藏藥長(zhǎng)葉綠絨蒿中5種金屬元素的初級(jí)形態(tài)分析及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

郭昱嬌，林 杰，郭俊明

（1.昆明市生態(tài)環(huán)境局五華分局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，昆明 650031；2.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650500）

綠絨蒿是罌粟科綠絨蒿屬植物，學(xué)名為，藏名為烏巴拉色爾布，分布于云南、四川、西藏、甘肅等海拔較高的寒冷地區(qū)。綠絨蒿可分為歐貝、刺兒恩、木窮典云和阿夏擇哦四類(lèi)。其中，歐貝是多種綠絨蒿的總稱(chēng)，為常用藏藥，主要來(lái)源于五脈綠絨蒿（Regel，花淡紫色）、長(zhǎng)葉綠絨蒿（，花紫色）、毛瓣綠絨蒿（Prain，花淡紫紅色）的全草，云南省香格里拉市多為長(zhǎng)葉綠絨蒿。綠絨蒿全草含氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、鞣質(zhì)和生物堿等，性味苦、澀、寒、小毒，功能主治有清熱利濕、止咳、濕熱黃疸、水腫、創(chuàng)傷久不愈合等，同時(shí)其含有多種微量元素。

微量元素主要與植物體內(nèi)有機(jī)物形成配合物，成為各種酶活性中心，增強(qiáng)其療效。人們通常以湯劑、針劑、浸膏、粉劑等形式服用中草藥，其中湯劑（煎劑或水提取液）是主要的傳統(tǒng)服用形式。周天澤將煎劑中微量元素的存在形態(tài)分為六態(tài)：溶解態(tài)和非溶解態(tài)、膠態(tài)和非膠態(tài)、有機(jī)態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài)、離子態(tài)和非離子態(tài)、絡(luò)合態(tài)和非絡(luò)合態(tài)、價(jià)態(tài)。因此，微量元素不同形態(tài)配合物的不同親脂性和生物活性是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵。按照藥理學(xué)藥物鑒定中評(píng)價(jià)有機(jī)藥物親脂性及生物活性的方法，采用正辛醇-水萃取體系中微量元素的含量比K評(píng)價(jià)微量元素在人體腸、胃的溶出分布或吸收情況。此外，微量元素的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)也是中藥用藥安全的重要指標(biāo)。目前，藏藥綠絨蒿的研究主要涉及資源、形態(tài)組織學(xué)、有機(jī)化學(xué)成分、藥理活性、臨床應(yīng)用等方面，未涉及綠絨蒿中金屬元素的形態(tài)分析及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

本文采用火焰原子吸收光譜法（FAAS）測(cè)定分析云南香格里拉長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥、煎劑、正辛醇-水萃取體系等的Fe、Cr、Zn、Cu和Pb含量，研究金屬元素的形態(tài)分布，采用目標(biāo)危害商值（）評(píng)價(jià)金屬元素對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)，為進(jìn)一步研究其金屬元素的作用以及探討長(zhǎng)葉綠絨蒿的治療機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

主要儀器有兩種，一是AA-6300原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司），二是Cu、Zn、Fe、Cr和Pb空心陰極燈（北京有色金屬研究院）。

主要試劑是1 000 μg/mL Zn、Cu、Fe、Pb和Cr標(biāo)準(zhǔn)溶液（國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心制），使用時(shí)用1% HNO分別稀釋成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液；化學(xué)試劑為優(yōu)級(jí)純或分析純；試驗(yàn)用水為高純水。藏藥長(zhǎng)葉綠絨蒿購(gòu)買(mǎi)于云南省香格里拉市迪慶州藏醫(yī)院，為干全草。

1.2 火焰原子吸收光譜法工作條件

根據(jù)表1的工作條件，測(cè)定稀釋后標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素的吸光度，繪制工作曲線(xiàn)。線(xiàn)性回歸方程與相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表1 火焰原子吸收光譜法工作條件

