地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶對切達干酪質(zhì)地特性的影響

張忠明，曹瑛瑛，王 瑩，喬海軍，張衛(wèi)兵,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

干酪是一種高蛋白、易于人體吸收的發(fā)酵乳制品，含有人體所需的所有必需氨基酸[1]，風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富。干酪的風(fēng)味和質(zhì)地不僅是影響消費者接受程度的重要因素，同時對于制造商、包裝商、銷售商也很重要。切達干酪成熟時產(chǎn)生的一系列協(xié)同的微生物、物理和化學(xué)變化有助于形成其特有的質(zhì)地、風(fēng)味和微觀結(jié)構(gòu)的變化[2-3]。在成熟期間，干酪中殘留的凝乳酶、纖溶酶及發(fā)酵劑釋放的蛋白酶會部分水解酪蛋白基質(zhì)，對干酪質(zhì)地和風(fēng)味的形成有重要影響[4-6]。其中，殘留凝乳酶對酪蛋白的水解會增加干酪的流動性，降低干酪的拉伸性能[7]，從而使干酪的質(zhì)地品質(zhì)發(fā)生變化。因此，研究切達干酪成熟過程中質(zhì)地特性的變化對于評價干酪的品質(zhì)具有重要意義。

實驗室前期從天祝高寒草原放牧牦牛生活環(huán)境的土壤樣品中篩選分離得到一株產(chǎn)凝乳酶細菌地衣芽孢桿菌D3.11，研究表明，該菌株所產(chǎn)的凝乳酶酶活力可達89.56 SU/mL，蛋白水解力為21.27 U/mL[8]。宋曦等[9]研究表明，pH值為5～8時地衣芽孢桿菌D3.11凝乳活性隨乳pH值的降低而增高，pH 5.5時凝乳活力最高。李貽珍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，凝乳溫度為40 ℃時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶凝乳效果較好。本研究分析利用地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶制作的切達干酪成熟過程中質(zhì)構(gòu)、流變、微觀結(jié)構(gòu)及風(fēng)味的變化規(guī)律，評價地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶在切達干酪中的應(yīng)用潛力，并為地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶在切達干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮荷斯坦牛乳購自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場。

地衣芽孢桿菌D3.11 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏編號CGMCC No：3289）；商品凝乳酶（小牛皺胃酶和牛胃蛋白酶質(zhì)量比為7∶3，酶活力890 IMCU/g）北京多愛特生物科技有限公司；R-704嗜溫發(fā)酵劑（乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種） 科漢森有限公司；麩皮 淮南鴻汶農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；戊二醛上海中秦化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、無水硫酸鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯仿、叔丁醇 天津凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TX.XT Express質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；JSM-6701F低真空掃描電子顯微鏡 日本電子光學(xué)公司；Discovery HR-1混合流變儀 美國TA Instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 切達干酪制作

1.3.1.1 切達干酪加工工藝流程

切達干酪加工流程：原料乳→63 ℃巴氏殺菌30 min→冷卻至35 ℃→添加發(fā)酵劑（0.006 25 g/L）→添加CaCl2（0.3 g/L）→添加凝乳酶（200 SU/mL）→凝乳→切割、排乳清→加鹽、攪拌→二次加熱→排乳清→堆釀→壓榨成型→真空包裝→成熟6 個月

按照上述工藝流程，分別制作3 組切達干酪：1）添加地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶所制切達干酪（CDF組）；2）添加地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶但未添加發(fā)酵劑制成的干酪類似物（CD3組）；3）添加商品凝乳酶所制作的切達干酪（CCF組）。

1.3.1.2 切達干酪出品率測定

參照鄒鯉嶺等[11]的方法。對壓榨成型后的新鮮切達干酪進行稱質(zhì)量，按式（1）計算實測出品率。

為了更準(zhǔn)確測定切達干酪的出品率，將水分含量校正到40%后按式（2）計算校正出品率。

1.3.2 切達干酪質(zhì)地分析

1.3.2.1 質(zhì)構(gòu)測定

參考劉賀等[12]的方法，稍作修改。將干酪樣品切割為規(guī)則正方體（2 cm×2 cm×2 cm）。質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）測定參數(shù)：觸發(fā)力5 g，探頭類型P36，測試前探頭下降速率1 mm/s，測試速率5 mm/s，返程速率5 mm/s；壓縮比35%；壓縮間隔10 s，每組樣品測定3 次。

