海洋微生物培養(yǎng)新技術(shù)研究進(jìn)展

周春云，張琪，張瀚文，楊昊翼，陸園園

（中國藥科大學(xué)海洋藥學(xué)教研室，江蘇 南京 211198）

海洋微生物作為一種重要的生物活性天然產(chǎn)物來源，具有種類多、蘊(yùn)藏量大、可再生的優(yōu)點(diǎn)，在制藥領(lǐng)域備受關(guān)注。在過去的10 ～ 15年，基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究表明地球上微生物的生物合成能力遠(yuǎn)超預(yù)期，絕大多數(shù)微生物（＞95%）含有在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下保持沉默的活性天然產(chǎn)物生物合成基因簇（BGC）[1]。據(jù)估計(jì)，僅有0.1% ～ 1%的微生物多樣性產(chǎn)物已在實(shí)驗(yàn)室中成功表達(dá)。由于許多生物合成基因在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下無法表達(dá)，直接限制了通過簡單的發(fā)酵方法獲得的微生物天然產(chǎn)物的多樣性[2-3]。前期，研究人員通過單菌多次級代謝產(chǎn)物（OSMAC）方法[4]，可有效地誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，并已取得了不錯(cuò)的研究結(jié)果。然而，近年來發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性物質(zhì)的幾率仍持續(xù)下降，為了克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足之處，新的微生物培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，主要包括共培養(yǎng)、高通量培養(yǎng)、誘捕器原位培養(yǎng)篩選以及土壤基質(zhì)膜系統(tǒng)等。本文主要對近年來上述4種方法的研究案例進(jìn)行歸納總結(jié)，希望能為未來微生物培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展提供借鑒，以期發(fā)現(xiàn)更多的新型天然產(chǎn)物。

1 共培養(yǎng)方法

共培養(yǎng)技術(shù)的研究策略主要包括不同真菌共培養(yǎng)、真菌與細(xì)菌共培養(yǎng)以及不同細(xì)菌共培養(yǎng)[5]。無論哪一種策略，選取不同來源的微生物，并細(xì)化傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過在培養(yǎng)基中加入不同的媒介，包括使用非傳統(tǒng)電子供體、電子受體和碳源等[6]，都可以刺激海洋微生物產(chǎn)生不一樣的次生代謝產(chǎn)物。近年來，通過共培養(yǎng)海洋微生物得到的多種代謝產(chǎn)物，按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類可分為生物堿類、蒽醌類、環(huán)肽類、黃酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、苯丙素類、聚酮類、類固醇類、萜類等[5]。

1.1 生物堿類

2017年，Bao等[7]將海洋真菌Aspergillus sclerotiorumSCSGAF0053的 孢 子（1 mL，約108 CFU · mL-1）和Penicillium citrinumSCSGAF0052的孢子在PDA瓊脂培養(yǎng)基上靜態(tài)孵育30 d（28 ℃）。孵育過程中觀察到混合發(fā)酵液中出現(xiàn)了純培養(yǎng)時(shí)所沒有的獨(dú)特紅色色素，提示新的生物合成途徑被激活。將共培養(yǎng)液進(jìn)行純化鑒定，得到6個(gè)新化合物，包括2個(gè)呋喃酮衍生物sclerotiorumins A和B（1 ～ 2）、1個(gè) 新 型 的二 氮 衍 生 物sclerotiorumin C（3）、1個(gè)吡咯衍生物1-(4-benzyl-1H-pyrrol-3-yl)ethanone（4）和2個(gè) 新 曲 霉 酸 的配 合 物aluminiumneohydroxyaspergillin（5） 和ferrineohydroxyaspergillin（6）。所有化合物在菌株單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)均未產(chǎn)生。

2018年，El-Hawary等[8]將來自紅海海綿的2種放線菌Saccharomonosporasp. UR22和Dietziasp.UR66在無菌海水中沖洗，切成約1 cm3的小塊，加入10倍體積的無菌海水，在無菌砂中徹底均質(zhì)。將上清按10倍、100倍、1 000倍稀釋，然后在瓊脂平板上涂布。采用M1、ISP2培養(yǎng)基，寡養(yǎng)培養(yǎng)基（OLIGO），放線菌選擇性分離合成培養(yǎng)基（AIA）和海洋瓊脂類培養(yǎng)基（MA）對放線菌進(jìn)行分離。30℃孵育6 ～ 8周后，在混合發(fā)酵培養(yǎng)液中鑒定了4個(gè)生物活性物質(zhì)，包括2個(gè)新型的生物堿類化合物saccharomonosporine A（7）和convolutamydine F（8），這2個(gè)代謝物在2種微生物單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)均未檢測到。

