基于表面自聚合的多功能納米探針制備及性能研究

湯 雯，邊 靜

(四川省科學(xué)城醫(yī)院，四川 成都 610000)

光熱治療是目前治療腫瘤最有效的一種醫(yī)學(xué)手段，通過(guò)光熱探針產(chǎn)生局部高溫，殺死病灶處腫瘤細(xì)胞。在光熱治療中引入成像技術(shù)可以有效提高治療的精準(zhǔn)性。但傳統(tǒng)常用納米探針無(wú)法實(shí)現(xiàn)核磁共振成型，因此多模式成像功能的納米光熱探針的合成是目前研究的重點(diǎn)。對(duì)此，我國(guó)很多學(xué)者也作出了一些研究，針對(duì)TME響應(yīng)的19F-MR納米分子成像探針進(jìn)行深入研究，證實(shí)19F-MR納米探針在特定條件下，可在分子水平早期可視化TME中的惡性生物學(xué)行為，為實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷及精準(zhǔn)治療提供有利支持；用線粒體作為線粒體靶向AIE探針區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的靶標(biāo)，使得聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針能對(duì)癌癥細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確診斷；通過(guò)水熱法合成熒光生物質(zhì)碳點(diǎn)BCDs，并將其應(yīng)用到細(xì)胞成像中；但在納米探針成像方面還存在不足?；诖?，本文用表面自聚合方法合成釓離子修飾的硫化鉍@聚多巴胺(BiS@PDA-Gd)復(fù)合納米探針。設(shè)計(jì)試驗(yàn)證實(shí)BiS@PDA-Gd納米探針能夠?yàn)槟[瘤診斷及治療都提供了更精準(zhǔn)的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

本試驗(yàn)主要材料：聚乙烯吡咯烷酮(PVP，山東豪順化工有限公司，AR)、硫代乙酰胺(TAA，山東豪順化工有限公司，AR)、甘露醇(AR，山東富禾生物科技有限公司)、硫代乙酰胺(AR，山東豪順化工有限公司)、三(羥甲基)氨基甲烷(BR，濟(jì)南匯錦川化工有限公司)、六水合氯化鐵(AR，山東力昂新材料科技有限公司)、鹽酸多巴胺(98%，西安澤朗生物科技有限公司)、六水合氯化釓(99.9%，山東力昂新材料科技有限公司)、超純水(18 MΩ/cm，上海景純水處理技術(shù)有限公司)。

本試驗(yàn)主要設(shè)備：精密電子天平(H0503，河北德科機(jī)械科技有限公司)、高速離心機(jī)(TG16KR，上海繼譜電子科技有限公司)、紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(U-T6，屹譜儀器制造(上海)有限公司)、激光粒度儀(LS-POP(9)，珠海市歐美克儀器有限公司)、光學(xué)成像儀(Nexus 128，廣州云星科學(xué)儀器有限公司)、臨床前緊湊型磁共振成像儀(uMR 560，上海聯(lián)影醫(yī)療科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

..BiS納米顆粒的合成

(1)在25 mL純水中溶入1 g PVP，攪拌均勻后加入甘露醇0.227 5 g和Bi(NO)·5HO，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓?/p>

(2)用H0503型精密電子天平精準(zhǔn)稱取TAA 0.028 g，放入10 mL超純水中，充分?jǐn)嚢枞芤海?/p>

(3)將以上步驟溶液混合，緩慢提升反應(yīng)溫度使其充分反應(yīng)，反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為100 ℃和1 h；

(4)取出反應(yīng)產(chǎn)物，然后置于TG16KR型高速離心機(jī)中洗滌3次，離心轉(zhuǎn)速和每次清洗時(shí)間分別為10 000 r/min和10 min。然后將洗滌后產(chǎn)物放入體積一定的超純水中，攪拌使其充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的BiS溶液備用。

..BiS@PDA鈉米顆粒的合成

(1)用H0503型精密電子天平分別精準(zhǔn)稱取4.5 mg鹽酸多巴胺、6.2 mg FeCl·6HO，然后依次放入130 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。然后加入6 mL“1.2.1”配制的1 mg/mL BiS溶液，攪拌使其充分反應(yīng)，攪拌時(shí)間為1 h；

(2)用電子天平金精準(zhǔn)稱取450 mg三氨基甲烷，放入20 mL超純水中，攪拌使其充分溶解。配制成為pH值為9.6左右的Tris緩沖液；

(3)將以上兩個(gè)步驟溶液混合，在室溫條件下充分?jǐn)嚢?，攪拌時(shí)間為2 h；

(4)將反應(yīng)產(chǎn)物置于高速離心機(jī)中，在10r/min轉(zhuǎn)速下離心洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為10 min。然后溶解于體積一定的超純水中，配制成1 mg/mL的 BiS@PDA溶液備用。

..BiS@PDA-Gd鈉米顆粒的合成

(1)將濃度為0.1 mol/L的GdCl溶液100 μL，倒入10 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的 BiS@PDA溶液中，攪拌使其混合均勻，攪拌時(shí)間為1 h；