1.3.2.2 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考劉興龍等[13]方法，將干酪樣品用刀片切割成纖薄小片，浸入pH 6.8、體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛中，在4 ℃條件下固定24 h。將固定好的樣品用pH 6.8磷酸緩沖液沖洗3 次，每次10 min。將沖洗好的樣品分別用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水，每次10 min，樣品脫水后于氯仿中放置2 h進行脫脂，并間隔搖晃。然后分別用無水乙醇、無水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）、叔丁醇再次脫水，每次6 min。干酪樣品冷凍干燥后，采用離子濺射法噴金后置于掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.3.2.3 流變特性測定

參考Lucey[14]的方法，采用溫度斜坡測定干酪樣品的流變特性。從干酪樣品中心取樣，樣品直徑20 mm、厚度2 mm，室溫平衡30 min后進行測定。流變儀參數(shù)如下：升溫速率3 ℃/min，升溫范圍20～80 ℃，應(yīng)變0.2%，角頻率1 Hz。在測定過程中，記錄儲能模量（G’）、損耗模量（G’’）和損耗角正切值（tanδ）的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)測定3 次，實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行處理并用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，采用Duncan’s法進行數(shù)據(jù)間多重顯著性分析，利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 切達干酪出品率

由圖1可知，3 組干酪形態(tài)相似，并無明顯差異，干酪表面光滑有光澤。為了得到更加準(zhǔn)確的切達干酪出品率，在測得實際出品率后，將水分含量校正到40%后得到校正出品率進行比較。

由表1可知，3 組干酪出品率之間均有顯著差異（P＜0.05），其中CCF組實測出品率和校正出品率均為最高，其實測出品率和校正出品率均比CDF組高11.95%，比CD3組高6.21%，這與其較高的水分含量有關(guān)。

表 1 3 組切達干酪出品率Table 1 Yields rate of three Cheddar cheese

2.2 切達干酪成熟過程中硬度的變化

樣品的硬度表示達到給定變形所需的力的大小[15]。由圖2可知，成熟時間對干酪硬度有顯著影響（P＜0.05），3 組干酪的硬度隨著成熟時間的延長均逐漸增大，其中CDF組成熟0～3 個月內(nèi)硬度增加較為緩慢，成熟4～6 個月內(nèi)硬度增加較快，整個成熟期內(nèi)硬度增加1 458.14 g。CD3組成熟2～6 個月內(nèi)硬度增加較快，在成熟期內(nèi)硬度增加2 692.87 g。CCF組硬度成熟0～3 個月時增加較為緩慢，在4～6 個月內(nèi)硬度快速增加，在成熟期內(nèi)增加3 072.43 g。3 組干酪硬度之間存在差異，CDF組干酪硬度最小。

2.3 切達干酪成熟過程中彈性的變化

彈性是在第1個壓縮力被移除后干酪形態(tài)的恢復(fù)程度[15]。由圖3可知，隨著干酪的成熟，3 組干酪的彈性均呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。成熟0 個月時，CD3組和CCF組干酪彈性無顯著性差異，但顯著高于CDF組干酪（P＜0.05）。CCF組干酪在成熟前4 個月表現(xiàn)出較高的彈性，但在5～6 個月時彈性低于CD3組干酪，而CDF組干酪彈性在整個成熟期內(nèi)始終顯著低于CCF組和CD3組干酪（P＜0.05）。

2.4 切達干酪成熟過程中咀嚼性的變化

咀嚼性是在吞咽干酪之前將其咀嚼成均勻狀態(tài)所需的能量[16]。由圖4可知，凝乳酶對干酪成熟過程中咀嚼性的影響顯著。隨著干酪成熟時間的延長，3 組干酪的咀嚼性逐漸降低。其中CDF組干酪咀嚼性顯著低于CD3組和CCF組干酪，CD3組和CCF組干酪咀嚼性變化趨勢相似，除第0、5、6 個月時，其余成熟時間二者咀嚼性差異不顯著。CDF組成熟過程中咀嚼性雖顯著降低，但下降值不大，在整個成熟期內(nèi)咀嚼性降低178.298 g，而CD3組和CCF組分別降低799.432、781.279 g。

