保元湯對大鼠肝細(xì)胞色素CYP450酶不同亞型的影響

張亞杰，賈旭爽，李麗靜，陳宇楊，鮑慧瑋

(長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林長春·130117)

保元湯是《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中的一個(gè)復(fù)方，具有益氣溫陽功效，主治虛損勞怯，元?dú)獠蛔?，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要用于治療慢性腎病如慢性腎功能衰竭、慢性腎炎，此外還用于冠心病、乙型肝炎、再生障礙性貧血等疾病的治療。保元湯由黃芪、人參、肉桂、甘草四味中藥組成，保元湯在臨床應(yīng)用過程中可能對肝藥酶會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，就會(huì)影響到其他藥物的療效或不良反應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)采用Cocktail探針?biāo)幬锓?，探索?元 湯 對 肝CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1酶的誘導(dǎo)或抑制作用，為促進(jìn)保元湯的臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑

人參、黃芪、甘草、肉桂飲片均購自吉林省宏檢大藥房有限公司。茶堿原料藥、雙氯芬酸鈉原料藥、奧美拉唑原料藥、右美沙芬原料藥，氯唑沙宗原料藥、普萘洛爾原料藥（純度大于等于98%）、還原型輔酶II均購自上海源葉生物有限公司。BCA蛋白試劑盒(批號(hào):03415，上海天根生化科技)，逆轉(zhuǎn)錄酶及QSCR擴(kuò)增試劑購自TransGen公司。

1.2 儀器設(shè)備

臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(上海飛鴿儀器廠);LC-l0A型高效液相色譜儀、UV檢測器、N-2000工作站(日本島津公司);酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 動(dòng)物和分組

由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供成年雄性Wistar大鼠30只，體重為180~220 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(吉)2020-0002；動(dòng)物隨機(jī)分為空白對照組、人參組、黃芪組、甘草組、肉桂組、保元湯組。

2 方法

2.1 藥物的制備與配制

2.1.1 供試藥品的制備

根據(jù)《簡明醫(yī)彀》（明·孫志宏）記載，保元湯中人參5 g，黃芪10 g，甘草2.5 g，肉桂1 g，按比例取適量藥材煎煮濃縮至含原生藥量2 g/mL。參照《中藥藥理研究方法學(xué)》動(dòng)物給藥量的換算方法，計(jì)算大鼠的每日給藥量，保元湯組每日給藥量為1.9 g/kg，人參組每日給藥量為0.5 g/kg、黃芪組每日給藥量為1g/kg、甘草組每日給藥量為0.3 g/kg、肉桂組每日給藥量為0.1 g/kg、空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d后，處死動(dòng)物制備肝微粒體。

2.1.2 探針底物及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

稱取適量茶堿、雙氯芬酸鈉、奧美拉唑、右美沙芬和氯唑沙宗5種探針底物，加入甲醇溶液中搖勻備用,最終溶液中含有茶堿(10μmol/L)、雙氯芬酸鈉（25 μmol/L）、奧美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50μmol/L)[1]。

稱取適量內(nèi)標(biāo)物普萘洛爾加入甲醇∶乙睛（1∶1）的混合溶液中，終濃度為100μg/mL。

2.2 肝微粒體制備

取肝組織：處死后的大鼠在冰浴的托盤中剖開腹部，暴露肝臟，結(jié)扎肝門靜脈，同時(shí)剪斷下腔靜脈，中肝動(dòng)脈插硅膠管并灌注冰生理鹽水進(jìn)行沖洗，去除肝臟中殘留的血液，反復(fù)沖洗到肝臟表面呈土黃色。

制備線粒體上清液：在冰浴的環(huán)境下，取一塊土黃色的肝臟，用剪刀剪碎，加入4倍肝重的0.25 mol/L的冰蔗糖溶液，倒入玻璃勻漿管中，手動(dòng)研磨至勻漿狀，使微粒體均勻分散。研磨后的組織勻漿液放入冷凍離心機(jī)，9000 g離心15 min，用移液器取上清液備用，丟棄下層組織;將上清液再放入冷凍離心機(jī)，12500 g離心20 min，再用移液器取上清液備用，丟棄下層組織，所得上清液即為去線粒體上清液。

制備肝微粒體混懸液：88 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL中需加入1 mL上清液，按這個(gè)比例在上清液中加入CaCl2溶液(CaCl2的終濃度為8 mmol/L),充分混合，放在冰浴的環(huán)境中5 min，在冰浴適當(dāng)進(jìn)行振搖，最后放入冷凍離心機(jī)，27 000 g離心15 min，輕輕取出上清液，離心管中的沉淀就是肝微粒體。

2.3 肝微粒體蛋白含量測定

按試劑盒的說明完成樣本蛋白含量測定。

2.4 肝微粒體孵育

用移液器在EP管中加入5種探針的混合液20 μL，自然揮干后，EP管中加入肝微粒體，37℃恒溫水浴，預(yù)孵育5 min后，用移液槍加入NADPH啟動(dòng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。EP管中孵育體系總體積為200μL，其中肝微粒體總蛋白濃度為0.5 mg/mL、NADPH終濃度為1 mmol/L,CYP特異性探針?biāo)幬锏慕K濃度依次為茶堿(10 μmol/L)、雙氯芬酸鈉（25μmol/L）、奧美拉唑（25μmol/L）、右美沙芬（5μmol/L）、氯唑沙宗(50μmol/L)，體積不足用K2HP04/KH2P04緩沖液(0.05 mol/L,pH=7.4)補(bǔ)充。

