精子DNA損傷對胚胎卵裂模式及胚胎發(fā)育的影響

朱家紅，高洋，付濤，鄒佳益，魏彪，韓偉，2，黃國寧，2*

(1.重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，重慶 400013；2.人類胚胎工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400013)

精液質(zhì)量是影響輔助生殖治療結(jié)局(包括受精率、胚胎質(zhì)量及臨床結(jié)局)的重要因素，這種影響泛稱為“父系效應(yīng)”[1]。傳統(tǒng)的精液分析包括精子濃度、體積、活力及形態(tài)學(xué)分析。DNA損傷的精子可正常存活且形態(tài)正常，并能使卵母細(xì)胞受精，因此常規(guī)的精液分析不能準(zhǔn)確反應(yīng)精子DNA的完整性及其對胚胎質(zhì)量、臨床結(jié)局產(chǎn)生的影響。隨著男性不育癥的病因及機(jī)制研究逐漸深入，精子DNA完整性作為一個關(guān)鍵參數(shù)，為不育癥患者的病因診斷提供了新的依據(jù)。目前關(guān)于IVF/ICSI周期中精子DNA碎片對胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局影響的研究較多，但結(jié)論仍存在爭議[2-3]，因此在臨床實(shí)踐中并未常規(guī)評估精子DNA完整性，其可能原因是精子DNA碎片檢測方法多樣，不同方法得到的精子DNA碎片指數(shù)(DFI)的正常參考值范圍不一，且研究的人群臨床條件不一。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)是量化精子DNA碎片水平、檢查精子DNA損傷的常用方法之一。

隨著時(shí)差培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，其不僅可對植入前胚胎進(jìn)行持續(xù)觀察且無需取出培養(yǎng)箱，并可連續(xù)提供胚胎發(fā)育各階段的詳細(xì)定量參數(shù)及觀察胚胎的卵裂模式。胚胎的早期卵裂在胚胎發(fā)育中具有重要作用，異常卵裂會影響囊胚形成率、胚胎染色體倍性及種植潛力[4-5]。目前植入前胚胎卵裂模式是否會受到精子DNA損傷的影響仍然未知。本研究通過時(shí)差培養(yǎng)系統(tǒng)觀察記錄胚胎卵裂模式、胚胎發(fā)育情況，隨訪胚胎移植后的種植結(jié)局，分析精子DNA損傷對胚胎早期卵裂模式、胚胎發(fā)育及種植的影響。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2020年1月至2021年6月于重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心接受不孕不育癥治療的432對不孕不育夫婦的臨床資料，共432個取卵周期(其中224個周期行新鮮卵裂期胚胎移植)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡<35歲；(2)女方卵巢反應(yīng)正常；(3)夫妻雙方染色體檢查正常；(4)男方進(jìn)行DFI檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除供精、冷凍精液、受卵、解凍卵子及植入前遺傳學(xué)診斷(PGT)周期。

將納入患者根據(jù)授精方式不同分為IVF組和ICSI組，每組又按照DFI不同分為DFI<15%和DFI≥15%亞組，即：ICSI DFI<15%組(83例)，ICSI DFI≥15%組(105例)；IVF DFI<15%組(153例)，IVF DFI≥15%組(91例)。

二、研究方法

1.精液常規(guī)分析及精子DFI檢測：(1)精液常規(guī)分析：男方禁欲2～7 d后于本院男科取精室手淫取精，工作人員確認(rèn)標(biāo)本完整性、待液化后根據(jù)WHO人類精液實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(第5版)進(jìn)行精子質(zhì)量分析。(2)精子DFI檢測：采用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)方法進(jìn)行精子DFI檢測。通過流式細(xì)胞儀，分析精子核DNA的完整性。

2.控制性促排卵和人工授精：根據(jù)女方卵巢反應(yīng)情況采用個性化的控制性卵巢刺激方案，包括促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑方案或GnRH拮抗劑方案。當(dāng)超聲測量有至少3個卵泡直徑≥18 mm時(shí)，給予HCG注射。HCG注射后36 h超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。取卵當(dāng)日收集新鮮精液，密度梯度離心后制備精液樣本，于卵母細(xì)胞取出2～4 h后行常規(guī)IVF或ICSI授精，IVF授精濃度約為1萬條精子/50 μl微滴。