2.5 切達干酪成熟過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化

由圖5可知，不同凝乳酶和成熟時間對干酪微觀結(jié)構(gòu)的影響不同。成熟0 個月時，3 組干酪微觀結(jié)構(gòu)都較為致密，CDF組干酪孔洞較大，CD3組干酪次之，CCF組干酪孔洞最??；成熟3 個月時，與CCF組干酪相比，CDF組和CD3組干酪的微觀結(jié)構(gòu)較為粗糙和不規(guī)則，并且CCF組干酪的微觀結(jié)構(gòu)更為致密；成熟6 個月時，3 組干酪微觀結(jié)構(gòu)均發(fā)生較為明顯的變化，隨著酪蛋白的水解，干酪結(jié)構(gòu)逐漸融化，酪蛋白基質(zhì)中孔洞數(shù)量急劇增多。這些顯微結(jié)構(gòu)上的差異主要是由于地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶和商品凝乳酶蛋白水解能力不同所致，由此可以得出，不同凝乳酶對干酪微觀結(jié)構(gòu)的改變不同。

2.6 切達干酪成熟過程中流變特性的變化

干酪具有固體的彈性特征和液體的黏性特征，是典型的黏彈性材料。彈性特征通過G’來描述，黏性特征通過G’’來描述。采用溫度掃描實驗對3 組干酪成熟過程中流變學(xué)特性進行比較分析。

由圖6可知，不同成熟時間的干酪G’隨溫度的變化趨勢一致，均隨著掃描溫度的升高而降低，這是由于溫度升高會破壞干酪中的蛋白質(zhì)基質(zhì)，削弱分子間的相互作用，導(dǎo)致彈性降低和流動性增加。但隨著成熟時間的延長，3 組干酪G’卻表現(xiàn)出下降的趨勢。這是因為隨著干酪的成熟，蛋白質(zhì)不斷被蛋白酶水解，降低了干酪內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致成熟過程中G’降低。在不同成熟時間內(nèi)，CCF組干酪G’均高于CD3組和CDF組干酪，表明CCF組干酪酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密，其彈性和機械性能優(yōu)于CDF和CD3組干酪。但當(dāng)溫度大于40 ℃時，CDF組干酪G’最小，表明其流動性和熔融性更好。

由圖7可知，隨著干酪成熟時間的延長，3 組干酪G’’均呈下降趨勢，同時，3 組干酪G’’隨溫度的變化曲線也有相同趨勢，均為隨溫度的增加而下降。在不同成熟時間內(nèi)，當(dāng)溫度高于60 ℃時，CCF組干酪G’’同樣高于CD3組和CDF組干酪。

tanδ是G’’和G’的比值，其表征干酪融化過程中流動性的變化。當(dāng)tanδ等于1時，G’’等于G’，此時干酪達到固體和液體的臨界點溫度，當(dāng)G’’大于G’時，干酪液體特征占主導(dǎo)，反之固體特征占主導(dǎo)。由圖8可知，在成熟期間CDF組干酪tanδ總體高于CD3組和CCF組干酪。3 組干酪樣品在溫度低于40 ℃時，其tanδ基本保持不變，溫度高于40 ℃時增加，60～70 ℃時達到最大值，然后下降。隨著干酪成熟度的增加，tanδ變化整體呈下降趨勢，這表明在干酪成熟期間其流動性逐漸減弱。

3 討 論

3.1 凝乳酶對切達干酪質(zhì)構(gòu)及微觀結(jié)構(gòu)的影響

質(zhì)地是切達干酪的主要質(zhì)量屬性之一，其變化與成熟過程中發(fā)生的物理和化學(xué)變化密不可分[17]。本研究中干酪硬度隨著成熟時間的延長而增加，這一現(xiàn)象與鄭遠榮等[18]研究結(jié)果一致。成熟過程中硬度隨著干酪成熟度的增加可能是由以下2 個因素造成的：首先，干酪脫水后其總固形物含量增加，這將有助于形成更堅硬的干酪基質(zhì)[19]；其次，隨著蛋白質(zhì)水解作用的繼續(xù)，可用于蛋白質(zhì)基質(zhì)水合的水越來越少，這導(dǎo)致干酪不易變形，從而使硬度增加[20]。此外，有研究表明，小牛、駱駝和微生物來源的3 種凝乳酶在成熟過程中質(zhì)地變化不同，說明不同凝乳酶對干酪質(zhì)地的影響不同[21]。本研究中，在成熟第0個月，CCF組和CDF組干酪硬度差異不顯著，隨著成熟時間的延長，CCF組干酪硬度顯著高于CDF組干酪（P＜0.05），這說明凝乳酶類型對硬度有顯著影響。此外，隨著干酪的成熟，3 組干酪的彈性和咀嚼性呈逐漸減小的趨勢。這可能是因為成熟過程中αs1-酪蛋白的酶解使干酪質(zhì)地變得更軟[22-23]。

