不同泌乳期牦牛乳腺組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

董寶霞，楊玉瑩，俞紅賢，張勤文，高小龍，李莉，魏青，荊海霞*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海西寧 810016）

牦牛是一種特殊牛種，主要分布于平均海拔3 000 m左右的青藏高原及其鄰近地區(qū)。相對荷斯坦牛、山羊、黑犏牛、馬和駱駝等產(chǎn)乳動物而言，牦牛乳含有比其他種類的乳更高的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)等，且維生素含量很高，營養(yǎng)成分均衡，具有易消化、易吸收的特點(diǎn)，能滿足嬰幼兒日常營養(yǎng)需求，是一種理想的嬰幼兒奶粉的原料。雖然牦牛乳具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但其產(chǎn)量低的缺點(diǎn)導(dǎo)致牦牛乳價(jià)格較高，限制了牦牛乳的大規(guī)模推廣，如何提高牦牛的產(chǎn)奶量以及牦牛乳的品質(zhì)是當(dāng)前亟需解決的問題。

乳汁是由乳腺分泌的，是幼兒和幼畜的主要食物，其分泌主要是在催乳素、雌激素、腎上腺糖皮質(zhì)激素和胰島素等激素的綜合作用下進(jìn)行的，而乳腺是雌性動物撫育幼崽過程中必不可少的一部分。目前，為了提高乳畜的產(chǎn)奶量，相關(guān)學(xué)者利用多種技術(shù)對乳腺組織泌乳調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了大量研究。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究取得了很大進(jìn)展，并在各個(gè)領(lǐng)域有了廣泛應(yīng)用。RNA 高通量測序技術(shù)（RNA Sequencing,RNA-Seq），是指將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及PCR 擴(kuò)增形成cDNA，然后對其進(jìn)行測序，從而可以精確地定量幾乎所有的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于奶牛乳腺組織的研究中。Dai 等、Gao、Lin 等曾利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對奶牛乳腺組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析；Fan 等對3 頭干奶期牦牛和2 頭泌乳期牦牛的乳腺組織樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一些牦牛在不同生理期的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）以及代謝通路等。雖然轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在牦牛身上也有相關(guān)研究，但有關(guān)牦牛乳腺組織泌乳機(jī)制方面的研究相對較少。因此，為系統(tǒng)了解牦牛乳腺組織泌乳調(diào)控的機(jī)制，本研究利用RNA-Seq 技術(shù)，將處于不同泌乳期的牦牛乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，并進(jìn)行對比分析，以期了解不同泌乳階段的牦牛乳腺組織的DEGs 及所涉及的泌乳相關(guān)通路，為進(jìn)一步研究牦牛乳腺組織中的泌乳分子機(jī)制和提高牦牛泌乳量及乳品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)乳腺樣品采集 2020 年7 月于青海省祁連縣某養(yǎng)殖場選取處于泌乳早期（Early Lactation Period,ELP）、泌乳中期（Mid-Lactation Period,MLP）、干奶期（Dry Lactation Period,DLP）的健康牦牛各3 頭，其中ELP牦牛處于產(chǎn)后10 d 左右，MLP 牦牛處于產(chǎn)后70 d 左右，DLP 牦牛處于產(chǎn)后300 d 左右。將每頭牦牛的2個(gè)后乳區(qū)表皮進(jìn)行剝離，分別采集乳腺組織后迅速切成1 cm×1 cm×1 cm 的小塊，放至無RNA 酶的離心管中并立即投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序 將收集到的牦牛乳腺組織樣品用干冰送至北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行總RNA 提取并使用帶有Oligo(dT) 的磁珠富集mRNA 以進(jìn)行cDNA 文庫的構(gòu)建，文庫構(gòu)建流程如圖1。然后，通過Illumina-Hiseq（HiSeqTM2500/4000）平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

圖1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建示意圖

1.3 質(zhì)量控制 將Illumina 測序得到的raw reads（FASTQ Format）進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾后得到clean reads，并計(jì)算Q20（Phred 數(shù)值大于20 的堿基占總體堿基的百分比）、Q30（Phred 數(shù)值大于30 的堿基占總體堿基的百分比）及clean reads 的GC 含量。