(2)將產(chǎn)物置于高速離心機(jī)中，在10r/min轉(zhuǎn)速下離心洗滌2次，然后溶于體積一定的超純水中備用。

1.3 Bi2S3@PDA-Gd3+表征

..紫外可見(jiàn)光吸收

用U-T6型紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定BiS和BiS@PDA的紫外-可見(jiàn)光吸收。

..Zeta 電位

用LS-POP(9)型激光粒度儀測(cè)定 BiS@PDA和BiS@PDA-Gd的Zeta 電位和水合粒徑分布。

1.4 Bi2S3@PDA-Gd3+應(yīng)用

體外光生成像試驗(yàn)

(1)分別取質(zhì)量濃度為1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL，將其放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對(duì)照組；

(2)用Nexus 128學(xué)成像儀，在800 nm 近紅外脈沖激光條件下進(jìn)行光生信號(hào)測(cè)試。

..體外磁共振T1成像試驗(yàn)

(1)分別取質(zhì)量濃度為400、200、100、50、25、12.5和6.25 mg/mL的BiS@PDA-Gd溶液各200 μL。放入200 μL的PCR管中，超純水為空白對(duì)照組；

(2)用uMR 560型臨床前緊湊型磁共振成像儀進(jìn)行磁共振成像試驗(yàn)。

1.5 動(dòng)物試驗(yàn)

體內(nèi)光學(xué)成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質(zhì)量濃度為10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、2、4、8、24 h后，對(duì)Hela 荷瘤裸鼠用800 nm 近紅外脈沖激光進(jìn)行光聲成像。

..體內(nèi)磁共振T1成像

在Hela 荷瘤裸鼠的尾部注射質(zhì)量濃度為10 mg/mL的BiS@PDA-Gd的PBS溶液200 μL。然后分別在注射0、4、8、24 h后，對(duì)Hela 荷瘤裸鼠在T1磁場(chǎng)中進(jìn)行磁共振成像試驗(yàn)。試驗(yàn)時(shí)，TR和TE分別為446 ms和15 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 Bi2S3@PDA-Gd3+表征分析

..紫外可見(jiàn)光吸收表征

圖1為BiS和BiS@PDA的紫外-可見(jiàn)光吸收?qǐng)D，插圖a、b分別為BiS和BiS@PDA的水溶液圖。

由圖1可知，BiS溶液表現(xiàn)為棕黃色；而B(niǎo)iS@PDA的顏色則表現(xiàn)藍(lán)黑色。觀察圖中曲線可知，BiS在近紅外區(qū)域吸收較弱；BiS@PDA在近紅外區(qū)域吸收明顯的增加，且在650 nm左右出現(xiàn)明顯吸收峰。研究發(fā)現(xiàn)，堿性條件下，用Fe合成的PDA會(huì)在710 nm左右出現(xiàn)吸收峰。因此初步判定，BiS和PDA成功復(fù)合，且BiS對(duì)PDA吸收峰產(chǎn)生影響，使其出現(xiàn)藍(lán)移的現(xiàn)象。

圖1 Bi2S3和Bi2S3@PDA的紫外-可見(jiàn)光吸收?qǐng)D

..粒徑分布和Zeta電位

圖2、圖3分別為BiS、BiS@PDA的粒徑分布圖和BiS、BiS@PDA、BiS@PDA-Gd的Zeta電位圖。

圖2 Bi2S3、Bi2S3@PDA的粒徑分布圖

圖3 Bi2S3、Bi2S3@PDA、Bi2S3@PDA-Gd3+的Zeta電位圖

由圖2、圖3可知，BiS的平均粒徑比BiS@PDA的平均粒徑低40 nm左右。BiSNPs的Zeta電位為-11.65 mV；BiS@PDANPs的Zeta電位為-31.89 mV、BiS@PDA-GdNPs的Zeta電位為-19.54 mV；BiS@PDANPs的Zeta電位遠(yuǎn)高于BiSNPs的Zeta電位。這是因?yàn)樵?BiS外包覆著一層PDA，PDA表面具有豐富的—OH，使得BiS@PDANPs表現(xiàn)出較強(qiáng)負(fù)電。而B(niǎo)iS@PDA-Gd的Zeta電位低于BiS@PDA，這是因?yàn)楹虶d螯合的過(guò)程中，PDA表面的—OH被消耗掉一部分，因此BiS@PDA-GdZeta電位相對(duì)降低。這也就說(shuō)明了BiSNPs，PDA 層和 Gd成功復(fù)合。

2.2 Bi2S3@PDA-Gd3+應(yīng)用

體外光生成像

不同質(zhì)量濃度的BiS@PDA-Gd光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度及其關(guān)系，具體如圖4所示。

圖4 不同質(zhì)量濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度及其關(guān)系

由圖4可知，光學(xué)信號(hào)隨BiS@PDA-Gd納米材料質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，證實(shí)BiS@PDA-Gd納米材料與光學(xué)強(qiáng)度間表現(xiàn)出線性關(guān)系。同時(shí)，也說(shuō)明了該復(fù)合材料的分散性較好，能夠用于體內(nèi)光生成像。