孵育反應(yīng)30 min時(shí)移液槍注入冰冷的甲醇∶乙睛（1∶1）的混合溶液200μL，其中含有內(nèi)標(biāo)鹽酸普奈洛爾(100μg/mL)，終止肝藥酶對底物的代謝作用，孵育溶液渦旋混勻后，13000 g,4℃冷凍離心機(jī)離心10 min，取上清液冷藏備用。按照預(yù)先測定的HPLC條件，取上清液測反應(yīng)后各探針?biāo)幬锏氖Ｓ嗔?，并按下式?jì)算各探針底物的代謝消除百分率。探針底物代謝清除率（%）=

2.5 色譜條件

2.5.1 5種探針底物的HPLC條件

色譜柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0~8 min，10%A；8~10 min，10%→25%A；10~24 min，25%A；24~34 min，25%→70%A；34~37 min，70%→100%A；37~40 min，100%A）[2]；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；檢測波長210 nm。結(jié)果顯示5種探針?biāo)幬锱c內(nèi)標(biāo)物峰形良好，分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對其他待測峰無干擾，專屬性強(qiáng)[3]，結(jié)果見圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密量取各濃度的探針底物溶液于EP管中，氮吹，每個(gè)濃度設(shè)3份，建立工作曲線[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各探針底物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（y）對各探針底物的濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程[5]。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度

選擇相同濃度，用空白組大鼠肝藥酶配制質(zhì)量控制樣品，制備6份樣品[4]，按照樣品處理方法處理分析，分別計(jì)算各探針底物的精密度和準(zhǔn)確度。

2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

由表1可知，5種探針底物在各自濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 5）[7]。

表1 大鼠肝微粒體中5種探針底物的回歸方程

3.2 精密度與準(zhǔn)確度

表2 5種探針底物的精密度與準(zhǔn)確度

3.3 保元湯及單藥對大鼠肝細(xì)胞色素CYP450酶的影響

各組對茶堿、奧美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗、雙氯芬酸鈉5種探針底物的代謝消除百分率測定結(jié)果見表3。與空白對照組比，甘草組、保元湯組增加茶堿代謝百分率（P＜0.0 5），因此，甘草、保元湯對CYP1A2酶活性具有誘導(dǎo)作用；甘草組、黃芪組可顯著降低雙氯芬酸鈉代謝百分率（P＜0.01），保元湯組降低雙氯芬酸鈉代謝百分率（P＜0.05），但人參組升高了雙氯芬酸鈉代謝百分率（P＜0.05），因此對甘草、黃芪、保元湯對CYP2C9酶活性具有抑制作用，而人參對CYP2C9酶具有誘導(dǎo)作用。

表3 保元湯及單藥對5種底物的消除百分率（%）（±s，n=5）

表3 保元湯及單藥對5種底物的消除百分率（%）（±s，n=5）

注：與空白對照組比*P＜0.05,**P＜0.01

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4 討論

口服給藥吸收進(jìn)入機(jī)體后，大部分需要經(jīng)肝臟特異性酶進(jìn)行代謝，進(jìn)行代謝的主要酶系是細(xì)胞色素P450酶（CYP450），CYP450由多種同工酶組成，其中CYP1A2、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、和CYP3A4這6種酶參與機(jī)體90%以上的藥物代謝[8]，而CYP450易受藥物的影響，被誘導(dǎo)或抑制，被誘導(dǎo)時(shí)會(huì)將被代謝的藥物代謝量增加，從而降低藥物的有效濃度，影響藥物的作用效果；被抑制時(shí)會(huì)將被代謝的藥物代謝量減少，從而導(dǎo)致藥物血藥濃度過高，不良反應(yīng)的發(fā)生率增加，CYP450被誘導(dǎo)或抑制給臨床用藥帶來了很多的不確定性，尤其是中藥和西藥合用的情形，所以通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，保元湯對于肝藥酶CYP1A2具有有誘導(dǎo)作用，可能與其含有的甘草對CYP1A2的誘導(dǎo)作用有一定的關(guān)系，對于需經(jīng)CYP1A2代謝的藥物，如咖啡因、非那西丁、茶堿、氯氮平、丙米嗪、他克林等，在合用時(shí)需要增加合用藥物的劑量，保證治療效果；保元湯中的甘草和黃芪都對肝藥酶CYP2C9具有顯著的抑制作用，而其中的人參對肝藥酶CYP2C9具有誘導(dǎo)作用，四味藥作為一個(gè)復(fù)方應(yīng)用時(shí)可能產(chǎn)生了相互作用，降低了甘草和黃芪的顯著抑制作用，因此保元湯對肝藥酶CYP2C9的也具有抑制作用，對于需經(jīng)CYP2C9代謝的藥物如甲苯磺丁脲、苯妥英鈉、羅芬、吩噻嗪類、鎮(zhèn)靜催眠藥烯苯巴比妥、抗腫瘤藥環(huán)磷酰胺、性激素孕酮、睪丸酮等[9]，保元湯與這些藥物合用時(shí)注意觀察不良反應(yīng)。