1.4 參考基因組序列比對 比對軟件選用TopHat2，將轉(zhuǎn)錄組測序reads 比對到基因組上，然后通過分析比對結(jié)果識別外顯子之間的剪接點(diǎn)（Splicing Junction）。TopHat2 分析流程如圖2 所示。

圖2 TopHat2 分析流程圖

1.5 定量基因表達(dá)水平 參考文獻(xiàn)，采用HTSeq軟件分析每個(gè)樣品的基因表達(dá)水平，模型為union。計(jì)算各基因的RPKM 值。

1.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.6.1 差異表達(dá)分析 用DESeq R 軟件包（1.10.1）分析轉(zhuǎn)錄組在條件不同時(shí)的差異表達(dá)，計(jì)算log2（Fold Change）及其統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的值。本研究以|log2（FoldChange）|>2 且qvalue<0.005 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)來確定基因表達(dá)的顯著性。

1.6.2 差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析用GOseq 軟件。同時(shí)，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)對通路進(jìn)行顯著性富集分析，以KEGG pathway 為單位找出DEGs 顯著富集的通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

2.1.1 堿基質(zhì)量分布檢查 檢測原始序列錯(cuò)誤率分布情況，用Phred 數(shù)值（Phred Score，Qphred）來體現(xiàn)堿基質(zhì)量。結(jié)果表明，不同泌乳期的牦牛乳腺組織樣品的Q20 均在97.12% 以上，說明在測序時(shí)正確識別率大于99%的堿基總數(shù)占所測定的堿基總數(shù)的97.12%；不同泌乳期各樣品的Q30 均在92.82% 以上，說明在測序時(shí)正確識別率大于99.9% 的堿基數(shù)占到所檢測堿基總數(shù)的92.82%。測序結(jié)果顯示，每個(gè)乳腺組織樣品的clean bases 總數(shù)均大于9.66 G，GC 含量在46.96%～50.42%，表明測序質(zhì)量較高。

2.1.2 測序數(shù)據(jù)比對分析 將每個(gè)乳腺組織樣品的clean reads 比對到參考基因組上，能定位到基因組上的測序序列的比例大于99.98%。每個(gè)乳腺組織樣品測序的clean reads 與參考基因組的比對率均達(dá)到95.77%以上。說明數(shù)據(jù)使用率可靠，所選擇的參考基因組適合于后續(xù)分析。

2.2 基因差異表達(dá)分析及篩選 差異表達(dá)分析的目的是找出不同樣本間存在的DEGs，結(jié)果見圖3，每個(gè)時(shí)間段內(nèi)所得到的DEGs 也是不同的，將DLP 與ELP、MLP 進(jìn)行 對比，總DEGs 分別為3 137、394個(gè)；將MLP 與ELP 進(jìn)行對比，總DEGs 為281個(gè)。不同泌乳階段乳腺組織前10個(gè)DEGs 如表1、2、3 所示。

表1 DLP vs MLP 組乳腺組織前10個(gè)顯著DEGs

圖3 差異表達(dá)基因的火山圖

從不同組別的DEGs 中可以發(fā)現(xiàn)，很多基因在ELP和MLP 表達(dá)量高，但是在DLP 表達(dá)量明顯降低甚至不表達(dá)，如跨膜通道樣蛋白5（）、乳過氧化物酶（）、糖蛋白2（）等；反之，在ELP 和MLP 表達(dá)量低或者不表達(dá)的基因在DLP 的表達(dá)量升高，如細(xì)胞色素P450 家族2 亞家族F 成員1（）、突觸結(jié)合 蛋白4（）、短鏈脫氫酶/還原酶家族9C 成員7（）等。

