遺傳算法結合響應面法優(yōu)化番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的制備

馬永強，譚振洪，黎晨晨，修偉業(yè)，井弘書

遺傳算法結合響應面法優(yōu)化番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的制備

馬永強，譚振洪，黎晨晨，修偉業(yè)，井弘書

（哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，哈爾濱 150076）

提高脂溶性番茄紅素的生物利用率和穩(wěn)定性。采用熔融-高速剪切法制備番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體。以包封率、平均粒徑為主要評價指標，進行單因素實驗，并在單因素基礎上通過遺傳算法結合Box-Behnken響應面法對制備工藝進行優(yōu)化。遺傳算法和Box-Behnken響應面法優(yōu)化得到的理論包封率分別為86.208 2%、86.169 5%。通過驗證實驗得到實際包封率為(86.267±0.44)%，平均粒徑為(121.8±5.20) nm。結果表明遺傳算法結合Box-Behnken響應面法優(yōu)化番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體模型可靠。

番茄紅素；納米結構脂質(zhì)載體；Box-Behnken響應面法；遺傳算法

番茄紅素（Lycopene）是一種廣泛存在于蔬菜和水果中的脂溶性類胡蘿卜素，同時也是一種具有抗氧化性強[1]，可預防心血管疾病[2-4]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾 病[5]、乳腺癌[6]、前列腺增生癥[7]、骨質(zhì)疏松癥[8]、肥胖和糖尿病[9]等常用的食用紅色色素。近年來對番茄紅素的保健食品[10]、化妝品[11]、藥品[12]的研發(fā)日益增多，但是由于番茄紅素的疏水性，不能被人體很好的吸收，導致了番茄紅素在人體內(nèi)的低生物利用率[13]。目前改良脂溶性類胡蘿卜素的遞送系統(tǒng)有乳液、微膠囊、水凝膠、納米結構脂質(zhì)載體等。通過包埋藥物的手段，調(diào)整壁材的親水性，從而實現(xiàn)脂溶性類胡蘿卜素的可受控釋放。由于乳液在很大程度上容易絮凝或聚集成更大的粒子，且需要大量的表面活性劑，存在安全問題?，F(xiàn)階段的微膠囊技術，存在著包埋率低、尺寸大等缺點，新型價格低廉、加工性能好、食用安全的壁材仍有待開發(fā)。水凝膠技術在食品領域的研究甚少。相比之下，包封率高、粒徑小、易吸收、可避免有機試劑的納米結構脂質(zhì)載體的遞送系統(tǒng)脫穎而出，因此，通過制備番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體（Lycopene Nanostructured Lipid Carrier，Lyco-NLC），提高番茄紅素的水溶性，促進番茄紅素在人體的吸收，成為當今越來越多學者的研究熱點[14]。

納米結構脂質(zhì)載體（Nanostructured Lipid Carrier，NLC）是由固體脂質(zhì)、液體脂質(zhì)和含表面活性劑的水相混合物在一定條件下形成的納米級藥物遞送系統(tǒng)。相較于上一代的固體脂質(zhì)納米顆粒（Solid Lipid Nanoparticles，SLN），納米結構脂質(zhì)載體在其基礎上加入液體脂質(zhì)，改變了固體脂質(zhì)納米顆粒的晶體狀態(tài)，這些具有“缺陷”的固體脂質(zhì)可以容納更多的藥物且保持良好的穩(wěn)定性[15-16]。常用的納米結構脂質(zhì)載體制備方法有乙醇注入法、薄膜超聲法、高壓均質(zhì)法、超臨界CO2流體法、微波輔助法、熔融法等方法[17-20]。其中熔融法是將含有藥品的混合脂質(zhì)加熱至固體脂質(zhì)熔點以上形成均一油相，再將油相與含有表面活性劑的水相混合，形成預乳液。該方法不添加有機試劑，綠色安全，操作簡單。

Box-Behnken響應面法是一種設計點較少、運算成本低的一種常用的實驗設計方法[21]。遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）是一種模仿自然界生物 進化規(guī)律，即物競天擇、遺傳進化、優(yōu)勝劣汰演 變而來的一種全局尋優(yōu)的優(yōu)化算法[22-23]，可彌補Box-Behnken響應面法設計局部不足的缺點。

