白延寧,曹紹華,黃劍林,師文濤
(延安大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 延安 716000)
格列喹酮是一種臨床上廣泛使用的第二代磺酰脲類口服降血糖藥物。格列喹酮口服易吸收,主要通過(guò)肝臟代謝(發(fā)生羥基化和甲基化反應(yīng)),代謝產(chǎn)物大部分通過(guò)膽汁和糞便排出,僅有少部分(約5%)通過(guò)腎臟排出[1]。是現(xiàn)有的磺脲類口服降血糖藥中唯一不受腎功能影響的藥物,故常用于腎功能受損的糖尿病患者[2],已被多個(gè)臨床指南推薦為治療糖尿病腎病的一線用藥[3]。
阿司匹林(又稱乙酰水楊酸)是臨床應(yīng)用最廣泛的血小板聚集抑制藥,是預(yù)防心血管事件的基礎(chǔ)用藥[4]。研究[5]顯示,心血管疾病和糖尿病相互關(guān)聯(lián),糖尿病是心血管疾病的一個(gè)高危因素,而心血管疾病又是糖尿病患者死亡的主要原因之一。因此,預(yù)防心血管疾病是糖尿病患者重要的治療目標(biāo)之一,臨床上常將格列喹酮和阿司匹林聯(lián)合用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。但是,目前二者聯(lián)合用藥后的藥動(dòng)學(xué)影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究將從藥動(dòng)學(xué)角度探討不同劑量的阿司匹林和格列喹酮聯(lián)合用藥后對(duì)格列喹酮在大鼠體內(nèi)的藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)影響。
健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠,體重 250~300 g,清潔級(jí),購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(陜)2017-003]。
阿司匹林泡騰片(阿斯利康制藥有限公司,批號(hào)1602134,規(guī)格:0.5 g);格列喹酮片(北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào)1150688,規(guī)格:30 mg);格列喹酮對(duì)照品(批號(hào)00280-200301,純度≥99.5%);格列齊特對(duì)照品(內(nèi)標(biāo),批號(hào)100269-2006030,純度≥99.9%)均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所;乙腈、甲醇和乙醚分別為色譜純和分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),三蒸水(實(shí)驗(yàn)室自制)。
Shimadzu 色譜系統(tǒng)包括:LC-10AT VP Plus 輸液泵、SPD-10A VP Plus 紫外檢測(cè)器、CBM-10AVP Plus控制器、LC Solution lite 色譜工作站;AUY220型電子天平(日本京都,Shimadzu);EXPERT 16K-R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙市鑫奧儀器儀表有限公司);實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)FE20[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。
1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精密稱取格列喹酮對(duì)照品10.0 mg于25 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容配制成400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,再將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用甲醇稀釋成200、100、50、25、10、5 與2.5 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于4 ℃冰箱保存。內(nèi)標(biāo)溶液配制:精密稱取格列齊特適量,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,臨用時(shí)用甲醇稀釋成25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。
1.4.2 血漿樣品的處理 取大鼠血漿150 μL置入肝素化處理過(guò)的離心管中,加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,加入1 mL萃取溶液(二氯甲烷:乙醚,1∶4),渦旋混勻,12 000 r/min離心10 min,吸取1 mL上清液,在空氣流下?lián)]干溶劑,殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶,渦旋混勻,12 000 r/min再離心10 min,取20 μL上清液,即得。
1.4.3 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為磷酸氫二銨水溶液(取磷酸1.725 g,加三蒸水300 mL 溶解后,用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.5)-乙腈(3∶5,V/V);流速:1 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm;內(nèi)標(biāo):25 μg/mL的格列齊特。