1.2 蒽醌類

2018年，Mandelare等[9]將海洋來源的曲霉菌Aspergillus alliaceus的2種不同發(fā)育表型分別在瓊脂平板上培養(yǎng)，然后接種到50 mL麥芽液體培養(yǎng)基中。2周后，將2種培養(yǎng)物混合，加入到1 L的麥芽液體培養(yǎng)基中，在28℃、110 r · min-1條件下的振蕩培養(yǎng)箱上培養(yǎng)30 d。發(fā)現(xiàn)其代謝譜發(fā)生顯著改變，產(chǎn)生了3個(gè)蒽醌類化合物allianthrone A、B、C（9 ～11），其中化合物10和11為一對非對映異構(gòu)體。

2019年，Abdel-Wahab等[10]將海綿相關(guān)真菌Aspergillus versicolor和Bacillus subtilis在靜態(tài)的大米固體培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。同時(shí)，Aspergillus versicolor與Bacillus subtilis也分別在大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行無菌培養(yǎng)。通過在溶菌肉湯（LB）中過夜培養(yǎng)細(xì)菌來制備枯草芽孢桿菌，然后將其接種到的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下以200 r · min-1的速度振蕩培養(yǎng)至指數(shù)生長期。將細(xì)菌培養(yǎng)物加入高壓滅菌的水稻固體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)4 d。將生長出Aspergillus versicolor的麥芽瓊脂切成塊，加入到已經(jīng)用枯草芽孢桿菌孵育的各個(gè)錐形瓶中。對照以及共培養(yǎng)物在23℃的靜態(tài)條件下生長，在達(dá)到生長的穩(wěn)定期后，加入乙酸乙酯終止培養(yǎng)物的生長。對共培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，得到2個(gè)新的蒽醌類化合物(Z)(11S,12R)-versicolorin B（12）和6，8-O-dimethylbipolarin（13）。

1.3 環(huán)肽

將2種紅樹林真菌Phomopsissp. K38和Alternariasp. E33菌株在固體玉米粉海水瓊脂的斜面上培養(yǎng)，然后將帶有菌絲體的瓊脂切片，在無菌條件下轉(zhuǎn)移到含有100 mL液體培養(yǎng)基（葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.1%和NaCl 3%）的250 mL錐形瓶中，錐形瓶在30℃旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)7 d。同時(shí)，將每種真菌的菌絲體轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)液的錐形瓶中，錐形瓶在30℃下培養(yǎng)25 d 。從混合發(fā)酵產(chǎn)物中純化并鑒定出3個(gè)新的環(huán)四肽類化合物，分別命名為cyclo-(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolyl-D-leucyl-trans-4-hydroxy-L-proline)[11]（14）、icyclo(D-Pro-L-Tyr-L-Pro-L-Tyr)（15） 和 cyclo-(Gly-LPhe-L-Pro-L-Tyr)[12]（16）。

2014年，Ebada等[13]將從褐藻中分離出的2種海洋藻類衍生真菌Aspergillussp. BM-05和BM-05ML的共培養(yǎng)物在10個(gè)1L錐形瓶（錐形瓶中培養(yǎng)基每瓶500 mL，包括大豆0.4%、玉米粉1%、MgSO40.36%、NaCl 2%、酵母提取物0.2%和CaCO30.18%，使用軟化水配制而成）中，28℃下，靜態(tài)培養(yǎng)4周。然后將平板培養(yǎng)的瓊脂塊接種到培養(yǎng)基中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)分生孢子有深褐色色素生成時(shí)即達(dá)到發(fā)酵時(shí)間，并從中分離出1個(gè)新的環(huán)三肽類化合物psychrophilin E（17）。