研究通過采用熔融-高速剪切法制備Lyco-NLC，在單因素實驗基礎上，以包封率為主要評價指標，采用遺傳算法結合Box-Behnken響應面法優(yōu)化Lyco-NLC制備工藝，為綠色安全、易吸收番茄紅素產(chǎn)品的加工研發(fā)提供理論參考。

1 實驗

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑：番茄紅素，市售；番茄紅素標準品，上海保藏生物技術中心；正己烷（分析純）、吐溫80，天津市富宇精細化工有限公司；無水乙醇（分析純），天津市天力化學試劑有限公司；單硬脂酸甘油酯（乳化型）、棕櫚酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉豆蔻酸，上海麥克林生化科技有限公司；硬脂酸，天津市博迪化工有限公司；中鏈甘油三酯，廣東永晟工貿(mào)有限公司；亞油酸、吐溫20，天津市光復精細化工研究所；辛癸酸甘油酯，河南奧尼斯特食品有限公司；肉豆蔻酸異丙酯、吐溫85，山東優(yōu)索化工科技有限公司；Span80，天津市致遠化學試劑有限公司；Span85、油酸，西隴科學股份有限公司；泊洛沙姆188，北京酷爾化學科技有限公司。

1.2 儀器與設備

主要儀器與設備：KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FJ200-SH實驗室數(shù)顯高速分散均質(zhì)機，上海滬析實業(yè)有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；馬爾文激光粒度儀，英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的制備

采用熔融-高速剪切法。準確稱取一定量的固體脂質(zhì)、液體脂質(zhì)和番茄紅素，在固體脂質(zhì)熔點10 ℃以上加熱至熔融狀態(tài)作為油相；準確稱取一定量的表面活性劑與蒸餾水混合，水浴加熱至相同溫度作為水相。在磁力攪拌下，將水相趁熱滴加到油相中，形成預乳液。再將制備好的初乳立即進行高速剪切，冷卻，過濾，即得Lyco-NLC。

1.3.2 番茄紅素標準曲線的繪制

精密稱量5 mg番茄紅素標準品，用一定量的正己烷充分溶解后，定容至50 mL。制得標準母液。分別精確移取適量的番茄紅素母液制備質(zhì)量濃度為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μg/mL系列標準溶液。在472 nm波長下測定其吸光度值，以番茄紅素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，平行測定3次，繪制番茄紅素標準曲線。得到標準曲線方程：= 0.295 9? 0.056 3，2=0.999 3。

1.3.3 包封率的測定

采用有機溶劑破乳-萃取的方法測定包封率。取一定量的Lyco-NLC，用適量的無水乙醇，振蕩，超聲10 min進行破乳，再加入一定量的正己烷，2 000 r/min離心2 min，取上層番茄紅素-正己烷溶液，定容，在472 nm下測定吸光度。根據(jù)標準曲線得番茄紅 素總量總；另取一定量的Lyco-NLC和正己烷，2 400 r/min離心4 min，收集上清液，重復操作，直至正己烷層不變色為止。收集到的上清液定容，在472 nm下測定吸光度。根據(jù)標準曲線得游離番茄紅素游。按式（1）計算包封率。

式中：總為破乳后番茄紅素的質(zhì)量，g；游為游離番茄紅素的質(zhì)量，g。

1.3.4 平均粒徑的測定

取少量Lyco-NLC進行稀釋，避免聚集和多重散射的影響。在25 ℃條件下，調(diào)整參數(shù)Refractive index為1.332，采用Nano-ZS90型激光粒度儀測定平均粒徑。

1.3.5 單因素實驗

以Lyco-NLC的包封率和粒徑為評價指標，調(diào)整固體脂質(zhì)（單硬脂酸甘油酯、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸）、液體脂質(zhì)（中鏈甘油三酯、油酸、亞油酸、辛癸酸甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯）、液體脂質(zhì)質(zhì)量分數(shù)（40%、50%、60%、70%、80%）、表面活性劑（吐溫80、吐溫20、吐溫85、Span80、Span85、泊洛沙姆188）、表面活性劑的復配、表面活性劑質(zhì)量分數(shù)（30%、40%、50%、60%、70%）、番茄紅素與總脂質(zhì)的質(zhì)量比（1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90）、剪切速度（14 000、15 000、16 000、17 000、18 000 r/min）、剪切時間（4、4.5、5、5.5、6 min）進行單因素實驗。