3.Time-lapse胚胎培養(yǎng)及卵裂模式觀察：進(jìn)行原核觀察后，將正常受精的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入時(shí)差培養(yǎng)箱培養(yǎng)，通過Embryo Viewer軟件對受精后第3天的胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分并記錄胚胎是否為正常卵裂模式。正常卵裂模式定義為在第1次細(xì)胞質(zhì)分裂時(shí)卵裂成兩個大小相同的不同卵裂球，第2次卵裂時(shí)兩個卵裂球分別卵裂成兩個大小相同的卵裂球[6]。

根據(jù)患者的宮腔條件及胚胎情況制定個體化的移植、冷凍或囊胚培養(yǎng)方案，剩余胚胎將繼續(xù)培養(yǎng)至受精后第5天或第6天。

4.主要觀察指標(biāo)及定義：分別統(tǒng)計(jì)ICSI或IVF周期中的正常受精率、囊胚形成率、正常卵裂模式胚胎率以及臨床妊娠率和流產(chǎn)率。IVF周期中2PN受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/IVF加精卵子總數(shù)×100%；ICSI周期中2PN受精率=D1出現(xiàn)2PN卵子數(shù)/ICSI注射卵子總數(shù)×100%；正常卵裂模式胚胎率=正常卵裂模式胚胎數(shù)/2PN卵裂胚胎數(shù)×100%；囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；臨床流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組男性患者精液參數(shù)比較

ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間平均DFI、精子總活力和濃度均有顯著性差異(P<0.05)；各組間男方年齡和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組男性患者一般資料及精液參數(shù)比較(-±s)

二、各組中女性患者基本資料比較

ICSI和IVF周期中，DFI<15%和DFI≥15%亞組間的女方年齡、BMI、促排卵次數(shù)、抗苗勒管激素(AMH)、FSH、LH水平及促排卵過程中Gn用量和天數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組女性患者基本資料比較(-±s)

三、各組患者胚胎發(fā)育情況比較

在胚胎發(fā)育方面，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間的獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精率、D3可用胚胎數(shù)、正常卵裂模式胚胎率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均無顯著性差異(P>0.05)，僅囊胚形成率在不同DFI亞組間有顯著性差異(P<0.05)(表3)。

表3 各組患者胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，%]

四、各組的妊娠結(jié)局比較

對224個鮮胚移植周期的妊娠結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，ICSI和IVF周期中DFI<15%和DFI≥15%亞組間平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及正常卵裂模式胚胎數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，臨床妊娠率、種植率和流產(chǎn)率亦無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 各組妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

五、相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)性分析探討精子DFI與正常卵裂模式胚胎率及囊胚形成率之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示DFI與正常卵裂模式胚胎率無顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與囊胚形成率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.562，P=0.029)。

討 論

精子DNA損傷的原因包括：高水平氧化應(yīng)激及精漿中抗氧化劑應(yīng)對不足；精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組織不良，使精子更容易受到氧化應(yīng)激介導(dǎo)的損傷；藥物、熱、輻射等[7]。由于精子本身不能修復(fù)DNA損傷，其損傷永久存在。臨床工作中常通過分析精子的濃度、活力以及形態(tài)來反映精子的質(zhì)量，有研究表明精子的活力和形態(tài)與精子DNA的完整性密切相關(guān)，精子DNA損傷會對男性的生育能力產(chǎn)生影響[8]。本研究結(jié)果與之前文獻(xiàn)[9]報(bào)道的相似，認(rèn)為DFI可從分子水平上反映男性的生育能力，高DFI與精子濃度和活力下降相關(guān)。