1.4.4 專屬性 取空白血漿、加標(biāo)血漿以及給藥后血漿各150 μL,按“1.4.2”項(xiàng)下方法操作。
1.4.5 線性、檢測(cè)限和定量限 取空白血漿150 μL數(shù)份,分別加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL,制成相當(dāng)于濃度 20、10、5、2.5、1、0.5、0.25 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。然后按“1.4.2”項(xiàng)下方法操作。
1.4.6 精密度與回收率試驗(yàn) 取空白血漿150 μL數(shù)份,分別加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL,制成低、中、高(0.5、2.5和20 μg/mL)3種濃度的質(zhì)控樣品,每種濃度5 份,按照“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后,分別在同一天連續(xù)測(cè)定和連續(xù)測(cè)定3 d,然后計(jì)算質(zhì)控樣品的精密度和回收率。
1.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將配制好的質(zhì)控樣品分別在室溫放置0、12、24 h,按照“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后,進(jìn)樣分析。
1.4.8 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn) 將18只SD大鼠隨機(jī)分成3組:格列喹酮對(duì)照組、高劑量阿司匹林+格列喹酮組及低劑量阿司匹林+格列喹酮組。格列喹酮對(duì)照組單獨(dú)灌胃給予90 mg/kg 的格列喹酮混懸水溶液,高劑量阿司匹林+格列喹酮組及低劑量阿司匹林+格列喹酮組先分別連續(xù)2 d 單獨(dú)灌胃給予100 mg/kg 和50 mg/kg 的阿司匹林混懸水溶液,第3 天給予相同劑量的阿司匹林20 min 后再給予90 mg/kg 的格列喹酮混懸水溶液。采血前12 h 大鼠禁食不禁水,給藥后分別在 10、20、40、60、90、120、180、300、420、540、660、1 440 min 時(shí)間點(diǎn)從大鼠頸靜脈處采血約0.35 mL,置于 1.5 mL 肝素化的 Eppendorf 試管中,3 500 r/min 離心 10 min 后取上層血漿 150 μL,按照“1.4.2”項(xiàng)下方法處理后,進(jìn)樣分析。
用WinNonlin5.2 藥動(dòng)學(xué)軟件分析藥動(dòng)學(xué)特征并計(jì)算相關(guān)參數(shù);用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用()表示,t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
按照本實(shí)驗(yàn)色譜條件分析得出,格列喹酮保留時(shí)間約為11.9 min,內(nèi)標(biāo)格列齊特保留時(shí)間約為7.0 min,血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)其基本無(wú)干擾,說(shuō)明該方法具有良好的專屬性,可以滿足實(shí)驗(yàn)基本要求(圖1)。
圖1 格列喹酮HPLC色譜圖
按“1.4.5”項(xiàng)操作后,以格列喹酮的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X),以其與內(nèi)標(biāo)格列齊特的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行回歸計(jì)算,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.1017X-0.0345,R2=0.9993,可見(jiàn)格列喹酮在0.25~20 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,最低定量限(S/N=10)為0.25 μg/mL。
按“1.4.6”項(xiàng)操作后,格列喹酮高、中、低3種濃度的日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard devi‐tion,RSD)分別為8.9%、9.3%、5.1%、7.1%、4.8%、9.1%,均<10%。各樣品的提取回收率分別為94.7%、98.4%、105.1%,均在85%~115%。結(jié)果表明,該方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品的分析方法要求。
按“1.4.7”項(xiàng)操作后,測(cè)得放置不同時(shí)間后的樣品測(cè)定結(jié)果RSD 均<8.7%;反復(fù)凍融3 次后再進(jìn)樣分析,RSD均<9.2%;各血漿樣品在低溫(-40 ℃)條件下放置30 d 后再進(jìn)樣分析,結(jié)果RSD 均<10.3%,表明血漿樣品具有良好的穩(wěn)定性。
按本實(shí)驗(yàn)建立的方法測(cè)得單用及合用不同劑量阿司匹林后格列喹酮的血藥濃度,以時(shí)間為橫坐標(biāo),血藥濃度為縱坐標(biāo),繪制血藥濃度-時(shí)間曲線圖,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 格列喹酮平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖
對(duì)藥時(shí)曲線中的數(shù)據(jù)用WinNonlin5.2 藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行處理,經(jīng)擬合對(duì)照組與聯(lián)合用藥組均符合二室模型,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)詳見(jiàn)表1。從表1 可以看出,高劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組和低劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組分別與對(duì)照組相比,半衰期(t1/2)分別上升了36.22%和29.85%,藥時(shí)曲線下總面積(AUC0~∞)分別上升了56.56%和29.01%,表觀分布容積(Vd)分別上升了56.21%和35.54%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組與高劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組相比,除AUC0~∞有顯著性差異外(P<0.05),其它藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
表1 格列喹酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6,)
表1 格列喹酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6,)
注:a表示與對(duì)照組相比P<0.05;b表示低劑量聯(lián)合用藥組與高劑量聯(lián)合用藥組相比,P<0.05
低劑量阿司匹林+格列喹酮組10.18±1.35a 2.05±1.09 7.33±2.45 125.58±15.23ab 14087.15±3455.50a 1078.17±249.14藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2(h)Tmax(h)Cmax(μg/ml)AUC0~∞(h·μg/ml)Vd(ml)CL(ml/h)格列喹酮對(duì)照組7.84±3.71 1.92±0.61 5.63±3.54 97.34±18.51 10393.07±2211.91 1012.09±311.51高劑量阿司匹林+格列喹酮組10.68±2.35a 2.20±0.85 9.10±4.19 152.40±28.80a 16235.49±3028.41a 1045.00±347.29
藥物的相互作用是導(dǎo)致藥物發(fā)生不良反應(yīng)的主要因素之一,其可以發(fā)生在藥物吸收、分布、代謝、排泄的任一過(guò)程[6]。阿司匹林和格列喹酮是臨床上常用的藥物,其聯(lián)合使用概率極大。
本研究主要考察了50 mg/kg 和100 mg/kg 的阿司匹林對(duì)格列喹酮在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響。結(jié)果表明,阿司匹林兩個(gè)劑量組與格列喹酮聯(lián)合用藥后,其t1/2、AUC0~∞和 Vd均顯著增大,但 Tmax,Cmax,CL等參數(shù)無(wú)顯著性差異。
已有研究證實(shí)肝臟中的CYP450 酶活性是影響藥物半衰期長(zhǎng)短的主要因素之一[7],Holstein A等[8]的研究顯示格列喹酮主要經(jīng)CYP2C9代謝,戴亨紛等[9]的研究同時(shí)也顯示阿司匹林的代謝與CYP2C9有關(guān)。因此,格列喹酮與阿司匹林聯(lián)合用藥時(shí),由于競(jìng)爭(zhēng)相同的代謝酶,導(dǎo)致了格列喹酮代謝的減慢,使得格列喹酮的t1/2延長(zhǎng)。同時(shí),由于阿司匹林和格列喹酮競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合血漿蛋白,當(dāng)兩藥合用時(shí),格列喹酮從血漿蛋白結(jié)合部位游離出來(lái),使其相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)增大,從而增強(qiáng)格列喹酮的藥物作用[10]。
本研究同時(shí)顯示,阿司匹林兩個(gè)劑量組對(duì)格列喹酮的CL 無(wú)影響。其原因是格列喹酮主要經(jīng)膽汁從糞便排出,只有5%經(jīng)腎臟排出[11-12],而阿司匹林主要經(jīng)腎臟排泄(其中90%以結(jié)合型,10%以游離型排出)[13]。由于二者的排泄途徑不一,使得阿司匹林對(duì)格列喹酮的排泄方面沒(méi)有影響。
總之,從格列喹酮的吸收和代謝方面來(lái)看,聯(lián)合用藥后,阿司匹林對(duì)格列喹酮存在明顯的藥動(dòng)學(xué)影響,這種影響程度可能與服用阿司匹林的劑量相關(guān)。當(dāng)格列喹酮與不同劑量的阿司匹林聯(lián)合使用后,格列喹酮在大鼠體內(nèi)的t1/2、AUC0~∞和Vd均顯著增大,說(shuō)明藥物的作用時(shí)間延長(zhǎng),藥物效用增強(qiáng)。
本研究雖然證實(shí)了聯(lián)合使用阿司匹林和格列喹酮后,格列喹酮在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生了顯著改變,但實(shí)際用藥中兩藥的給藥次數(shù)、給藥劑量及人與大鼠對(duì)格列喹酮代謝存在種屬差異,因此,有必要開(kāi)展后續(xù)研究以明確兩者在臨床上合并用藥時(shí)的藥動(dòng)學(xué)相互作用,以確保安全、合理用藥。
延安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)2022年1期