2.3 GO 聚類分析和 KEGG 通路分析

2.3.1 各時(shí)間段相關(guān)上調(diào)、下調(diào)基因的GO 富集分析結(jié)果 用Gene Ontology 通過GO 富集功能分析各時(shí)間段上、下調(diào)相關(guān)基因，F(xiàn)DR<0.05 有意義，將DLP vs MLP、DLP vs ELP、MLP vs ELP 對照組各泌乳階段的差異表達(dá)上、下調(diào)基因做GO 功能分析，結(jié)果顯示，3組牦牛乳腺組織的DEGs 包括分子功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分3 大類。在DLP vs MLP 對照組中生物學(xué)過程類別內(nèi)富集的前5 條GO 類別如表4 所示。各組相關(guān)上調(diào)、下調(diào)DEGs 分別被注釋到GO term，如圖4 所示。結(jié)果顯示，3 組牦牛乳腺組織中，最為富集的是多細(xì)胞生物過程（Multicell Organismal Process）；其次是生物過程的正調(diào)控（Positive Regulation of Biological Process）和發(fā)育過程（Development Process）。其中與細(xì)胞相關(guān)的GO 類別占大多數(shù)。分子功能類別中，富集的前10 條GO 類別全都與酶活性相關(guān)，其中最為富集的是氧化還原酶活性（Oxidoreductase Activity）、單加氧化酶活性（Monooxygenase Activity）。在細(xì)胞組分類別中，最為富集的類別是胞外區(qū)（Extracellular Region）、細(xì)胞外圍（Cell Periphery）、質(zhì)膜（Plasma Membrane）。

圖4 GO 富集柱狀圖

表4 生物學(xué)過程富集前5 條GO 類別

2.3.2 各泌乳階段相關(guān)上調(diào)、下調(diào)基因的KEGG 富集分析結(jié)果 為了進(jìn)一步了解這些DEGs 所參與的生物化學(xué)代謝途徑和信號傳導(dǎo)途徑，本研究利用KEGG 公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析（圖5）?？芍?，在DLP vs ELP、DLP vs MLP、MLP vs ELP 中的DEGs 分別涉及29、15、22條通路，DLP vs ELP 組富集程度最高的前10 條通路中，最為富集的通路是味覺傳導(dǎo)（Taste Transduction），其次是ECM 受體相互作用（ECM-receptor Interaction）和軸突導(dǎo)向（Axon Guidance）。DLP vs MLP 組富集程度最高的前10 條通路中，最為富集的通路是味覺傳導(dǎo)（Taste Transduction），其次是藥物代謝細(xì)胞色素P450（Drug Metabolism -cytochrome P450）和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine,Serine and Threonine Metabolism）。MLP vs ELP 組富集程度最高的前10 條通路中，最為富集的通路是卵巢類固醇生成（Ovarian Steroidogenesis），其次是甲狀腺激素合成（Thyroid Hormone Synthesis）和味覺傳導(dǎo)（Taste Transduction）。

圖5 差異基因KEGG 富集散點(diǎn)圖

表2 DLP vs ELP 組乳腺組織前10個(gè)顯著DEGs

表3 MLP vs ELP 組乳腺組織前10個(gè)顯著DEGs

3 討 論

本研究采用了RNA-Seq 技術(shù)對處于ELP、MLP 和DLP 的牦牛乳腺組織樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果共檢測到3 812個(gè)DEGs，其中2 907個(gè)表達(dá)上調(diào)，905個(gè)表達(dá)下調(diào)。與ELP 相比，DLP 有2 643個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，494個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；與MLP 相比，DLP 表達(dá)上調(diào)的基因有142個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有252個(gè)；而與ELP 相比，MLP 有122個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，159個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。GO 分析顯示富集最豐富的條目與物質(zhì)代謝、化學(xué)反應(yīng)等相關(guān)，KEGG 分析表明DEGs 主要富集在味覺傳導(dǎo)、ECM 受體相互作用、卵巢類固醇生成。Fan等也曾研究了牦牛干奶期和哺乳期乳腺組織的轉(zhuǎn)錄組，共發(fā)現(xiàn)360個(gè)DEGs，其GO 分析表明最豐富的條目與蛋白質(zhì)結(jié)合、免疫系統(tǒng)等功能相關(guān)，KEGG 分析表明DEGs 主要集中于類固醇生物合成、HIPPO 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，本研究也同該研究一樣發(fā)現(xiàn)了牦牛在不同泌乳期的DEGs，并對其進(jìn)行了GO 和KEGG 分析，為今后提高牦牛的乳產(chǎn)量以及提升乳品質(zhì)有著一定的指導(dǎo)意義。