2014年Simon等[10]的研究表明精子DNA損傷會對植入前胚胎產(chǎn)生父系影響，精子DNA損傷增加將會從受精開始對胚胎產(chǎn)生不利影響，并持續(xù)到胚胎移植后，導(dǎo)致種植率和妊娠率均顯著降低。父系效應(yīng)對植入前胚胎的影響可在受精后第1個細(xì)胞周期檢測到，如產(chǎn)生高比例的異常受精胚胎，且傾向于緩慢卵裂和異常卵裂[11]。Anbari等[12]研究報(bào)道在IVF周期中胚胎卵裂模式與精子DFI水平無顯著相關(guān)性(P>0.05)。本研究結(jié)果亦提示，ICSI周期和IVF周期中DFI≥15%和DFI<15%的兩組患者的正常卵裂模式胚胎率無顯著性差異(P>0.05)，提示胚胎的卵裂模式不受精子DFI水平高低的影響，或者可能是因?yàn)槁涯讣?xì)胞修復(fù)了部分精子DNA損傷的結(jié)果。目前對于卵母細(xì)胞修復(fù)精子DNA損傷的機(jī)制還不清楚，精子中心體對于有絲分裂紡錘體的影響可能是影響卵裂的潛在原因[13]。

有文獻(xiàn)報(bào)道高精子DFI與低囊胚形成率相關(guān)[14]，也與胚胎發(fā)育停滯相關(guān)[15]。本研究結(jié)果提示囊胚形成率降低與高水平的精子DNA損傷有關(guān)。雖然父系對胚胎發(fā)育的影響可能在受精后就存在，但隨著合子基因組激活，父系對受損染色質(zhì)的影響逐漸突出。但盡管DFI≥15%組的囊胚形成率下降，最終所得的優(yōu)質(zhì)囊胚率并無顯著性差異(P>0.05)。人類和動物模型證據(jù)均表明，在胚胎發(fā)育過程中早期胚胎有能力通過激活母體驅(qū)動機(jī)制修復(fù)精子內(nèi)的DNA損傷，然而這種能力有限，其可能存在一個閾值，超過這個閾值，將無法修復(fù)；且該修復(fù)能力與卵母細(xì)胞的質(zhì)量有關(guān)[16]。

本研究中，我們優(yōu)先選擇卵裂模式正常且相對優(yōu)質(zhì)的胚胎移植，觀察精子DFI水平對種植率和流產(chǎn)率的影響，結(jié)果提示無論是ICSI授精還是常規(guī)IVF授精，DFI<15%組與DFI≥15%組間的2PN受精率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)，與Green等[17]的報(bào)道一致。但也有文獻(xiàn)報(bào)道精子DFI水平高低對胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率無明顯影響，與流產(chǎn)率則呈顯著相關(guān)(P<0.05)，精子DFI越高，流產(chǎn)率越高[2]。這可能與卵母細(xì)胞或胚胎的修復(fù)能力不同，以及移植胚胎質(zhì)量的不同有關(guān)，Green等[17]的研究中移植的均是染色體正常的胚胎，本研究中移植的胚胎則經(jīng)過了卵裂模式的篩選。Zhao等[18]報(bào)道高精子DFI的患者IVF周期妊娠率顯著下降，ICSI周期的妊娠率未受影響，認(rèn)為ICSI授精可以避免精子受到氧化應(yīng)激的影響，減少精子DNA損傷。但也有學(xué)者認(rèn)為高精子DFI對IVF周期的正常受精率和胚胎質(zhì)量沒有明顯影響，這可能與IVF授精方式更接近自然受精，按照優(yōu)勝劣汰原則自動篩除了高DFI的精子有關(guān)[19]。2017年和2021年的兩項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示隨著精子DFI升高，IVF或ICSI周期的妊娠率呈下降趨勢，但平衡研究條件后精子DFI水平的高低對IVF/ICSI妊娠結(jié)局的影響無明顯差異[20-21]。盡管精子DFI水平高低與男性的精液質(zhì)量相關(guān)，但由于檢測方法、研究人群以及設(shè)定閾值的差異，其對輔助生殖治療過程中胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響尚無統(tǒng)一定論。且本研究納入樣本量較小，研究結(jié)論存在一定的局限性，后續(xù)需要設(shè)計(jì)良好的大樣本量隨機(jī)對照試驗(yàn)進(jìn)一步加以探討。

綜上所述，本研究結(jié)果提示精子DFI高低與男性的精子濃度和活力相關(guān)；胚胎的早期卵裂模式可能不會受到精子DFI的影響，而囊胚形成率降低與高DFI顯著相關(guān)。雖然目前精子DFI高低對輔助生殖妊娠結(jié)局的影響尚無定論，但合理進(jìn)行DFI檢測，可能有助于綜合評估助孕治療效果，為不孕不育夫婦提供適宜的治療建議。