1.3.6 Box-Behnken響應面優(yōu)化實驗

結合單因素實驗結果，選擇藥脂比（）、剪切速度（）、剪切時間（）作為輸入對象，以Lyco-NLC包封率為輸出對象，采用Box-Behnken響應面法進行工藝優(yōu)化設計實驗，因素及水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken響應面因素及水平編碼

Tab.1 Box-Behnken response surface factor and level coding

1.3.7 遺傳算法優(yōu)化實驗

遺傳算法是模擬達爾文生物進化論的自然選擇和遺傳學機理的生物進化過程的計算模型，是一種通過模擬自然進化過程搜索最優(yōu)解的方法[24]。不存在函數(shù)連續(xù)性的限定，具有內(nèi)在的隱并行性和更好的全局尋優(yōu)能力[25]。遺傳算法是一個反復迭代的過程，遵循物競天擇、優(yōu)勝劣汰原則，通常選擇種群中那些具有更好適應度值的“精英”個體作為親代，較大程度的遺傳給下一代。遺傳的過程伴隨著交叉、變異，從而產(chǎn)生“精英子代”、“交叉子代”、“變異子代”。根據(jù)適者生存的原則，最終在龐大的后代種群中，得到若干個“精英”。遺傳算法優(yōu)化番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體包封率的基本流程見圖1[26]。以包封率回歸方程為適應度函數(shù)，用MatLab2019b運行分析。

圖1 遺傳算法流程

1.3.8 驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken響應面法和遺傳算法優(yōu)化后的制備工藝條件，結合實驗室實際條件，以包封率為評價指標，進行3次平行實驗。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021b、SPSS26等軟件對數(shù)據(jù)進行處理并作圖，結果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 固體脂質(zhì)的篩選

通過分別對1 g不同固體脂質(zhì)在高于其熔點10 ℃下，依次加入1 mg番茄紅素，記錄固體脂質(zhì)熔融狀態(tài)下能完全溶解番茄紅素的量，結果見表2。溶解番茄紅素最多的固體脂質(zhì)是單硬脂酸甘油酯，因此選擇單硬脂酸甘油酯作為固體脂質(zhì)。

表2 不同固體脂質(zhì)對番茄紅素溶解的影響

Tab.2 Effects of different solid lipids on lycopene dissolution

2.1.2 液體脂質(zhì)的篩選

分別稱取3 mg番茄紅素于4 mL不同液體脂質(zhì)中，超聲促溶30 min，移至空氣振蕩器。根據(jù)溶解情況，每次遞加一定量番茄紅素，使液體脂質(zhì)中始終有番茄紅素粉末的存在，在32 ℃、95 r/min條件下振蕩20 h后，4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，用正己烷稀釋定容至100 mL，在472 nm處測吸光值。根據(jù)番茄紅素標準曲線計算液體脂質(zhì)溶解番茄紅素的量，溶解的量越大，說明番茄紅素與該液體脂質(zhì)相容性越好，越適合做納米結構脂質(zhì)載體[27]，結果見表3。中鏈甘油三酯的溶解度最大，因此選擇中鏈甘油三酯作為液體脂質(zhì)。

表3 不同液體脂質(zhì)對番茄紅素溶解的影響

Tab.3 Effects of different liquid lipids on lycopene dissolution

2.1.3 固液脂質(zhì)比對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

固液脂質(zhì)比對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響結果見圖2。隨著液體脂質(zhì)占比的增大，包封率逐漸增大，而液體脂質(zhì)占比增加到一定程度時，包封率開始下降。這是因為液體脂質(zhì)占比增加過程中，Lyco-NLC粒子晶體被破壞，這些“缺陷”的晶體越來越多，能容納更多的番茄紅素[28]，Lyco-NLC包封率隨之增大。當增加到一定程度時，Lyco-NLC粒子無法維持足夠的剛性，從而導致番茄紅素泄露，因此Lyco-NLC包封率降低。寧雙成等[29]通過乳化超聲分散法制備斑蝥素納米結構脂質(zhì)載體也得到了隨著液體脂質(zhì)比例的增大，包封率先增大后降低的結果。