3.1 物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)與乳糖、乳蛋白和乳脂合成 將本實(shí)驗(yàn)所得到的不同泌乳期的DEGs 進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，泌乳啟動過程中的許多高表達(dá)的基因與物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)活動有著密不可分的關(guān)系，與前人在牛和小鼠乳腺中的研究結(jié)果一致。乳汁主要是通過新物質(zhì)合成以及從血液中吸收2 部分進(jìn)行，并且這個(gè)過程中需要ATP 和相應(yīng)酶的參與。血液中含有的維生素、無機(jī)鹽、球蛋白以及激素等可以被乳腺獲取后直接轉(zhuǎn)變?yōu)槿橹煞植⒆罱K合成乳糖、乳脂和乳蛋白等物質(zhì)。伴隨著泌乳過程的啟動，乳腺對氨基酸、葡萄糖及其他營養(yǎng)物質(zhì)的需求量大大增加。

乳糖是哺乳動物乳汁中特有的、由葡萄糖和半乳糖結(jié)合形成的一種化合物，它的形成對乳汁的生成來說有著至關(guān)重要的作用。有關(guān)于山羊的研究表明，在分娩后1 周的乳腺比分娩前9 天所吸收的葡萄糖的量有非常顯著的增加。本研究所得到的數(shù)據(jù)顯示在泌乳早期-乳白蛋白的表達(dá)上調(diào)。血液中的游離氨基酸可被乳腺用來合成-乳球蛋白、酪蛋白和-乳清蛋白。本研究數(shù)據(jù)顯示，與DLP 相比，ELP 乳蛋白基因表達(dá)量增高顯著。牛的前胃內(nèi)有大量的微生物，其發(fā)酵之后會生成很多產(chǎn)物，包括乙酸、丁酸等，最后合成C4～C16 脂肪酸，而且血液中的乳糜微粒和脂蛋白分解后也會產(chǎn)生脂肪酸，這些脂肪酸被乳腺轉(zhuǎn)化生成乳脂，其幾乎都是甘油三酯。脂蛋白脂肪酶（）可以將甘油三酯進(jìn)行水解，所生成的產(chǎn)物是脂肪酸，這是機(jī)體能量的一個(gè)重要來源。泌乳初期脂蛋白脂肪酶的表達(dá)顯著增加。其他與脂類合成相關(guān)的基因也在泌乳初期發(fā)生了顯著變化，包括等。

3.2 泌乳性狀相關(guān)候選基因的分析 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2（）是一種生物體內(nèi)極其重要的酶。作為甘油?；D(zhuǎn)移酶的作用是催化二酰甘油與脂肪酸?；磻?yīng)產(chǎn)生三酰甘油?；蛟趧游镏敬x旺盛的組織中表達(dá)水平很高，說明其與脂肪代謝及脂類沉積關(guān)系密切。鄢勝飛等在摩拉水牛基因上發(fā)現(xiàn)了9個(gè)SNPs 位點(diǎn)，并表明這些位點(diǎn)可能對摩拉水牛的生長性狀和乳脂性狀有著重要影響。郭將等通過PCRRFLP 技術(shù)檢測草原紅?；虻倪z傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)AA 型個(gè)體乳中所含有的脂肪和干物質(zhì)顯著高于AB型和BB 型。趙國麗等對中國荷斯坦奶?；虻? 外顯子進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)81 bp（G/A）、474 bp（C/G）、621 bp（C/T）位點(diǎn)對305 d 的產(chǎn)奶量均有顯著影響。目前現(xiàn)有報(bào)道中，多數(shù)是作為普通牛泌乳性狀的基因，因此可以在牦牛上做進(jìn)一步研究。