表2 線(xiàn)性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

1.3 形態(tài)分析

1.3.1 長(zhǎng)葉綠絨蒿預(yù)處理

取一定量的長(zhǎng)葉綠絨蒿干全草，用自來(lái)水快速?zèng)_洗去除泥土后，再用高純水清洗2～3次。晾干水分后，將其放于瓷托盤(pán)中，在65 ℃的鼓風(fēng)干燥烘箱干燥6 h。冷至室溫后，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎，得粉狀綠絨蒿原藥。將原藥裝入自封塑料袋，在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 長(zhǎng)葉綠絨蒿中金屬元素總含量測(cè)定

將0.500 0 g粉狀長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥置于50 mL燒杯中，加10 mL濃硝酸浸泡至少12 h，之后加濃高氯酸2.5 mL，放于電熱板上加熱消解，至溶液透明，繼續(xù)小心加熱，剩余1～2 mL液體。冷卻后，用少量1%硝酸溶液稀釋、洗滌，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，平行做空白試樣，按照小節(jié)1.2的條件測(cè)定Zn、Cu、Fe、Pb和Cr金屬元素的含量。

1.3.3 長(zhǎng)葉綠絨蒿中金屬元素水煎提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.000 0 g粉狀長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥置于500 mL燒杯中，加高純水200 mL，室溫下靜置30 min后加熱至沸，調(diào)節(jié)電熱板溫度，保持微沸30 min，關(guān)閉電源，靜置稍冷，用中藥過(guò)濾袋濾擰，每次用20～25 mL熱高純水洗濾殘?jiān)貜?fù)2～3遍，得到第一次水煎液（A液）和殘?jiān)瑢液濃縮至約50 mL，冷后用1%硝酸溶液定容至100 mL。在藥渣中加入150 mL高純水，重復(fù)以上步驟，得到第二次水煎液（B液）。采用同樣方法處理，得到第三次水煎液（C液）和最終殘?jiān)?。取A液、B液和C液各10 mL分別放于50 mL燒杯中，各加入10 mL濃HNO放置過(guò)夜，然后加入2.5 mL高氯酸消解，消解步驟與小節(jié)1.3.2相同，并分別用50 mL容量瓶定容，測(cè)定各元素含量。同時(shí)，要進(jìn)行空白處理。

1.3.4 制備可溶態(tài)測(cè)定液

分別準(zhǔn)確量取長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥水煎A液、B液和C液各10 mL，置于50 mL燒杯中混勻，高速離心2 h，上清液用0.45 μm濾膜過(guò)濾，棄濾渣，濾液平均分成3份，濾液為可溶態(tài)。分別將濾液按照小節(jié)1.3.2方法消解后，用25 mL容量瓶定容，測(cè)定各元素含量，取平均值。同時(shí)，平行做空白試樣。

1.3.5 制備模擬人工胃、腸提取測(cè)定液

取水煎A液、B液和C液各5 mL，移入50 mL燒杯中混勻，均分為2份，用稀HCl和稀NaOH溶液分別調(diào)節(jié)為pH=1.3（模擬胃液的酸度）和pH=7.6（模擬腸液的酸度）。靜置8 h后，將其分別轉(zhuǎn)入分液漏斗，各加入正辛醇5 mL，振蕩萃取0.5 h，靜置分層0.5 h，收集水相并重復(fù)萃取2次，水相分別為模擬胃水溶態(tài)和模擬腸水溶態(tài)。將各水相蒸發(fā)至近干，按照小節(jié)1.3.2方法消解、定容為25 mL，測(cè)定其中5種元素含量，胃（或腸）醇溶態(tài)中元素含量為總水煎液中元素含量與胃（或腸）水溶態(tài)元素含量之差。平行3組試樣，同時(shí)平行做空白試樣。