干酪是由蛋白、脂肪、礦物質(zhì)和水組成的復(fù)雜基質(zhì)，酪蛋白形成主要的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)并包裹脂肪[24]。在生產(chǎn)和成熟期間，干酪的微觀結(jié)構(gòu)受許多因素影響，如凝乳pH值、排乳清、發(fā)酵劑濃度、凝乳酶類型和濃度、含鹽量和成熟期等[25]。有研究表明，在干酪成熟過程中由于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的破壞導(dǎo)致微觀結(jié)構(gòu)的變化[26]。在本實驗中，酪蛋白形成了一個連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)，而脂肪和水分則填充在酪蛋白基質(zhì)中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面的凹痕是干酪中游離脂肪的標(biāo)志，孔洞和縫隙則是水分的標(biāo)志。隨著成熟期的延長，干酪致密的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中孔洞數(shù)量逐漸增多，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸被解體。在同一成熟時期，由于地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶蛋白水解活性高于商品凝乳酶，CDF組干酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為松散，因此CDF組干酪的熔融性會更好。Soodam等[27]比較微生物凝乳酶Hannilase和重組駱駝凝乳酶生產(chǎn)的低脂切達干酪，監(jiān)測干酪成熟過程中的微觀結(jié)構(gòu)變化，經(jīng)過31 周的成熟后，用重組駱駝凝乳酶制成的干酪比用微生物凝乳酶Hannilase制成的干酪蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)致密，這可能是因為重組駱駝凝乳酶蛋白降解率較低，這一結(jié)果與本研究相似。

3.2 凝乳酶對切達干酪流變學(xué)性質(zhì)的影響

本研究中3 組干酪的G’都隨著溫度的升高而降低，Lucey等[28]也觀察到類似的結(jié)果，在成熟過程中，切達干酪的G’在低溫下會增加，但在高溫時迅速下降。這是因為溫度升高會破壞干酪中的蛋白質(zhì)基質(zhì)，削弱分子間的相互作用，導(dǎo)致彈性降低和流動性增加[29]。在整個成熟期內(nèi)，CDF組和CD3組干酪G’低于CCF組干酪，可能是由于CCF組干酪更為致密的酪蛋白網(wǎng)絡(luò)增加了干酪的彈性。此外，本研究結(jié)果表明，成熟6 個月時，3 組干酪的G’均有下降。Hu Yanan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，成熟度較高的干酪具有較低的G’，這與本研究結(jié)果一致。這是因為隨著干酪的成熟，蛋白質(zhì)不斷被蛋白酶水解，這降低了干酪內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致成熟過程中G’降低[20]。

本研究中，在不同成熟時間點3 組干酪tanδ變化趨勢相似，均為先增大后減小。除在成熟0 個月時tanδ大于1外，成熟3、6 個月時，tanδ均小于1。tanδ等于1被界定為干酪融化的臨界點，融化是指干酪流動和擴散的能力。干酪被加熱時會失去彈性從而導(dǎo)致軟化，干酪在流動之前會變軟，但只有當(dāng)G’大于G’’時流動才會發(fā)生。本研究中在溫度范圍相同時，隨著成熟度的增加，干酪tanδ降低，可能與成熟過程中水分含量的降低導(dǎo)致總固體含量增加有關(guān)，這與Ray等[19]研究結(jié)果相同。干酪的可融性增加與成熟期間的蛋白水解有關(guān)[31]。

結(jié)合掃描電子顯微鏡圖像和流變特性可知，與CDF組和CD3組干酪相比，CCF組干酪蛋白結(jié)構(gòu)更致密，其G’也高于CDF組和CD3組。Esteves等[32]研究植物凝乳酶和小牛皺胃酶制備的脫脂乳凝膠時也得出同樣的結(jié)論，在凝乳pH值相同時，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)更致密，樣品G’也較高。

4 結(jié) 論

對3 組切達干酪成熟過程中質(zhì)地變化進行分析，TPA分析表明，3 組干酪在成熟過程中質(zhì)構(gòu)參數(shù)變化趨勢相同，CDF組干酪硬度顯著低于CCF組，說明地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶所生產(chǎn)的干酪質(zhì)地更軟；掃描電子顯微鏡圖像分析表明，3 組干酪在成熟過程中酪蛋白網(wǎng)絡(luò)基質(zhì)逐漸被水解，CCF組干酪在成熟過程中蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為致密，這說明不同凝乳酶對切達干酪微觀結(jié)構(gòu)的影響不同；流變學(xué)分析表明，商品凝乳酶生產(chǎn)的干酪樣品彈性和機械性能優(yōu)于地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶生產(chǎn)的干酪，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶所生產(chǎn)的干酪流動性和熔融性更好。