魯萊黑豬MYH3基因外顯子突變搜尋及其與肌內(nèi)脂肪的關(guān)聯(lián)分析

徐 晶，王繼英，周李生，鄭仰清，張昌政，趙雪艷*，張廷榮*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南 250100）

魯萊黑豬是我國萊蕪豬（具有代表性的中國地方豬品種）與約克夏豬雜交，經(jīng)人工選育而成的新品種。該品種屬肉脂兼用型豬種，其肉色澤鮮紅、細嫩多汁，并以其肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量高而聞名。IMF 含量對肉質(zhì)有重要影響，人們普遍認為高IMF 含量可以顯著提高豬肉風味。IMF 含量具有較高的遺傳力，在品種之間和品種內(nèi)均顯示出顯著的遺傳差異。在魯萊黑豬的群體當中，影響IMF 的基因也存在著一定程度的分離，并且SNP 標記和QTN 之間存在廣泛連鎖不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）。因此，對豬IMF 的單核苷酸多態(tài)性和相關(guān)基因的鑒定，特別是利用IMF 含量變異較大的群體，有助于建立優(yōu)化豬肉IMF 的分子育種工具，并揭示脂肪沉積的機理。由于肉質(zhì)性狀是當前養(yǎng)豬業(yè)核心育種目標之一，鑒別影響IMF 的因果突變和主效基因具有重要的經(jīng)濟價值和科學意義。在過去的20 年里，利用微衛(wèi)星標記在豬身上發(fā)現(xiàn)了許多影響IMF 含量的QTL。隨著高通量SNP 基因分型方法的發(fā)展，近年來，一些全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）在鑒定與包括IMF 含量在內(nèi)的多種性狀相關(guān)或潛在的遺傳因素方面取得了實質(zhì)性進展。熊信威等利用GWAS 分析揭示了中國萊蕪豬肉質(zhì)性狀的遺傳基因座和候選基因，其中就包括4個連鎖的（Myosin Heavy Chain）基因。除此之外，CHO 等研究發(fā)現(xiàn)，基因通過影響肌纖維的組成而影響肌纖維特性，并且該基因啟動子區(qū)的功能性調(diào)節(jié)突變（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）是影響豬的肌纖維類型組成和IMF 含量的因果突變。目前，國內(nèi)外關(guān)于豬基因方面的研究較少，特別是在魯萊黑豬等中國地方豬/培育豬群體中尚無相關(guān)研究報道。本實驗通過驗證功能性突變在魯萊黑豬群體中對IMF的效應，同時在基因外顯子中搜尋影響IMF 的顯著性突變位點，從而給魯萊黑豬肉質(zhì)性狀的選育提供潛在的分子標記，并為搜尋影響魯萊黑豬群體IMF 的因果位點和主效基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗研究對象為435 頭魯萊黑豬，其中公豬276 頭，母豬159 頭。所有豬只均來源于萊蕪豬原種豬場，表型測定由山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)所完成。用耳號鉗采集耳組織樣，放置于裝有75% 酒精的離心管中，用裝有干冰的盒子帶回實驗室，-20℃凍存，用于提取魯萊黑豬基因組DNA。

1.2 體重和IMF 含量的測定及DNA 的提取 屠宰時體重（BW）和IMF 的測定方法分別按照《瘦肉型豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T825-2004）和《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 821-2004）進行。當魯萊黑豬體重在70～100 kg 之間時進行屠宰，并從每頭豬的最后一根肋骨收集約200 g 背最長肌，采用索氏石油醚萃取法測定IMF 含量。肌內(nèi)脂肪含量（%）=［（浸提前烘干重－浸提烘干后重）／鮮肉樣重］×100。

采用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN 生化科技公司）提取魯萊黑豬耳基因組DNA。用SpectraMax QuickDrop超微量分光光度計對DNA 進行質(zhì)量檢測和濃度測定。A/A比值在1.8～2.0，A/A比值>2.0 評定為合格的DNA。合格的DNA 樣品其濃度使用ddHO 統(tǒng)一稀釋為20～50 ng/μL 范圍內(nèi)，用于后續(xù)實驗。