1.4 非致癌重金屬健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型

藏藥長(zhǎng)葉綠絨蒿中Fe、Zn、Cr、Cu和Pb 5種金屬元素為非致癌毒性元素。根據(jù)美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（USEPA）創(chuàng)建的非致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法，評(píng)價(jià)長(zhǎng)期服用單一金屬元素的健康風(fēng)險(xiǎn)（THQ），其計(jì)算公式為：

式中：c為長(zhǎng)葉綠絨蒿中金屬元素的含量，mg/kg；為人群暴露頻率，d/a；為暴露時(shí)間，a；為長(zhǎng)期服用長(zhǎng)葉綠絨蒿患者的日攝入量，g/（人·d）；為成年人的平均體重，kg；為非致癌風(fēng)險(xiǎn)平均暴露時(shí)間，d；為金屬元素每日允許攝取最大量，mg/（kg·d）。

若THQ＜l，則表明無(wú)明顯的健康風(fēng)險(xiǎn)，反之，則說(shuō)明有健康風(fēng)險(xiǎn)。

同時(shí)存在多種金屬元素時(shí)，其復(fù)合健康風(fēng)險(xiǎn)（）用式（2）評(píng)價(jià)。

多元素復(fù)合健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：＜1表示無(wú)非致癌風(fēng)險(xiǎn)，≥1表示有非致癌風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬元素的形態(tài)分析

長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥、水煎液和模擬人工胃、腸提取液等的Fe、Zn、Cr、Cu和Pb元素測(cè)定結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥中5種金屬元素含量差別較大，F(xiàn)e含量最多，Zn和Cu含量較高，Pb含量最少，F(xiàn)e含量是Pb含量的240倍，5種元素含量順序?yàn)镕e＞Zn＞Cu＞Cr＞Pb，表明長(zhǎng)葉綠絨蒿是富含F(xiàn)e、Zn和Cu藥用植物，有害元素Pb含量低。長(zhǎng)葉綠絨蒿中Pb、Cu含量均低于《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版，一部）中規(guī)定的限量，即Pb≤5 mg/kg，Cu≤20 mg/kg，但長(zhǎng)葉綠絨蒿中Cu含量與Cu限量很接近。研究結(jié)果與楊若明等測(cè)定的四川藏草藥毛瓣綠絨篙中金屬元素含量大小有較大差別，這與不同地區(qū)土壤中相關(guān)元素含量不同有關(guān)。但同云南長(zhǎng)葉綠絨蒿一樣，毛瓣綠絨蒿中Fe、Zn和Cu元素含量較高，Cr含量較低，說(shuō)明綠絨蒿類(lèi)植物易富集Fe、Zn和Cu元素；從水煎液中各金屬元素含量來(lái)看，隨著水煎次數(shù)的增加，水煎液中金屬元素含量降低，總水煎提取液的金屬元素含量均比原藥的低，表明通過(guò)水煎藥物，只能部分利用長(zhǎng)葉綠絨蒿中的部分元素；長(zhǎng)葉綠絨蒿可溶態(tài)中各金屬元素含量均比總水煎液的低得多；從模擬人工胃、腸提取的水溶液各金屬元素含量來(lái)看，除Pb外，其都比胃、腸醇溶態(tài)中金屬元素含量低得多，表明Fe、Zn、Cu和Cr相對(duì)易被人體吸收，而對(duì)于有害元素Pb，人體本身可能具有排斥性。

