大豆根際土壤產(chǎn)ACC脫氨酶細(xì)菌的分離與鑒定

黃天姿 李同祥 湯薇 孫會剛 王繼良

摘 要 為篩選能產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基（ACC）脫氨酶的大豆植物根際細(xì)菌，從大豆根際土壤中分離得到10株大豆根際細(xì)菌，其中5株在DF和ADF培養(yǎng)基中能以ACC作為唯一氮源生長。通過16S rDNA測序及生理生化實驗證實，H1為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），H9為芽孢桿菌（Bacillus sp.），H10為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。ACC脫氨酶活力測定數(shù)據(jù)表明，芽孢桿菌（Bacillus sp.）的ACC脫氨酶活性最大，為0.097 8 U·mg-1。

關(guān)鍵詞 大豆;根際細(xì)菌;ACC脫氨酶;酶活

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.06.001

豆科植物具有十分廣闊的應(yīng)用空間，可將其用作生物飼料、植物肥料和土地覆蓋種植物[1]。豆類農(nóng)作物可生長在世界各地的各種氣候帶、各種地形和各種土壤中[2]。農(nóng)耕土壤中，尤其是作物根際土壤，存在著豐富的、生理活動活躍的多種微生物群落。這些微生物可與植物根系相互作用，影響植物的代謝，其中一類可促進(jìn)植物生長的根際細(xì)菌統(tǒng)稱為植物根際促生細(xì)菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR）[3]。在PGPR中，部分細(xì)菌能夠利用其自身產(chǎn)生的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基（ACC）脫氨酶，降低宿主植物根系和植物體內(nèi)的ACC水平并減少乙烯的產(chǎn)生，進(jìn)而減弱由乙烯介導(dǎo)的對宿主植物生長的抑制作用，削弱逆境脅迫對宿主植物造成的傷害，促進(jìn)宿主植物的生長[4]。因此，可以產(chǎn)生ACC脫氨酶的細(xì)菌備受學(xué)者關(guān)注，并且被認(rèn)為在干旱、鹽堿地、農(nóng)藥污染和重金屬污染等逆境脅迫條件下能有效促進(jìn)宿主植物生長，是具有廣泛應(yīng)用潛力的一類PGPR[5]。

為篩選能產(chǎn)生ACC脫氨酶活性的大豆根際土壤細(xì)菌，通過菌落形態(tài)、生理生化、16S rDNA基因測序，鑒定了分離得到的5株活性菌株，并測定了5個菌株的ACC脫氨酶活性，豐富了大豆根際土壤產(chǎn)ACC脫氨酶的細(xì)菌資源，對進(jìn)一步研究大豆促生的菌種資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆根際土壤（江蘇省食品安全生物芯片檢測技術(shù)工程實驗室所屬實驗田地取樣，土質(zhì)優(yōu)良，大豆長勢較好），保存于實驗室。實驗用LB、TSB、DF及ADF培養(yǎng)基均為市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及純化

精確稱取1 g土壤，無菌水定容至100 mL，混勻備用。大豆土壤液按10倍梯度稀釋至10-8，吸取100 μL稀釋液于LB（TSB）培養(yǎng)基上，涂抹均勻，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);觀察菌落形態(tài)。將上述菌落形態(tài)各不相同的菌株，挑出單菌落，分別劃線于LB培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h。分別劃線并重復(fù)操作3次以上，最終劃線出其單菌落菌株，編號后置于-20 ℃冰箱保藏。

1.2.2 ACC脫氨酶活性菌株的篩選

1）初篩。將分離出的菌株接種于DF、ADF培養(yǎng)基（以ACC作為唯一氮源），37 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察菌株生長狀況。若菌株可以生長，說明成功篩選出可降解ACC菌株，若沒有生長則表明此菌株無ACC活性。

2）ACC脫氨酶活性測定。以每分鐘ACC脫氨酶催化ACC生成1 μmol α-丁酮酸所需的酶量表示ACC脫氨酶單位酶活[6]。通過Bradford比色法測定酶蛋白含量。單位酶活力（U）與總蛋白質(zhì)量（mg）的比值為比活力，表示活性菌株的ACC脫氨酶活性（U·mg-1）。ACC脫氨酶活性計算公式如（1）所示。