1.4 大環(huán)內(nèi)酯類

2019年，Yu等[14]使用ISP2培養(yǎng)基（麥芽提取物1%、無水葡萄糖0.4%、酵母提取物0.4%和1 L人工海水，pH值7.0），在28℃，180 r · min-1條件下，共培養(yǎng)放線菌S.rocheiMB037和真菌R.similis35。在第3 d，將200 mL放線菌培養(yǎng)物接種到200 mL真菌培養(yǎng)物中啟動(dòng)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。利用反相高效液相色譜（HPLC）分析對比共培養(yǎng)和單一培養(yǎng)之間次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的變化。培養(yǎng)11 d后，提取共培養(yǎng)物，得到12 g的紅棕色油狀物質(zhì)，并從中成功分離出5個(gè)代謝物，包括2個(gè)新的脂肪酸borrelidins J和K（18 ～ 19）。Borrelidins J和K只在共培養(yǎng)物中獲得，且為自然界中罕見的含氮脂肪酸。

1.5 苯丙素類

研究人員在玉米粉海水瓊脂培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)紅樹林真菌Phomopsissp. K38和Alternariasp. E33。切斷菌絲生長的瓊脂塊，加入到含有100 mL液體培養(yǎng)基（葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.1%和NaCl 3%）的250 mL錐形瓶中。將錐形瓶在旋轉(zhuǎn)振蕩器上30℃孵育5 ～ 7 d，將菌絲體無菌轉(zhuǎn)移到含有培養(yǎng)液（200 mL）的錐形瓶中，30℃孵育25 d。在混合物中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)苯丙素類化合物ethyl-5-ethoxy-2-formyl-3-hydroxy-4-methylbenzoate[15]（20）和8-hydroxy-3-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylic acid methyl ether[16]（21），其中化合物21對植物病原菌禾藍(lán)菌、枯萎病菌、炭疽菌和疫霉菌表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性。

1.6 聚酮類

2013年，Kossuga等[17]在2%的麥芽培養(yǎng)基中于25℃，100 r · min-1條件下，共培養(yǎng)海源真 菌Penicilliumsp. Ma(M3)V和Trichodermasp.Gc(M2)1，以相同條件下每種真菌的單獨(dú)培養(yǎng)作為對照，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)產(chǎn)物中增加了2個(gè)新的聚酮類化合物(Z)-2-ethylhex-2-enedioic acid（22）和(E)-4-oxo-2-propylideneoct-7-enoic acid（23）。這2種新發(fā)現(xiàn)的聚酮都含有共軛羧酸基團(tuán)，是通過海洋微生物共培養(yǎng)方法誘導(dǎo)產(chǎn)生新穎碳骨架結(jié)構(gòu)的極好案例。

2018年，Anjum等[18]將2株來自海洋土壤樣品的海洋細(xì)菌Janthino bacteriumsp. ZZ145和ZZ148在水稻固體培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，并對共培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行純化鑒定，得到了2個(gè)新的聚酮類化合物janthinopolyenemycins A和B（24 ～ 25），兩者對白色念珠菌具有相同的抑菌活性。

1.7 類固醇

2014年，Ebada等[19]將 海 藻 來 源 真 菌Aspergillussp. BM05和一種未知的細(xì)菌BM05BL置于錐形瓶中，于28℃靜態(tài)條件下共培養(yǎng)4周。培養(yǎng)基（由大豆蛋白胨0.4%、玉米粉1%、MgSO40.36%、NaCl 2%、酵母提取物0.2%、CaCO30.18%和去離子水配制而成）在121℃下滅菌20 min，冷卻后接種來自鋪板培養(yǎng)物的瓊脂塊。觀察到分生孢子產(chǎn)生深色色素即達(dá)到發(fā)酵時(shí)間，從共培養(yǎng)液中分離出1個(gè)新的類固醇類化合物7β-hydroxycholesterol-1βcarboxylic acid（26）。

1.8 萜類

2012年，Cho等[20]將從韓國深海藻類根部分離的海洋放線菌Streptomyces cinnabarinusPK209在TBFeC介質(zhì)（胰蛋白胨0.3%、酪蛋白胨0.5%、葡萄 糖0.4%、Fe2(SO4)3· 4H2O 0.004%、KBr 0.01%、瓊脂1.8%和海水1 L，pH值為7.8）中培養(yǎng)96 h，加入少量培養(yǎng)16 h的競爭菌株Alteromonassp. KNS-16，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)二萜環(huán)丙烯醇的快速產(chǎn)生，終產(chǎn)量是PK209單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的10.4倍。