圖2 固液脂質(zhì)比對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.1.4 表面活性劑的篩選

保持其他條件不變，調(diào)整表面活性劑的種類，考察不同表面活性劑對Lyco-NLC的包封率和粒徑的影響，結果見圖3。吐溫20制備的Lyco-NLC包封率最大，吐溫80、泊洛沙姆188次之，但吐溫20制備的Lyco-NLC粒徑最大，因此，表面活性劑選擇吐溫80和泊洛沙姆188進行復配實驗。

圖3 不同表面活性劑對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.1.5 表面活性劑的復配

選擇吐溫80和泊洛沙姆188 2種表面活性劑進行復配實驗。保持表面活性劑總的添加量不變，調(diào)整吐溫80的質(zhì)量占比，其余條件不變，制備Lyco-NLC?？疾鞆秃媳砻婊钚詣┲型聹?0的質(zhì)量占比對Lyco-NLC的包封率和粒徑的影響，結果見圖4。隨著表面活性劑吐溫80占比的增加，包封率先增加后減小，在60%時達到最大值，且粒徑最小，因此選擇復配條件：吐溫80質(zhì)量分數(shù)為60%與單獨使用表面活性劑吐溫80、泊洛沙姆188進行比較，結果見圖5。復合表面活性劑在保證較高包封率的同時，能有效降低Lyco-NLC粒徑，提高穩(wěn)定性，因此選擇吐溫80質(zhì)量占比為60%的復合表面活性劑。

圖4 復合表面活性劑對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

圖5 復配表面活性劑與單獨表面活性劑比較

2.1.6 表面活性劑添加量的考察

保持其他條件不變，調(diào)整復合表面活性劑與總脂質(zhì)的比，制備Lyco-NLC，考察表面活性劑的添加量對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響，結果見圖6。隨著表面活性劑量的增加，包封率也隨之增加，在40%時達到最高值，而繼續(xù)增大表面活性劑添加量時，包封率反而減小。可能的原因是表面活性劑的增溶作用，使得番茄紅素進入水相所致，且表面活性劑添加量過大時，Lyco-NLC粒子剛性增大，表面積減小，包埋番茄紅素的量減少，粒徑也隨之減小，而過高的表面活性劑用量存在安全隱患，因此選擇最適添加量為40%。王小霞等[30]采用乳化超聲法制備鞣花酸納米結構脂質(zhì)載體時，也得到了隨著表面活性劑添加量的增大，包封率先增大后降低的結果。

圖6 表面活性劑添加量對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.1.7 藥脂質(zhì)比對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的 影響

保持其他條件不變，調(diào)整藥脂比，制備Lyco-NLC，考察藥脂比對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響。結果見圖7。隨著總脂質(zhì)的量增加，Lyco-NLC包封率也隨之增加，粒徑隨之減小，在藥脂比為1∶70時達到最大值，且粒徑最小?？傊|(zhì)的量繼續(xù)增加時，包封率開始降低，粒徑逐漸變大?？赡艿脑蚴请S著總脂質(zhì)量的增加，越來越多的番茄紅素被包埋，從而使得包封率增加。總脂質(zhì)的量增加到一定程度時，Lyco-NLC的剛性因脂質(zhì)過多受到影響，從而導致番茄紅素泄露，包封率降低，粒徑增大。馬永強等[31]采用乙醇注入法制備番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體時，也得到了隨著總脂質(zhì)占比的增大，包封率先增加后降低的結果。

圖7 藥脂質(zhì)比對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.1.8 剪切速度對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

保持其他條件不變，調(diào)整剪切速度制備Lyco-NLC，考察剪切速度對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響，結果見圖8。隨著剪切速度的增加，Lyco-NLC的粒徑變小，表面積增大，能包裹更多的番茄紅素，因此包封率增加，但是過大的剪切速度破壞能力強，導致番茄紅素泄露，包封率降低，穩(wěn)定性下降，因此剪切速度選擇15 000 r/min。