（1）

1.2.3 ACC脫氨酶活性菌株的鑒定

1）生理生化鑒定。菌株形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察[7]。

2）16S rDNA鑒定。提取5株ACC酶活性菌株總DNA，16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌的分離和純化

通過細(xì)菌培養(yǎng)基，篩選出10株根際細(xì)菌，編號H1～H10，菌落形態(tài)特征見表1。從表1可以看出，細(xì)菌的形態(tài)大小不盡相同，菌落大多呈圓形、乳黃色，有些菌落表面干燥，有些表面圓滑，分布形式密集與疏散的菌落數(shù)量大體相當(dāng)。

2.2 具有ACC脫氨酶活性菌株篩選

從大豆根際土壤分離出的10株細(xì)菌中，以ACC作為唯一氮源的DF、ADF培養(yǎng)基篩選出5株具有ACC脫氨酶活性的菌株，菌株形態(tài)特征見圖1，ACC脫氨酶活性見表2。從表2數(shù)據(jù)可知，H9的ACC脫氨酶活性最大，H2的最小，H9的活性約為H2的7倍。

2.3 活性菌株的鑒定

5株活性菌株生理生化反應(yīng)結(jié)果如表3所示，基因組鑒定結(jié)果如圖3所示。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列測定，確定H1為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.），H10為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3 結(jié)論與討論

從大豆根際土壤中分離得到10株根際細(xì)菌，從10株菌株中篩選出5株能以ACC作為唯一氮源的細(xì)菌。通過菌落形態(tài)、生理生化及16S rDNA測序得出H1為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），H2為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），H8為貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），H9為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），H10為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）;檢測了這5株細(xì)菌的ACC脫氨酶活力，其中H9的ACC脫氨酶活性最大，為0.097 8 U·mg-1，H2的ACC脫氨酶活性最小，為0.013 3 U·mg-1。

具有ACC脫氨酶活性的微生物已被證明能在一定程度上減輕環(huán)境脅迫對植物的傷害[8]。趙龍飛等在大豆根瘤中篩選出8株具有ACC脫氨酶活性內(nèi)生細(xì)菌，活性最高的菌株（DD132）的酶活為15.712 U·mg-1[9]。和DD132相比，本實驗從大豆根際土壤中分出的5株ACC脫氨酶活性菌株活性低很多（活性最大的H9僅為0.097 8 U·mg-1），可能與菌株的取樣環(huán)境不同有關(guān)（DD132是從大豆根瘤中篩選，而H9存在大豆根際土壤中）。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張培娜.冀西北壩上高原豆科作物固氮培肥效應(yīng)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[2] 牛書麗，蔣高明.豆科植物在中國草原生態(tài)系統(tǒng)中的地位及其生理生態(tài)研究[J].植物學(xué)通報，2004，21（1）：9-18.

[3] 盛浩.旱地小麥根際能產(chǎn)生ACC脫氨酶細(xì)菌多樣性及其接種效應(yīng)的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[4] OROZCO-MOSQUEDA M C，GLICK B R，SANTOYO G.ACC deaminase in plant growth-promoting bacteria（PGPB）：an efficient mechanism to counter salt stress in crops[J].Microbiological Research，2020，235：126439.

[5]JIANG F，CHEN L，BELIMOV A A，et al.Multiple impacts of the plant growth-promoting rhizobacterium Variovorax paradoxus 5C-2 on nutrient and ABA relations of Pisum sativum[J].Journal of Experimental Botany，2012，63（18）：6421-6430.

[6] 龔鳳娟.具有ACC脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌及根際細(xì)菌的分離鑒定及其植物促生作用[D].吉首：吉首大學(xué)，2012.

[7] 布坎南，杰本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》編譯組，譯.北京：科學(xué)出版社，1984：729-795.

[8] 王琪媛，王甲辰，葉磊，等.含ACC脫氨酶的根際細(xì)菌提高植物抗鹽性的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2021，37（2）：174-186.

[9] 趙龍飛，徐亞軍，常佳麗，等.具ACC脫氨酶活性大豆根瘤內(nèi)生菌的篩選、抗性及促生作用[J].微生物學(xué)報，2016，56（6）：1009-1021.

（責(zé)任編輯：劉寧寧）