯著（P＞0.05）；從青貯第9天開始，乳酸菌組和葡萄糖組顯著低于對照組和甲酸組（P＜0.05）；青貯第45天，各處理組顯著低于對照組（P＜0.05）。而整個青貯階段乳酸菌組和葡萄糖組的可溶性碳水化合物含量變化差異不顯著（P＞0.05）。

表4 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯不同階段可溶性碳水化合物的影響（DM）Tab.4 Effect of different additives on WSC in silage process of stems and leaves of marigold（DM）%

2.5 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯營養(yǎng)成分的影響

由表5可知，青貯45 d后，乳酸菌組和葡萄糖組粗蛋白含量顯著高于對照組和甲酸組（P＜0.05），而對照組和甲酸組的粗蛋白含量差異不顯著（P＞0.05）。各處理組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中，乳酸菌組的中性洗滌纖維含量顯著低于其他各組（P＜0.05），葡萄糖組的酸性洗滌纖維含量顯著低于其他各組（P＜0.05）。對照組和各處理組的粗灰分含量差異均不顯著（P＞0.05）。通過青貯，各處理組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著低于對照組，據(jù)此所得的相對飼用價值均高于對照組，其中葡萄糖組的相對飼用價值最高，為127.16%。

表5 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯45 d 后營養(yǎng)成分的影響（DM）Tab.5 Effect of different additives on nutritional composition in stems and leaves of marigold after 45 d ensiling（DM）

2.6 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表6 可知，經(jīng)過45 d 的青貯，各處理組的pH值均下降到了4.2 以下，其中，甲酸組顯著低于其他試驗組（P＜0.05）。經(jīng)青貯發(fā)酵后，乳酸菌組的乳酸含量顯著高于對照組和其他處理組（P＜0.05）；甲酸組乙酸含量顯著低于對照組和其他處理組，對照組、乳酸菌組和葡萄糖組之間差異不顯著；丙酸和丁酸在所有試驗組中均未檢測到。所有處理組的氨態(tài)氮/總氮都低于10，氨態(tài)氮/總氮由高到低依次為對照組＞甲酸組＞葡萄糖組＞乳酸菌組，且各試驗組間差異均顯著（P＜0.05）。

表6 不同添加劑對萬壽菊莖葉青貯45 d 后發(fā)酵品質(zhì)的影響（DM）Tab.6 Effect of different additives on fermentation quality in stems and leaves of marigold after 45 d ensiling（DM）

3 結(jié)論與討論

3.1 添加劑對萬壽菊莖葉青貯感官評定的影響

青貯成功與否主要受青貯材料的水分、可溶性碳水化合物含量及自身乳酸菌數(shù)量等條件的影響［11］。本研究對萬壽菊莖葉青貯在氣味、色澤及質(zhì)地方面的綜合評定結(jié)果表明，萬壽菊莖葉的單獨青貯效果較差，其原因可能是萬壽菊莖葉的可溶性碳水化合物含量和附著的乳酸菌含量較低，從而影響到乳酸菌的發(fā)酵。添加乳酸菌、葡萄糖及甲酸后萬壽菊莖葉發(fā)酵的感官品質(zhì)得到提升。劉艷芳等［8］研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌、葡萄糖及甲酸都能不同程度促進(jìn)發(fā)酵，改善青貯品質(zhì)，但所有處理在氣味上總體評分較低，這很大程度上受萬壽菊揮發(fā)性萜類物質(zhì)的影響［12-14］。相比之下，乳酸菌發(fā)酵后的萬壽菊莖葉評分最高，這可能與乳酸菌對萜類物質(zhì)具有較強(qiáng)的生物降解和生物轉(zhuǎn)化作用有關(guān)［15-17］。

3.2 添加劑對萬壽菊莖葉青貯營養(yǎng)成分的影響

青貯初期，對照組和各處理組干物質(zhì)和可溶性碳水化合物變化差異不顯著，進(jìn)入發(fā)酵階段，乳酸菌組和葡萄糖組干物質(zhì)和可溶性碳水化合物下降顯著，發(fā)酵末期，乳酸菌組和葡萄糖組干物質(zhì)和可溶性碳水化合物變化趨于穩(wěn)定，這與秦麗萍等［18］和王志敬等［19］的結(jié)果一致，主要原因是在發(fā)酵初期對于干物質(zhì)和可溶性碳水化合物的需求較大，而在發(fā)酵末期，乳酸菌等微生物活動受環(huán)境限制變化不大，從而對能量的消耗減弱。對照組和甲酸組由于缺乏所提供的乳酸菌及發(fā)酵底物，發(fā)酵緩慢，影響到萬壽菊莖葉的正常發(fā)酵。本研究中,乳酸菌組和葡萄糖組的干物質(zhì)和可溶性碳水化合物損失較多，但一定范圍的損失也是保證青貯成功的必要條件［19］。