..體外T磁共振成像

不同濃度的BiS@PDA-GdT1磁共振成像及其關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，BiS@PDA-Gd納米材料在T1模式下表現(xiàn)出優(yōu)良成像效果，且成像亮度隨BiS@PDA-Gd濃度的增加而逐漸增強(qiáng)；弛豫效率=12.04(mmol/L)·s。這就證實(shí)了Gd離子成功螯合在PDA層上，使其成為了優(yōu)秀的T1造影劑。

圖5 不同濃度的Bi2S3@PDA-Gd3+T1磁共振成像及其關(guān)系

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

體內(nèi)光聲成像

圖6為注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后，不同時(shí)間腫瘤位置的光聲成像結(jié)果。

圖6 注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同時(shí)間腫瘤位置的光聲成像結(jié)果

由圖6可知，在2 h時(shí)，腫瘤部位有光生信號(hào)，光聲強(qiáng)度大概為330.369 a.u.；在8 h時(shí)，光聲信號(hào)達(dá)到最高，此時(shí)強(qiáng)度值大概為490.424 a.u.。隨注射時(shí)間的增加，腫瘤部位的光聲信號(hào)雖然有所減弱，但仍舊具備良好的光聲信號(hào)。當(dāng)注射時(shí)間為24 h時(shí)，光聲強(qiáng)度值為412.059 a.u;這就說(shuō)明，BiS@PDA-Gd納米材料在體內(nèi)光聲成像仍舊表現(xiàn)良好，可用于體內(nèi)光聲成像。

..體內(nèi)T1磁共振成像

圖7為在T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液后不同時(shí)間腫瘤位置的磁共振圖像。

圖7 T1模式下注射Bi2S3@PDA-Gd3+的PBS溶液后不同時(shí)間腫瘤位置的磁共振圖像

由圖7可知，T1模式下，注射BiS@PDA-Gd的PBS溶液4 h后，體內(nèi)循環(huán)使得BiS@PDA-Gd在腫瘤位置處富集，使得該處亮度明顯增加，進(jìn)而幫助確定腫瘤的位置；當(dāng)注射時(shí)間超過(guò)4 h，成像效果基本未發(fā)生改變。這就說(shuō)明BiS@PDA-Gd納米材料能夠通過(guò)小鼠自身循環(huán)系統(tǒng)在腫瘤位置富集，且成像較為明顯，能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。

綜合光聲成像和T1磁共振成像結(jié)果，證實(shí)BiS@PDA-Gd納米探針能夠?yàn)槟[瘤診斷及治療都提供了更精準(zhǔn)的技術(shù)手段。

3 結(jié)語(yǔ)

本文以表面自聚合方法，通過(guò)PDA的表面聚合，使其包覆BiS，得到BiS@PDA納米材料。然后利用PDA表面的—OH，與具有MRI性能的Gd金屬離子進(jìn)行螯合，得到BiS@PDA-Gd復(fù)合納米探針。通過(guò)體內(nèi)外光聲試驗(yàn)和T1磁共振試驗(yàn)對(duì)其性能進(jìn)行表征，得到具體結(jié)論。

(1)UV-vis和Zeta電位結(jié)果表明，BiS@PDA比BiS的近紅外區(qū)域吸收更強(qiáng)，且在650 nm左右出現(xiàn)了明顯吸收峰。BiS@PDA的Zeta電位為-31.89 mV，明顯高于BiS-11.65 mV，證實(shí)BiS與 PDA復(fù)合成功；而B(niǎo)iS@PDA-Gd的Zeta電位為-19.54 mV，明顯低于BiS@PDA的Zeta電位。說(shuō)明螯合后，Gd離子消耗掉PDA表面—OH，表明BiS、PDA和Gd離子復(fù)合成功；

(2)體外光聲試驗(yàn)和體外T1磁共振試驗(yàn)結(jié)果表明，光聲信號(hào)強(qiáng)度和T1磁共振強(qiáng)度與BiS@PDA-Gd濃度表現(xiàn)出線性關(guān)系。這就說(shuō)明了BiS@PDA-Gd納米材料具有良好的分散性，可成為優(yōu)秀的T1造影劑；

(3)體內(nèi)光聲試驗(yàn)和體內(nèi)T1磁共振試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠尾部靜脈注射BiS@PDA-Gd8 h后，光聲強(qiáng)度值最高為490.424 a.u.；注射時(shí)間為24 h時(shí)，BiS@PDA-Gd仍具備良好的光聲信號(hào)。在T1模式下，注射4 h，BiS@PDA-Gd在腫瘤處富集，增加腫瘤明亮度，幫助確定腫瘤的位置；超過(guò)4 h后，成像效果改變不明顯，證實(shí)BiS@PDA-Gd納米探針能夠成為新一代T1模式磁共振造影劑。