1.3 引物設計合成和PCR 擴增 根據(jù)豬基因序列（Sscrofa11.1：CM000823.5），使用Premier 5.0 軟件共設計了21 對引物，具體見表1。所有引物均由青島擎科生物公司合成。對魯萊黑豬基因外顯子進行擴增。PCR 模板為根據(jù)IMF 含量的高低在435 頭魯萊黑豬中隨機選取IMF 低、中、高、極高公母各2 頭豬構(gòu)建的8個DNA 混合池，標號為1～8 號。PCR 擴增總反應體系為25 μL：DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.5 μL。PCR 擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離。將條帶明亮且單一的PCR 產(chǎn)物原液送由青島擎科生物公司sanger 測序。

表1 MYH3基因外顯子測序PCR 引物及反應條件

1.4 序列分析 采用DNAMAN、BioEdit 7.0 等生物信息學軟件對魯萊黑豬基因編碼區(qū)序列進行拼接、氨基酸序列預測以及蛋白質(zhì)分析。利用https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw 在線網(wǎng)站和GeneDoc軟件對核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列進行比對分析。利用在線網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/和Compute pI/Mw 軟件預測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，CPHmodels 軟件和Antheprot 3D viewer 軟件預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。實驗中涉及的動物基因均從NCBI 數(shù)據(jù)庫和Ensembl 下載，包括人（NM_002470.4）、倭黑猩猩（XM_034942369.1）、小鼠（XM_006532412.2）、大鼠（NM_012604.1）、綿羊（XM_027974881.1）和牛（NM_001101835.1）。

1.5 SNP 位點的搜尋及基因分型

1.5.1 PCR-RFLP 分析 根據(jù)CHO 等研究結(jié)果公布的豬基因啟動子區(qū)域因果位點信息（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）以及Ensembl 網(wǎng)站查閱的基因序列信息，利用Premier 5.0 軟件設計引物，引物序列為：F：5'-GGGCTACCTCCCTCTCA-3'，R：5'-GTTGTGGCAGGAATGTGT-3'，擴增目的片段長度約為143 bp。PCR 反應體系為25 μL:DreamTaqTM Green PCR Master Mix（2X） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.5 μL。PCR 擴增反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s、61℃退火30 s、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。魯萊黑豬基因PCR 產(chǎn)物的HpyCH4IV酶切體系共25 μL：PCR原液10 μL，星選 酶HpyCH4 IV 0.5 μL，10×NEBuffer 2.5 μL，ddHO 12 μL。37℃溫育15 min 后用3%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，進行基因型的確定。

1.5.2 SNP 位點搜尋及分析 將測序所得結(jié)果進行DNAMAN 和SeqMan 比對，同時對序列圖譜進行峰圖分析，找出基因外顯子發(fā)生突變的SNP 位點。根據(jù)比對結(jié)果，重點對基因外顯子中的錯義突變位點進行生物信息學分析：采用2 種預測方法SIFT（https://sift.bii.a-star.edu.sg/）和PROVEN對各個nsSNP 進行有害性預測，分析預測突變后氨基酸的替換是否可能影響的功能。利用在線網(wǎng)站ConSurf進一步對魯萊黑豬基因編碼的氨基酸進行保守位點預測，越保守的位點發(fā)生變異越有可能對功能和結(jié)構(gòu)造成影響。

1.5.3 SNaPshot 基因分型 根據(jù)SNP 位點搜尋及分析結(jié)果，篩選出基因外顯子區(qū)域內(nèi)最有可能影響IMF 含量的SNP 位點。將魯萊黑豬所有的耳組織DNA樣品及SNP 位點信息送至上海天昊生物科技有限公司進行SNaPshot 基因分型。

使用PLINK 軟件中的線性模型進行關(guān)聯(lián)分析，將性別和體重作為固定效應，其表達式為：y=1+Xb+SNP×+e。其中，y 為測定表型值，表示總體平均值，X 是固定效應的關(guān)聯(lián)矩陣，b 是性別和體重的固定效應向量，為SNP 標記的效應，e 為殘差。

2 結(jié)果

2.1 魯萊黑豬表型測定結(jié)果 由表2 可知，BW 和IMF在魯萊黑豬群體中存在較大程度變異，而IMF 的變異程度更高，其變異系數(shù)高達65.12%。