圖8 剪切速度對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.1.9 剪切時間對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

保持其他條件不變，調(diào)整剪切時間，制備Lyco-NLC，考察剪切時間對Lyco-NLC包封率和粒徑的影響，結果見圖9。隨著剪切時間的延長，許多粘連在一起的Lyco-NLC得以分開，粒徑減小、表面積增大，能包裹更多的番茄紅素，包封率增大。剪切時間過長也會導致Lyco-NLC粒子粘連，粒徑變大，而且會破壞Lyco-NLC粒子，導致番茄紅素泄露，包封率降低。綜合包封率和粒徑，選擇剪切時間為5.5 min。

圖9 剪切時間對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響

2.2 Box-Behnken響應面優(yōu)化實驗

2.2.1 響應面實驗設計

根據(jù)單因素實驗結果，選取藥脂比（）、剪切速度（）、剪切時間（）為三因素，包封率（）為評價指標進行Box-Behnken響應面優(yōu)化實驗。響應面實驗方案設計及結果見表4。

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析

對響應面設計結果進行多元二次回歸擬合，得到包封率（）對藥脂比（）、剪切速度（）、剪切時間（）的多元二次回歸方程為：

=?2 275.268?3.19+0.296+71.48+0.000 324?0.08+0.002 15? 0.009 5952? 0.000 010 692?9.1582

對響應面模型進行方差分析，結果見表5。模型＜0.000 1＜0.01，表示對實驗結果影響極其顯著；失擬項為0.782 9＞0.05，表明對實驗結果無顯著性差異。模型的決定系數(shù)2為0.992 3，上述結果說明模型可靠，擬合效果好。其中，項目、對實驗結果具有顯著性影響（0.01＜＜0.05）；項目、、2、2對實驗結果具有極其顯著性影響（＜0.01）。

2.2.3 響應面交互作用分析

藥脂比、剪切速度、剪切時間三因素中，任意2個因素交互作用結果見圖10—12。響應面圖均為開口向下的曲面圖，說明在考察范圍內(nèi)，存在響應值（番茄紅素包封率）的最大值。由圖10可知，剪切速度與藥脂比交互等高線圖呈橢圓狀，曲面圖呈拋物狀，隨著因素水平的增大，響應值Lyco-NLC包封率呈先增后減的趨勢，說明剪切速度和藥脂比交互作用顯著。由圖11和圖12可知，剪切速度與剪切時間、藥脂比與剪切時間交互作用較弱。

2.3 遺傳算法優(yōu)化實驗

選擇藥脂比（）、剪切速度（）、剪切時間（）為輸入變量，包封率為輸出適應度值，采用Matlab2019b對Lyco-NLC制備工藝進行優(yōu)化。設定參數(shù)：初始種群數(shù)為50，交叉概率為0.9，變異概率為0.02，進化代數(shù)為90，隨機運行10次。

隨機運行結果見表6。10次隨機搜索結果高度接近，且變異系數(shù)小于0.01，說明模型可靠，結果可信。

遺傳算法全局尋優(yōu)結果見圖13。遵循優(yōu)勝劣汰原則，淘汰適應度小的，保留適應度高的，隨著迭代次數(shù)的增加，種群中適應度高的“精英”占比逐漸增大，當?shù)螖?shù)接近30代時，適應度趨于最大值，表明種群接近最優(yōu)狀態(tài)；當?shù)螖?shù)到第36代時候，適應度函數(shù)輸出最大值86.208 2。初始化種群經(jīng)過迭代90次后，適應度函數(shù)輸出最大值所對應的向量為（72.51，15460，5.397），見圖14。遺傳算法優(yōu)化后最佳工藝條件：藥脂比為1∶72.51、剪切速度為15 460 r/min、剪切時間為5.397 min，包封率最大預測值為86.208 2%。

表4 Box-Behnken響應面實驗設計及結果

Tab.4 Box-Behnken response surface test design and results

表5 模型方差分析結果

Tab.5 Model variance analysis results

注：*為顯著（＜0.05）；**為極其顯著（＜0.01）。

圖10 藥脂比、剪切速度交互作用對番茄紅素納米結構脂質(zhì)載體的影響