2020年，Meng等[21]將2種海洋來源真菌P.bilaiaeMA-267和P. chermesinumEN-480分別接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃下生長4 d，然后將EN-480接種到1 L錐形瓶中（每個(gè)含有100 mL大米培養(yǎng)基，包括大米7%、蛋白胨0.03 %、0.01%玉米糖漿和100 mL過濾海水），在室溫下培養(yǎng)3 d，將MA-267無菌轉(zhuǎn)移到含EN-480的各個(gè)培養(yǎng)瓶中，室溫下孵育28 d。從共培養(yǎng)產(chǎn)物中分離并鑒定了2個(gè)新的美硫萜衍生物chermebilaenes A和B（27 ～ 28），以及3個(gè)已知的倍半萜。值得注意的是，化合物27代表了一類前所未有的腺烷型倍半萜與十八碳二烯酸的雜交骨架，它被證明是一種對抗水生病原體或植物病原體的抗生素[21]。

2 高通量培養(yǎng)法

2.1 滅絕培養(yǎng)高通量培養(yǎng)法

1993年，Button等[22]首次提出了滅絕培養(yǎng)（extinction culturing）的概念，并分離培養(yǎng)出了2種新的寡營養(yǎng)浮游細(xì)菌，即Sphingomonas alaskensis和Cyclo-clasticus oligotrophus。Connon等[23]在此基礎(chǔ)上建立了高通量培養(yǎng)法（high-throughput culturing），即將接種物在天然海水培養(yǎng)基中稀釋到痕量后，以每孔1 mL的量填充至48孔微滴定板，在要求的時(shí)間和條件下進(jìn)行培養(yǎng)之后，使用細(xì)胞陣列檢測生長情況。

隨著該方法的發(fā)展，Huber等[24]在2009年構(gòu)建了一種高通量自動(dòng)化培養(yǎng)平臺。該平臺能夠?qū)⑦M(jìn)行系統(tǒng)性高通量實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)器和分析處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

2020年，Benítez等[25]利用液體處理機(jī)器人EVO100將海綿（Haploscler-idaorder）勻漿接種在被海生菌肉湯培養(yǎng)基（marine broth）填充的384孔聚苯乙烯板中，28℃下280 r · min-1孵育5 d，以選擇性培養(yǎng)Labrenzia（拉布倫茨氏菌）屬的菌株。使用POLARstar Omega讀數(shù)器檢測培養(yǎng)孔600 nm處的OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0.3后，利用液體處理機(jī)器人MicroLab Star從384孔板中回收培養(yǎng)物，并接種到被新鮮海生菌肉湯培養(yǎng)基填充的96孔板上，28℃下280 r · min-1孵育5 d，以誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物。對次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析后得到一個(gè)類似pederin的化合物（29）。

2.2 微包埋高通量培養(yǎng)法

2002年，Zengler等[26]首次將微包埋技術(shù)應(yīng)用于海洋浮游微生物的培養(yǎng)與分離。該技術(shù)將細(xì)胞封裝在稀釋的細(xì)胞懸浮液與預(yù)熱瓊脂糖混合處理后形成的凝膠微滴中，在低營養(yǎng)條件下進(jìn)行大規(guī)模平行微生物培養(yǎng)，然后通過流式細(xì)胞儀檢測含有微菌落的微滴，實(shí)現(xiàn)高通量培養(yǎng)。2006年，Akselband等[27]成功利用微包埋技術(shù)從混合樣品中培養(yǎng)分選出生長緩慢的海洋微生物。

微包埋技術(shù)還可以與其他微生物培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)沒有被成功培養(yǎng)的海洋微生物的分離與培養(yǎng)。例如2009年，Aoi等[28]利用凝膠微滴包埋微生物細(xì)胞，并將其置于中空纖維室[29]中，在模擬自然環(huán)境的條件下培養(yǎng)，使用細(xì)胞分類系統(tǒng)對含有微菌落的凝膠微滴分類后進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)高通量培養(yǎng)。

2.3 擴(kuò)散盒高通量培養(yǎng)法

擴(kuò)散室是由孔徑0.03 mm的聚碳酸酯膜覆蓋墊圈的頂部和底部，形成一個(gè)與環(huán)境隔離的腔室。微生物稀釋后，與含有海水的溫瓊脂混合，放置在擴(kuò)散室中培養(yǎng)，并將擴(kuò)散室放置在自然環(huán)境中。聚碳酸酯膜會限制細(xì)胞的移動(dòng)，但是會允許擴(kuò)散室與環(huán)境之間進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)的交換[30]。擴(kuò)散為細(xì)胞提供了獲取其自然生長成分的途徑，包括營養(yǎng)物質(zhì)和可能的信號化合物，并去除代謝產(chǎn)物，因此擴(kuò)散室可以提高菌株的可培養(yǎng)性和多樣性[31]。