表2 魯萊黑豬群體體重與肌內(nèi)脂肪的表型統(tǒng)計

2.2功能性突變與魯萊黑豬BW 和IMF 的關(guān)聯(lián)性分析 經(jīng)HpyCH4 IV 酶切結(jié)果顯示，基因位點（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）PCR 擴增產(chǎn)物產(chǎn)生了等位基因q（143 bp）和Q（91、46 bp），并且檢測到了qq、Qq 和QQ 3 種基因型。其中Qq 在群體中為優(yōu)勢基因型，其頻率為0.759；Q 為優(yōu)勢等位基因，頻率為0.523，具體如表3 和圖1 所示。

表3 魯萊黑豬MYH3基因位點（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）的基因型頻率和基因頻率

圖1 魯萊黑豬MYH3基因PCR 產(chǎn)物HpyCH4 IV 酶切檢測

功能突變在魯萊黑豬群體中的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：該突變在魯萊黑豬群體中與IMF 無顯著關(guān)聯(lián)（表4），表明它可能不是影響魯萊黑豬IMF 的因果位點，由此需進一步在基因外顯子上搜尋是否存在影響著魯萊黑豬IMF 的突變位點。

表4 MYH3功能性突變在魯萊黑豬群體中的關(guān)聯(lián)分析

2.3 魯萊黑豬基因與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析 通過測序和序列拼接得到了魯萊黑豬基因的編碼區(qū)序列，序列長度為5 790 bp（圖2）。BLAST 比對發(fā)現(xiàn)魯萊黑豬基因編碼區(qū)核苷酸序列與引物源序列的一致性為99.59%。經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)，魯萊黑豬基因編碼區(qū)核苷酸序列與其他動物如人、倭黑猩猩、綿羊、牛、大鼠、小鼠的一致性分別為86.61%、89.95%、88.13%、87.64%、85.46%、85.27%。魯萊黑豬基因編碼蛋白含有1 929個氨基酸殘基。經(jīng)氨基酸組分分析，魯萊黑豬基因編碼蛋白氨基酸序列含有全部的20 種氨基酸，其中谷氨酸（Glu）含量最高為13.3%，色氨酸（Trp）含量最低，僅有0.5%。正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)有313個，負電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)有359個。氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，魯萊黑豬MYH3 蛋白氨基酸序列與人、倭黑猩猩、綿羊、牛、大鼠、小鼠的一致性分別為97.16%、96.86%、96.40%、97.52%、96.75%、96.44%。

圖2 魯萊黑豬MYH3基因核苷酸序列與預測的氨基酸序列

使用在線網(wǎng)站http://web.expasy.org/protparam/和Compute pI/Mw 對魯萊黑豬MYH3 蛋白理化性質(zhì)預測，其分子量為222 411.10，理論等電點pI 為5.62。編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為46.18，大于40，說明編碼產(chǎn)物具有不穩(wěn)定性。編碼蛋白質(zhì)片段的親水性平均值為-0.772，表明該基因編碼的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)親水性，由此可推斷豬基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白質(zhì)。NCBI和TMHMM Server v.2.0 在線軟件對MYH3 蛋白功能結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示在魯萊黑豬MYH3 蛋白上未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，但在1～800 位氨基酸檢測到SH1 螺旋結(jié)構(gòu)域、P-loop 結(jié)構(gòu)域、converter 結(jié)構(gòu)域、purinebinding loop、relay loop結(jié)構(gòu)域、switch I 和II結(jié)構(gòu)域以及一個MYSc_Myh3 結(jié)構(gòu)域（100-767）。利用CPHmodels 和Antheprot 3D viewer 在線工具進行魯萊黑豬MYH3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測分析，結(jié)果如圖3 所示。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示魯萊黑豬MYH3 蛋白包含4.9%螺旋、25.7%折疊以及68.4%無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

圖3 魯萊黑豬MYH3 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 魯萊黑豬基因外顯子突變位點搜尋與生物信息學分析

2.4.1 魯萊黑豬基因外顯子PCR 擴增 以DNA混池作為PCR 擴增模板，利用21 對引物進行PCR 擴增，PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的條帶清晰、整齊無拖尾，且擴增片段長度與引物設計時預期長度一致，可用于測序（圖4）。