表3 長(zhǎng)葉綠絨蒿中5種金屬元素形態(tài)分析結(jié)果

從不同元素的醇溶態(tài)元素含量與水溶態(tài)元素含量比值K來(lái)看，K值差別較大。從胃酸度來(lái)看，F(xiàn)e、Zn、Cu和Cr的K值都較大，其中Fe的K值最大，Pb的K值最小，Zn、Cu和Cr的K值相差不大，其中Fe的是Zn的5倍多。這說(shuō)明Fe、Zn、Cu和Cr在胃部吸收較多，而Pb在胃部幾乎不吸收。從腸酸度來(lái)看，F(xiàn)e、Cu和Cr的K值較大，其中Cu的最大，Cr次之，而Zn、Pb的K值很小，說(shuō)明Fe、Cu和Cr在腸部易吸收，而Zn、Pb吸收很少。由此可以看出，pH對(duì)Zn吸收有較大影響。總之，Zn主要在胃部吸收，F(xiàn)e、Cu和Cr則在胃、腸部均可吸收，而Pb在胃、腸部均吸收少，該結(jié)果為長(zhǎng)葉綠絨蒿治療相關(guān)疾病時(shí)選擇作用靶點(diǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2 形態(tài)分析參數(shù)

為了進(jìn)一步了解藏藥長(zhǎng)葉綠絨蒿中金屬元素的初級(jí)形態(tài)分布，根據(jù)長(zhǎng)葉綠絨蒿各形態(tài)分析測(cè)定結(jié)果，按照相關(guān)研究方法計(jì)算形態(tài)分析參數(shù)，結(jié)果如表4所示。主要參數(shù)有水提取率（，每次水煎液元素含量與原藥元素含量之比）、水提殘留率（）、總水提浸留比（，總水煎液中元素含量與最后一次水提殘留量元素含量之比）、溶解率（，可溶態(tài)元素含量與原藥元素含量之比）和顆粒吸附率（，總水煎液與可溶態(tài)中元素含量之差同原藥相應(yīng)元素含量之比）。其中，水提取率（）表示實(shí)際的服用部分，是制定提取工藝的重要依據(jù)，而總水提浸留比（）則為該元素發(fā)揮作用的標(biāo)度，越大表明該元素在藥中的作用越大。

從表4可以看出，長(zhǎng)葉綠絨蒿第一次水煎提取液中元素最多，隨著水煎提取次數(shù)的增加，元素提取率均呈下降趨勢(shì)，但Cr的三次提取率均較大，Cr總提取率達(dá)到82.04%，說(shuō)明含Cr物質(zhì)在水中的溶解性較大。雖然Fe在原藥中的含量達(dá)到242.68 μg/g，但總提取率最低（10.90%），表明含F(xiàn)e物質(zhì)在水中的溶解性很差。Zn、Cu和Pb的總提取率均保持在22.08%～26.73%，相差不大。根據(jù)提取率大小可判斷，長(zhǎng)葉綠絨蒿中的Cr元素受熱易溶出，主要以無(wú)機(jī)離子型或親水性有機(jī)物形態(tài)存在；Fe用水煎方法難溶出，主要以疏水性有機(jī)物形態(tài)存在，Zn、Cr和Pb也主要以疏水性有機(jī)物形態(tài)存在。因此，元素水煎提取率的高低是確定中藥劑量或考察其毒性的重要依據(jù)。

從表4水提殘留率可知，除Cr元素殘留較小外，殘?jiān)衅渌饘僭睾窟h(yuǎn)高于水煎液中的含量，主要原因是殘?jiān)w維吸附使這些成分不易進(jìn)入水相；從總水提浸留比來(lái)看，長(zhǎng)葉綠絨蒿中微量元素Cr最大，說(shuō)明Cr是該藥中發(fā)揮藥效作用最大的元素，Zn、Cu和Pb相差不大，最小的是Fe元素；各金屬元素懸浮態(tài)顆粒吸附率差別較大，其中Cr的最大，F(xiàn)e的最小，Pb約為Fe的2倍，Zn和Cu也較小，但相差不大，說(shuō)明含Cr物質(zhì)易被吸附，F(xiàn)e和Pb不易被吸附。

表4 長(zhǎng)葉綠絨蒿中金屬元素形態(tài)分析參數(shù)

2.3 Kow值及酸度變化對(duì)元素形態(tài)分布的影響

分別以各元素的正辛醇相平衡濃度與水相平衡濃度比值K評(píng)價(jià)其親脂性及生物活性，進(jìn)而評(píng)價(jià)金屬元素在胃、腸中的吸收情況。結(jié)果如表3所示。