雖然通過這種方法所獲得菌株的多樣性高于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌株[32]，但該方法操作起來比較費(fèi)力，無法對微生物物種進(jìn)行高效、高通量的集體分離[33]。因此，在實(shí)際藥物的發(fā)現(xiàn)過程中，該方法有一定的限制性。

針對以上問題，Bollmann實(shí)驗(yàn)室在擴(kuò)散室的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了一種由數(shù)百個(gè)擴(kuò)散室組成的隔離芯片（iChip），該芯片由中心板和2個(gè)對稱的頂板和底板組成，這些板均由聚甲醛塊加工而成，并且具有384個(gè)直徑為1 mm的通孔。中心板由直徑為25或47 mm的濾膜覆蓋，膜的外側(cè)再覆蓋一層帶有匹配孔的頂板和底板。這種結(jié)構(gòu)使得每個(gè)通孔都成為一個(gè)微型擴(kuò)散室，因此這種芯片可以獲得大量的以前無法獲得的微生物[33]。

2015年，Ling等[34]將土壤樣品在去離子水中劇烈攪拌并靜置后，取上清液至熔融狀態(tài)的SMS培養(yǎng)基中，并稀釋到濃度為每20 mL培養(yǎng)基約含有1個(gè)細(xì)胞，然后將樣品分配到iChip的孔中。iChip與原環(huán)境土壤直接接觸，經(jīng)過1個(gè)月的孵化后，從iChip中獲得單個(gè)菌落并劃線到SMS瓊脂培養(yǎng)基上。通過這種方法成功分離到E. terrae菌株，并從它的培養(yǎng)物中得到了抗生素teixobactin（30）。Teixobactin是一種包含Enduracididine、甲基苯丙氨酸和4種D-氨基化合物的縮酚肽，其對包括耐藥菌株在內(nèi)的革蘭陽性菌具有良好的抑菌效果。

2019年，Macintyre等[35]從桶狀海綿（Xestospongia muta）上切下一小部分，均質(zhì)后將勻漿倒入無菌尼龍過濾器（100 μm；高壓滅菌）以產(chǎn)生細(xì)菌懸浮液。懸浮液用45 ℃、1/10 R2A 培養(yǎng)基分別稀釋至每毫升5 000、2 500、1 000、500和100個(gè)細(xì)胞。然后接種于iChip，并將芯片置于海綿中孵育7 d。芯片拆卸后，每個(gè)通孔的瓊脂塊轉(zhuǎn)移到48孔板的單獨(dú)孔中并用無菌木棒頂端將瓊脂塊壓平，22 ℃、黑暗孵育8周。8周后，經(jīng)1/10 R2A連續(xù)傳代純化含有不同形態(tài)菌落的孔。經(jīng)過鑒定，發(fā)現(xiàn)1種名為Alteromonassp.RKMC-009的新型細(xì)菌。該菌株能夠產(chǎn)生1種新型的N-酰基酪氨酸（N-acyltyrosine，31），其氨?；糠趾笑?甲基取代基，正是α-甲基取代基使該化合物具有較強(qiáng)的抗革蘭陽性菌活性。

2020年，Zhang等[36]用2.0%瓊脂將MA培養(yǎng)基固化后，在55℃下與稀釋后的紅樹林沉積物樣品混合，加入到iChip的孔中。然后，將iChip置于紅樹林沉積物原位培養(yǎng)2周后，從芯片上挑取無色菌落，反復(fù)重劃線純化。成功分離并培養(yǎng)出Gallaecimonas mangroviHK-28菌株，從其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中發(fā)現(xiàn)了3種新的二酮哌嗪類化合物，命名為gallaecimonamide A、B、C、D（32 ～34）[37]。進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，化合物32對哈維弧菌顯示出抑菌活性（MIC = 50 μmol · L-1），而對副溶血性弧菌（MIC＞300 μmol · L-1）和惡性瘧原蟲W2（EC50＞100 μmol · L-1）無抑菌活性?；衔?3和34對哈維弧菌（MIC＞300 μmol · L-1）、副溶血性弧菌（MIC＞300 μmol · L-1）和惡性瘧原蟲W2（EC50＞100 μmol · L-1）均無抑菌活性。