圖4 魯萊黑豬MYH3基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

2.4.2 SNP 搜尋與預測分析結(jié)果 通過對16 頭魯萊黑豬耳組織DNA 樣品測序結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)在魯萊黑豬基因外顯子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)31個SNP 位點。如表5 所示，有9個SNP 位點屬于錯義突變（Missense Variant），剩余22個SNP 位點屬于同義突變（Synonymous variant）。對1～9 SNP 位點進行有害性預測及保守性分析。結(jié)果表明，采用SIFT 和PROVEN 方法分別預測到4個和2個有害突變，其中55351779 和55347097 位置的位點2 種方法均預測為有害位點。利用在線網(wǎng)站ConSurf對位點進行保守性分析，具有高度保守性的位點共有4個，分別是SSC12:55358364、SSC12:55356662、SSC12:55351779 和SSC12:55347097。這4個位點的多態(tài)性更容易對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能造成影響（表6）。

表5 魯萊黑豬MYH3基因外顯子突變位點氨基酸分析

表6 魯萊黑豬MYH3基因外顯子有害SNP 預測及保守位點預測

2.5 魯萊黑豬基因外顯子突變位點的遺傳學分析

2.5.1 魯萊黑豬基因分型位點的遺傳學分析 通過SNP 位點搜尋及分析，統(tǒng)計篩選出4個SNP 位點，分別命名為SNP1、SNP2、SNP3 和SNP4，利用SNaPshot 技術(shù)進行基因分型。魯萊黑豬基因各位點基因分型的計算結(jié)果如表7 所示。經(jīng)卡方檢驗所有位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（>0.05）。遺傳學分析如表8 所示，在魯萊黑豬群體中，4個SNP 位點的純合度均高于雜合度，這表明該4個SNP 位點在魯萊黑豬群體之中變異程度較小。位點SNP3 多態(tài)信息含量（PIC）為0.374，屬于中度多態(tài)。其余位點多態(tài)信息含量（PIC）均小于0.25，屬于低度多態(tài)。

表7 魯萊黑豬MYH3基因外顯子突變位點基因型頻率及基因頻率

表8 魯萊黑豬MYH3基因基因分型位點He、Ho、Ne、PIC參數(shù)

2.5.2 魯萊黑豬基因分型位點與IMF 關(guān)聯(lián)性分析魯萊黑豬基因分型位點與該群體的IMF 性狀、BW 的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表9 所示。鑒于矯正性別分析后，幾乎4個SNPs 位點僅與BW 有關(guān)聯(lián)，SNP4 位點與BW顯著相關(guān)，而SNP1 和SNP2 位點與BW 極顯著相關(guān)。根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選的外顯子突變位點對魯萊黑豬IMF性狀都沒有顯著影響，不是影響IMF 的因果突變。

表9 魯萊黑豬MYH3基因各SNPs與IMF關(guān)聯(lián)分析（P值）

3 討 論

基因編碼胚胎型肌球蛋白重鏈蛋白，控制肌肉的牽引滑動。它通過分子間的構(gòu)形改變，從而導致肌球蛋白與ATP 結(jié)合，使ATP 水解，繼而產(chǎn)生運動強力，進而對于肌肉的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的影響。近幾年來，基因是人類代謝疾病及胎兒發(fā)育研究的關(guān)注重點，研究發(fā)現(xiàn)基因突變可以改變TGF-信號通路和MAPK 信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平，影響肌肉的能量代謝，最終引發(fā)肌肉能量代謝疾病?；蛟诩∪獍l(fā)育的整個過程中都具有非常重要的作用。王麗君研究發(fā)現(xiàn)，基因在肌肉和脂肪中表達量較高，從而驗證了該候選基因參與機體的脂質(zhì)和肌肉的生長、信號傳導及肌肉收縮等生理現(xiàn)象。成志敏等研究發(fā)現(xiàn)，基因通過影響肌纖維的組成而影響肌纖維特性，初步揭示了造成馬身豬和大白豬肌纖維性狀差異的主要原因。CHO 等通過染色質(zhì)免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)，韓國本土黑豬體內(nèi)基因啟動子上存在6 bp 堿基的缺失，使韓國本土黑豬背最長肌的IMF 含量增加。種種研究結(jié)果證實基因是IMF 的關(guān)鍵基因。IMF 是個重要的經(jīng)濟性狀，其含量直接影響豬肉品質(zhì)。根據(jù)本研究對魯萊黑豬群體IMF 含量的表型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，該性狀在群體中變異程度較大，可能的原因有：第一，魯萊黑豬的祖代萊蕪豬群體中的IMF 表型就存在較大的分離；第二，IMF 屬于數(shù)量性狀，可能受到多個效應的QTL 共同調(diào)控，在魯萊黑豬長期的世代培育過程中積累了足夠的重組事件，且不同QTL 組合方式多樣，從而造成個體間表型的較大差異；第三，魯萊黑豬群體在選育過程中可能并未對IMF 進行高強度的選育。由此可見，利用魯萊黑豬群對IMF 進行QTL 定位及主效基因的鑒別具有較好的優(yōu)勢。