通常情況下，隨著青貯發(fā)酵過程中干物質(zhì)的損耗，粗蛋白含量會呈增加趨勢，但這一過程也會出現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解［20］。本研究中，乳酸菌組和葡萄糖組中的粗蛋白含量顯著高于甲酸組和對照組，說明這2 種添加劑對青貯過程中氮素的損失影響不高，而甲酸組和對照組的粗蛋白損失較大可能是由于發(fā)酵條件不利，促使了腐敗菌的繁殖，進(jìn)而造成了粗蛋白的損失［21-22］。青貯后，乳酸菌組和葡萄糖組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量則顯著低于其他處理，相對飼用價值升高，這可能是由于乳酸菌和葡萄糖為發(fā)酵提供了良好條件，促使萬壽菊莖葉中的纖維素和細(xì)胞壁分解［23-24］。劉艷芳等［8］的研究結(jié)果也表明，乳酸菌和葡萄糖可以顯著降低籽粒莧中的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。

3.3 添加劑對萬壽菊莖葉青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

pH 值高低在很大程度上決定了青貯品質(zhì)，低pH 值有助于在厭氧儲存期間保持穩(wěn)定的條件。優(yōu)質(zhì)青貯的pH 值是在4.2 以下，本研究所有處理組的pH值均在4.2以下，其中以甲酸組的pH值最低。其原因可能是甲酸通過直接酸化來抑制發(fā)酵，并降低了青貯飼料的pH值［9］。

本研究中，甲酸組的乳酸含量較低，這可能也是受甲酸抑制乳酸菌活動特性的影響［9］。添加了乳酸菌和葡萄糖的處理組乳酸含量高，這也驗證了充足的底物和一定數(shù)量的乳酸菌是保證發(fā)酵成功的關(guān)鍵［25］。有學(xué)者提出，干物質(zhì)含量在25%～35%的牧草，青貯后乳酸含量為6%～10%為宜［26］。但周俊華等［20］通過黑麥與小黑麥青貯，以及梁小玉等［24］對菊苣與青貯玉米的混合青貯發(fā)現(xiàn)，較低的乳酸含量并不影響青貯品質(zhì)。因此，對于不同青貯材料在有機(jī)酸的含量標(biāo)準(zhǔn)上還需進(jìn)一步分析和研究。

氨態(tài)氮/總氮是青貯蛋白水解的指標(biāo)之一，可以反映青貯中氨基酸和蛋白質(zhì)的損失程度，比值越高，說明損失越大［27］。本研究中，添加3種添加劑都能降低氨態(tài)氮/總氮比值，這與劉艷芳等［8］的研究結(jié)果一致，且所有處理組青貯后的氨態(tài)氮/總氮均低于10%，其中，乳酸菌組和葡萄糖組相對較低，分別為6.95%和8.52%。說明萬壽菊莖葉中的蛋白質(zhì)分解較少，營養(yǎng)物質(zhì)得以較好保存，這也與乳酸菌組和葡萄糖組乳酸含量較高有關(guān)，較高乳酸的環(huán)境不僅可以阻礙其他微生物生長，并可抑制蛋白質(zhì)的水解，進(jìn)而降低了氨態(tài)氮/總氮比值。

本研究首次通過添加劑對萬壽菊莖葉進(jìn)行青貯，結(jié)果表明，乳酸菌、葡萄糖及甲酸添加劑對萬壽菊莖葉青貯效果均有改善，其中以乳酸菌和葡萄糖添加效果較好，由于萬壽菊莖葉自身的生物學(xué)特性，所有處理青貯后的感官品質(zhì)均不能達(dá)到一級優(yōu)良。今后，改進(jìn)萬壽菊莖葉青貯的研究，在優(yōu)化添加劑合理用量的同時，需重點考慮與禾本科牧草的混合青貯，以提高可溶性碳水化合物含量及乳酸菌含量。