2020年，Quigley等[38]將土壤樣品在去離子水中劇烈攪拌并靜置后，取上清到熔融狀態(tài)的SMS培養(yǎng)基中，然后將試樣分配至iChip的孔中。iChip直接與土壤接觸，孵育4周后，拆解 iChip，將菌落挑取到SMS培養(yǎng)基上純化。利用該方法成功分離出未培養(yǎng)過的土壤微生物，并在培養(yǎng)物中分離出3種化合物，分別為Streptomycobactin（陽離子縮肽）、Kitamycobactin（需要P1P2C1蛋白酶的C1亞基才能發(fā)揮活性的套索肽）和Amycobactin（新型抗菌劑，其靶向分枝桿菌分泌系統(tǒng)的SecY蛋白）。

3 誘捕器原位培養(yǎng)法

誘捕器的概念最初是由美國東北大學(xué)生物與抗菌研究中心Gavrish等[39]在2008年提出，是在經(jīng)典的原位培養(yǎng)方法擴(kuò)散室的基礎(chǔ)上改良得到的方法。眾所周知，放線菌是一種革蘭陽性細(xì)菌，也是抗生素的豐富來源，如果能夠在自然環(huán)境中分離培養(yǎng)出之前“不可培養(yǎng)”的放線菌株，那么就能為新抗生素的發(fā)現(xiàn)提供可能。為了增強(qiáng)原位培養(yǎng)方法對放線菌的選擇性，Gavrish等基于放線菌能夠形成菌絲并且滲透固體環(huán)境的能力，設(shè)計(jì)并開發(fā)了這種專門捕捉和培養(yǎng)放線菌的誘捕器。

2019年，Zhang等[40]用這種方法分離并鑒定出一種耐高溫的氨?；呓z氨酸內(nèi)酯酶AidB，這是一種群體猝滅酶（quorum quenching enzyme，QQ酶），作用于群體感應(yīng)機(jī)制。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是一種細(xì)胞與細(xì)胞間的通信機(jī)制，它依賴于小分子信號的產(chǎn)生、分泌來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而影響群體密度的變化[41]。有許多革蘭陰性細(xì)菌將氨?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）的1個(gè)或者多個(gè)衍生物作為QS系統(tǒng)的信號，以此來調(diào)節(jié)多種生物功能，而這些功能中有一些對于細(xì)菌的致病性是必不可少的[42-43]。因此，通過干擾或者阻斷QS系統(tǒng)來預(yù)防細(xì)菌感染成為一種可行的策略，也被稱作群體猝滅，具有這種生物活性的酶也就是QQ酶。用誘捕器的方法對土壤細(xì)菌進(jìn)行大規(guī)模篩選，從大約4 000株分離菌中獲得了68株具有AHL降解活性的菌株。其中鑒定并命名了Boseasp. strainF3-2和Boseasp. strain12C這2株菌株，并對F3-2菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的AHL降解活性。

2021年，Mai等[44]提出了一種固相萃取嵌入透析（SPEED）技術(shù)，與最初誘捕器的設(shè)計(jì)思路有異曲同工之妙。這種技術(shù)的核心策略是利用Amberlite XAD-16樹脂捕獲有機(jī)物的方法來提取微生物的代謝產(chǎn)物。放線菌、真菌等被認(rèn)為是有價(jià)值的生物活性物質(zhì)的主要提供者[45-46]，但用XAD-16樹脂原位捕獲相應(yīng)次級代謝產(chǎn)物時(shí)，常有大量樹脂珠包埋在菌絲體形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，使得二者的分離十分復(fù)雜。如果采用洗脫的方法對樹脂-菌絲體混合物進(jìn)行分離，會造成化合物污染，影響后續(xù)目的產(chǎn)物純化。而SPEED技術(shù)的思路是通過外部的微生物生物膜與內(nèi)部的樹脂之間的物理分離來簡化回收和純化過程。SPEED管是由外部的尼龍濾布（NFC）和包含樹脂珠的內(nèi)部透析管（DT）2個(gè)屏障所組成。其中，NFC擔(dān)當(dāng)生物支持的作用，使得微生物能在其上形成生物膜，與固體培養(yǎng)類似。NFC充當(dāng)載體的作用會影響放線菌和真菌等絲狀微生物的生命周期，同時(shí)細(xì)胞周期階段的調(diào)控因子也會影響專一代謝物簇的表達(dá)[47-48]。而DT具有分子截?cái)嗟墓δ?，可以區(qū)分次級代謝產(chǎn)物和生物大分子，1 400的分子截?cái)啾ＷC了對所有專一代謝物家族的滲透性[49]。通過試驗(yàn)，分離出了Streptomyces albidoflavus19-S21菌株，并將其特異代謝產(chǎn)物用乙酸乙酯和甲醇提取后提交UPLC-MS/MS分析，獲得的數(shù)據(jù)利用基于特征的分子網(wǎng)絡(luò)（GNPS）進(jìn)行研究分析[50]。除了鑒定出一些已知化合物外，還檢測到一簇在GNPS中未知的化合物。該思路不同于之前將擴(kuò)散室應(yīng)用于分離捕獲菌株，而是在外部支持培養(yǎng)形成生物膜的同時(shí)，內(nèi)部直接通過樹脂原位捕獲次級代謝產(chǎn)物，為分離出放線菌等絲狀體微生物后的次級代謝產(chǎn)物的提取提供了十分便利的平臺。