本研究通過測序獲得了基因外顯子的全序列，通過比對分析發(fā)現(xiàn)魯萊黑豬基因核苷酸序列、編碼蛋白的氨基酸序列與其他哺乳動物的同源性均較高，說明基因在不同物種中高度保守。魯萊黑豬MYH3 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示MYH3 蛋白未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，表明該蛋白不具有跨膜功能，含有SH1 螺旋結(jié)構(gòu)域、P-loop 結(jié)構(gòu)以及MYSc_Myh3 結(jié)構(gòu)域。SH1 螺旋結(jié)構(gòu)域含有約100個氨基酸，結(jié)構(gòu)域與氨基酸組成了保守特性，與前面測序結(jié)果比對相一致。P-loop 結(jié)構(gòu)域中的Glu148 和Tyr150 易發(fā)生突變降低蛋白酶的活性，且該區(qū)域廣泛存在于磷酸結(jié)合蛋白中，磷酸化位點對基因具有重要功能。而MYSc_Myh3 結(jié)構(gòu)域具有編碼驅(qū)動蛋白以及調(diào)控蛋白的作用，由此可以推測MYH3 蛋白可能具有調(diào)控的作用。

2019 年發(fā)表在《PLOS Genetic》的論文結(jié)果表明：位于基因啟動子區(qū)的功能性突變是影響韓國本土黑豬肌內(nèi)脂肪含量的因果突變，且最后文章結(jié)果表明該位點在中國地方豬中存在分離，但并無與表型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，因此本文根據(jù)CHO 等的研究結(jié)果設計實驗思路，在肌內(nèi)脂肪含量表型分離顯著、具有代表性的中國培育品種——魯萊黑豬群體中開展該位點的基因型檢測與關(guān)聯(lián)分析工作。首先通過酶切實驗及測序在魯萊黑豬群體中對位點（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）進行檢測，結(jié)果在群體中發(fā)現(xiàn)了該位點的等位基因Q，多態(tài)性分析結(jié)果顯示該位點的野生型基因q 頻率為0.477，突變型基因Q 頻率為0.523。根據(jù)先前研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在西方商品豬中如長白豬、大白豬中幾乎檢測不到Q 基因的存在或者頻率很低。經(jīng)關(guān)聯(lián)分析檢測結(jié)果表明，基因啟動子區(qū)6 bp 堿基的缺失不是影響魯萊黑豬IMF 的因果突變，這可能是由于魯萊黑豬與韓國本土豬的血緣品種不同或者生存環(huán)境的差異造成的。所以推測在基因上可能存在別的位點影響其IMF 含量。同時表明：有必要在其他中國地方豬群體中檢測該突變對表型的效應，為豬肉質(zhì)性狀的分子標記輔助育種提供重要理論依據(jù)。從基因外顯子中所有的SNPs 位點分析，經(jīng)過有害性預測及位點保守性分析篩選出4個SNPs 位點，對其進行多態(tài)性檢測以及與IMF 等性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示大多數(shù)位點僅與體重有關(guān)，提示上述位點可以作為魯萊黑豬體重指標育種的潛在分子標記，而不能作為IMF 指標育種的分子標記位點。此外，可以推測魯萊黑豬群體中存在新的突變位點/主效基因影響著IMF 的含量，為后期鑒定真正的因果突變奠定了基礎。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，基因啟動子區(qū)中功能性突變位點（XM_013981330.2：g.-1805_-1810del,chr12：55 373 707）可能不是影響魯萊黑豬IMF 的因果位點，而檢測的4個基因外顯子突變位點與肌內(nèi)脂肪不存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，在魯萊黑豬群體中可能存在其他的突變位點/主效基因影響其IMF。