脂肪酸合成酶（）是一種酶，對脂肪酸合成有關(guān)鍵意義，在脂肪酸的形成中發(fā)揮重要作用。王小龍研究發(fā)現(xiàn)FASN 第34 外顯子的2 種基因型對乳脂率有著顯著的影響。賀一博等應(yīng)用RFLP-PCR 技術(shù)對中國荷斯坦奶牛進(jìn)行多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)基因存在一個(gè)突變位點(diǎn)g.51403203C>T（7 833 bp），而且該處存在不同基因型，參與調(diào)控奶牛乳脂的合成和代謝。馬彥男等利用PCR-SSCP 技術(shù)對中國荷斯坦奶?；蛲怙@子34 進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)等位基因，其中，AA 型個(gè)體305 d 時(shí)的乳脂含量顯著高于AB 型個(gè)體，所以該基因在提高乳脂率方面具有重要意義。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，基因在泌乳過程中表達(dá)，尤其是在ELP，其表達(dá)量對比DLP 上調(diào)顯著。

誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡FF45 樣效應(yīng)因子C（），于1992 年在小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。激素敏感性脂肪酶（）是一種脂肪分解的限速酶，而直接作用于脂滴，影響HSL 在脂滴表面的所在位點(diǎn)，使脂質(zhì)的分解速率顯著降低甚至抑制其分解，最終使得脂質(zhì)大量積累。有研究表明，如果在泌乳期分泌的乳汁品質(zhì)高，其乳腺組織中的表達(dá)量較其他階段是最高的，反之亦然。而且跟干奶期乳腺組織相比，泌乳初期乳腺組織中的表達(dá)量升高極顯著。在本研究中經(jīng)差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，DLP的表達(dá)量較ELP 下調(diào)了6.6 倍，所以基因的差異表達(dá)可能與牦牛乳汁中乳脂的合成有關(guān)，其可能在牦牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳脂的過程中有著不容忽視的作用。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明本研究篩選出的差異表達(dá)基因與牦牛泌乳相關(guān)，也為篩選新的與牦牛泌乳相關(guān)的基因提供了參考。

3.3 PI3K-AKT 信號通路在泌乳過程中的作用 PI3KAKT 的下游靶點(diǎn)是mTOR（即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白），即PI3K-AKT 是mTOR 的上游信號因子，所以mTOR 在調(diào)節(jié)乳蛋白的合成，特別是在翻譯過程中起著關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究表明，AKT-mTOR 信號通路是乳蛋白的重要信號通路，從基因表達(dá)以及蛋白質(zhì)合成2 方面對乳汁的合成與分泌進(jìn)行調(diào)控。趙萌曾報(bào)道PI3K-AKT 信號通路與JAK-STAT 信號通路、MAPK 信號通路相互作用，這些信號途徑在調(diào)控乳成分的合成和分泌等生物過程發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明有700多個(gè)與泌乳曲線變化一致的基因顯著富集在PI3K-AKT信號通路，其中，87個(gè)泌乳上升階段的差異基因和7個(gè)泌乳下降過程的DEGs 富集在此信號通路中，因此，推測PI3K-AKT 信號通路可能在牦牛泌乳過程中有著不可忽視的作用。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用RNA-Seq 技術(shù)對不同泌乳期牦牛乳腺組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，共檢測出3 812個(gè)DEGs，其中2 907個(gè)表達(dá)上調(diào)，905個(gè)表達(dá)下調(diào)，并對這些DEGs進(jìn)行了相關(guān)功能分析。其中，GO 分析顯示富集最豐富的條目與物質(zhì)代謝、化學(xué)反應(yīng)等相關(guān)；KEGG 分析表明DEGs 主要富集在味覺傳導(dǎo)、ECM 受體相互作用、卵巢類固醇生成。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解不同泌乳期牦牛乳腺組織的泌乳機(jī)制及牦牛泌乳的特殊性提供分子基礎(chǔ)。