4 土壤基質(zhì)膜系統(tǒng)

土壤基質(zhì)膜系統(tǒng)（soil substrate membrane system，SSMS）是一種新型的可用于分離和富集土壤中多種微生物的技術(shù)。傳統(tǒng)富集微生物大多是采用專一營養(yǎng)素的方法，存在分離時(shí)間較長、分離效果有限等諸多缺點(diǎn)，而SSMS方法可克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的上述不足。

SSMS方法是把環(huán)境中的微生物群落進(jìn)行稀釋后，接種于無菌PC膜上，通過TCM膜隔開加入的土壤泥漿與微生物群落，使得只有土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)可以接觸到PC膜上的菌落，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)之后，取出PC膜進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)菌群成長到一定程度，再加入到所需要的培養(yǎng)基中，獲得目的菌落。近年來已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道通過SSMS方法來篩選和分離土壤微生物。

2016年，Dorst等[51]使用SSMS方法培養(yǎng)柴油降解菌，該研究發(fā)現(xiàn)在高柴油燃料濃度土壤中，通過SSMS富集了76%的土壤總種群數(shù)的微生物，而對照土壤僅為26%。在門分類水平上，SSMS富集的微生物群落主要由變形菌構(gòu)成（占總相對豐度的88% ～ 91%），其次是厚壁菌和放線菌（占總相對豐度的2% ～ 10%）、擬桿菌和酸桿菌（＜5%總相對豐度）。通過后續(xù)觀察富集微生物與柴油的相互作用，發(fā)現(xiàn)SSMS富集到的微生物中有12個(gè)屬被顯著抑制、6個(gè)屬被顯著刺激。相比之下，在土壤中鑒定的屬中有71個(gè)屬受到顯著抑制，但只有5個(gè)屬受到顯著刺激。

2017年，Zhao等[52]使用SSMS方法分離出菲降解菌，對菲的利用率高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。從分離出的細(xì)菌種類來看，傳統(tǒng)方法與SSMS方法分離出來的細(xì)菌種類存在不同，采用傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)方法分離出的細(xì)菌主要為假單胞菌，而使用SSMS方法培養(yǎng)出的細(xì)菌主要由鞘氨醇單胞菌組成。鞘氨醇單胞菌是一種革蘭陰性細(xì)菌，其細(xì)胞膜由鞘脂糖組成，可降解多種化合物，包括聯(lián)苯、萘、芴、菲、芘、呋喃等，具有污染處理方面的潛力。

在早期實(shí)驗(yàn)中，SSMS方法多用于從環(huán)境中分離培養(yǎng)細(xì)菌。2017年，Pudasaini等[53]研究顯示，SSMS還可以用于從環(huán)境中分離和培養(yǎng)真菌，特別是軟腐菌。研究人員通過SSMS培養(yǎng)了30種軟腐菌，包括毒枝孢屬、外裂孢屬、大麥屬和背芽突霉屬，這也是第一次利用SSMS方法培養(yǎng)軟腐菌的嘗試。與標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法相比，采用SSMS培養(yǎng)后，軟腐菌的分類操作單元多樣性從14個(gè)增加到57個(gè)。該實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在實(shí)驗(yàn)條件下未能富集到的藍(lán)藻、綠菌門、綠彎菌門等光合自養(yǎng)細(xì)菌，可通過改變光源等條件來實(shí)現(xiàn)其分離。