從表3可見(jiàn)，pH=1.3胃酸度和pH=7.6腸酸度環(huán)境會(huì)影響金屬元素形態(tài)分布，所測(cè)長(zhǎng)葉綠絨蒿中5種元素在胃酸度條件下的K均大于腸酸度條件下的K，表明這5種元素在胃部的吸收可能較多，而在腸部的吸收相對(duì)較少，也就是說(shuō)，在胃環(huán)境中其生物活性較高，有利于參與人體代謝過(guò)程。但pH對(duì)有害Pb元素的K影響小，說(shuō)明胃和腸吸收都較少，原因可能是人體本身就有排斥反應(yīng)。

2.4 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果

按照《中華本草》的綠絨蒿用法用量，每日內(nèi)服（煎湯）3～6 g，將該用量的平均值（4.5 g）作為成年人長(zhǎng)期服用的日攝入量（）。按照相關(guān)研究，式（1）中、、和分別取90 d/a、30 a、60 kg和10 950 d（按30 a計(jì)）。對(duì)于金屬元素每日允許攝取最大量（），按照聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）規(guī)定的每周可耐受攝入量，Zn、Cu、Cr和Pb的值分別為30.00 mg/（kg·d）、4.00×10mg/（kg·d）、1.50 mg/（kg·d）和3.50×10mg/（kg·d）。按照《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（簡(jiǎn)要本）》中金屬元素可耐受最高攝入量（），F(xiàn)e的值取50 mg/（kg·d）。非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果如表5所示。

從表5健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，無(wú)論是單一金屬元素還是多種金屬元素，其或均遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明每日通過(guò)原藥、總水煎液、可溶態(tài)的形式服用長(zhǎng)葉綠絨蒿均無(wú)非致癌風(fēng)險(xiǎn)，在胃醇溶態(tài)、腸醇溶態(tài)中元素的吸收也不會(huì)有非致癌風(fēng)險(xiǎn)。在5種金屬元素中，Cu和Pb對(duì)的貢獻(xiàn)率較大，而Fe和Zn對(duì)的貢獻(xiàn)率較小。

表5 長(zhǎng)葉綠絨蒿中5種金屬元素的THQ、HI

3 結(jié)論

本文采用濕法消解處理藏藥長(zhǎng)葉綠絨蒿，運(yùn)用火焰原子吸收光譜法檢測(cè)Fe、Zn、Cr、Cu和Pb 5種元素，5種元素在原藥中的含量有較大差異，其順序?yàn)镕e＞Zn＞Cu＞Cr＞Pb。其中，F(xiàn)e含量最多，Pb含量最少，F(xiàn)e含量是Pb含量的240倍，Zn、Cu含量也較高。這表明長(zhǎng)葉綠絨蒿是富含F(xiàn)e、Zn、Cu藥用植物，有害元素Pb含量低。Fe的總水煎提取率最低（10.90%），Zn、Cu和Pb的總提取率均保持在22.08%～26.73%，相差不大，Cr總提取率最高（82.18%）；微量元素Cr的總水提浸留比最大，它是此藥中作用最大的元素，Zn、Cu和Pb相差不大，F(xiàn)e元素的總水提浸留比最小。Zn主要在胃部吸收，F(xiàn)e、Cu和Cr則在胃、腸部均可吸收，Pb在胃、腸部吸收都較少；pH對(duì)Zn吸收影響較大，對(duì)Pb吸收影響較小。5種金屬元素在長(zhǎng)葉綠絨蒿原藥、總水煎液、可溶態(tài)、胃醇溶態(tài)、腸醇溶態(tài)等中的或均遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明長(zhǎng)期服用長(zhǎng)葉綠絨蒿均無(wú)非致癌風(fēng)險(xiǎn)。在5種金屬元素中，Cu和Pb對(duì)的貢獻(xiàn)率較大，是主要的風(fēng)險(xiǎn)元素。