2019年，Kwon等[54]通過SSMS法分離出了甲烷營養(yǎng)菌。在之前的研究當(dāng)中，用傳統(tǒng)微生物分離方法分離甲烷營養(yǎng)菌是通過在培養(yǎng)基頂部添加甲烷來富集可以利用甲烷的微生物，之后通過瓊脂平板來進(jìn)行重復(fù)的單菌落篩選。但因?yàn)榉蛛x時(shí)間較長，通常只會選擇快速生長的甲烷營養(yǎng)菌而忽略生長較慢的甲烷營養(yǎng)菌，而且即使是在以甲烷為唯一碳基質(zhì)的培養(yǎng)基中，甲烷營養(yǎng)菌也傾向于與甲基營養(yǎng)菌及生活在甲烷營養(yǎng)菌分泌的代謝物上的其他異養(yǎng)菌形成聚集體，從而使后續(xù)的分離變得困難。SSMS分離技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，縮短了分離所需的時(shí)間，并產(chǎn)生了更多類型的分離物。

5 結(jié)語與展望

隨著各種新型的微生物培養(yǎng)技術(shù)在海洋微生物研究方面的應(yīng)用，越來越多的新穎次級代謝產(chǎn)物不斷被人們所發(fā)現(xiàn)，為海洋來源創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為解決病原菌抗生素的耐藥性不斷增加的問題貢獻(xiàn)了新的研究思路。

雖然微生物培養(yǎng)新技術(shù)已經(jīng)取得了一定的研究成果，但仍然面臨著諸多的挑戰(zhàn)與限制。在共培養(yǎng)技術(shù)中，如何篩選相互作用的菌株？微生物之間如何在群體感應(yīng)系統(tǒng)中識別自誘導(dǎo)信號和外誘導(dǎo)信號？新產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對共培養(yǎng)的菌株有何影響？共培養(yǎng)菌株的投放時(shí)間及投放順序?qū)才囵B(yǎng)結(jié)果會產(chǎn)生什么樣的影響[55]？兩種或兩種以上微生物共同培養(yǎng)時(shí)的代謝物的生產(chǎn)者如何確定[5]等，上述一系列問題仍然困擾著研究者。目前，已知共培養(yǎng)的結(jié)果大多具有偶然性，缺乏可預(yù)見性和可重復(fù)性。因此，需要新的技術(shù)和設(shè)備，如代謝組學(xué)分析和分子網(wǎng)絡(luò)技術(shù)等來進(jìn)一步推動(dòng)共培養(yǎng)技術(shù)的完善。

高通量培養(yǎng)法在分離培養(yǎng)之前無法采用常規(guī)培養(yǎng)方法的微生物方面有著比較成熟的應(yīng)用，這極大地促進(jìn)了研究者們對海洋微生物種類的探索。但是高通量培養(yǎng)法在發(fā)現(xiàn)新型化合物方面應(yīng)用有限，這有待研究者們對該方法進(jìn)一步改進(jìn)。Benítez等[25]對基于滅絕培養(yǎng)的高通量培養(yǎng)方法流程做了改進(jìn)后，得到了新的化合物，這是該方法發(fā)展過程中的突破。

誘捕器原位培養(yǎng)法是在土壤環(huán)境中選擇性分離放線菌的方法，通過分離出之前“未培養(yǎng)”的新放線菌株，為新抗生素的發(fā)現(xiàn)提供可能性。這種方法的核心啟示是原位捕獲的策略，通過濾膜的分離機(jī)制直接從菌株最適應(yīng)的天然環(huán)境中分離捕獲菌株。SPEED技術(shù)是相似策略的最新方法，捕獲對象與誘捕器的菌株不同，是分子更小的次級代謝產(chǎn)物，同時(shí)也應(yīng)用了樹脂的富集作用，值得學(xué)習(xí)和發(fā)展。

SSMS作為一種新型的微生物培養(yǎng)技術(shù)，可以培養(yǎng)多種土壤微生物，包括之前使用傳統(tǒng)方法難以培養(yǎng)或分離困難的微生物。在環(huán)境污染的防治、微生物群落的分析等方面具有重要作用，并且在獲得稀有微生物方面具有巨大的應(yīng)用潛力。