煙草青枯病和黑脛病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及防效研究

濮永瑜，包玲鳳，何 翔，劉 芮，張 慶，施竹鳳，何永宏，楊佩文

（1云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；3云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205）

0 引言

煙草是云南省重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，常年種植面積30萬hm2以上。由于植煙土地資源有限，云南多地存在煙田連作現(xiàn)象，煙草長期種植導(dǎo)致土壤退化、連作障礙突出，加重了根莖類病害的發(fā)生，進(jìn)而影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。煙草青枯病和黑脛病是煙草種植過程中分布最廣、危害最大的2種根莖類病害[2-3]。近年來，此類病害在云南煙區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，局部地區(qū)嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)80%，給煙草產(chǎn)業(yè)帶來了巨大威脅。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病害常用的措施主要有抗病品種選育[4]、化學(xué)防治[5]、生物防治[6]等。其中抗性品種選育較困難、品種抗性易退化、成本高；化學(xué)農(nóng)藥雖見效快、防效高，但濫用化學(xué)農(nóng)藥造成“3R問題”(residue、resistance、resurgence)，不滿足綠色發(fā)展需求；生物防治則通過與病原菌競爭營養(yǎng)和空間位點(diǎn)、分泌抑菌物質(zhì)、誘發(fā)植物抗病潛能等直接或間接地抑制或殺死病原菌，對環(huán)境綠色友好[7]。因此，探索生物防治途徑，研發(fā)生防產(chǎn)品對煙草根莖類病害的防治顯得尤為重要。發(fā)掘及利用功能微生物菌株成為防治煙草土傳病害極具發(fā)展?jié)摿Φ氖侄沃籟8]。據(jù)報(bào)道，用于防治植物病害的功能微生物大多為木霉菌屬[9]、芽孢桿菌屬[10]、鏈霉菌屬[11]、假單胞桿菌屬[12]等，這些生防菌廣泛存在于土壤、動物腸道、植物體內(nèi)、空氣以及水體等環(huán)境中。近年來，利用生防菌防治煙草根莖類病害已頗有成效。周向平等[13]從青枯病發(fā)病較重?zé)熖锏慕】禑熤旮抵蟹蛛x獲得1株對煙草青枯病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌Xe01，溫室盆栽和小區(qū)試驗(yàn)對煙草青枯病的防治效果分別達(dá)到56.32%和61.46%；馮印印等[14]從運(yùn)城鹽湖湖岸土壤中篩選獲得一株對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果的菌株FY-C，盆栽防效達(dá)59.74%；黃瑞環(huán)等[15]從海洋木霉菌株中分別測定篩選到的里氏木霉、鉤狀木霉、擬康寧木霉和10株棘孢木霉對黑脛病菌的抑菌活性，抑制率均達(dá)60%以上。本研究利用云南省獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境優(yōu)勢和豐富的微生物菌種資源，從發(fā)病煙株根際土壤中篩選出對煙草青枯病和黑脛病具較好防效的生防菌，分離篩選防治效果較好的拮抗菌，通過生理生化和分子生物學(xué)鑒定明確菌株的基礎(chǔ)屬性，盆栽試驗(yàn)測定其防效，旨在為煙草根莖類病害的持續(xù)有效防控提供資源儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年6—12月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所經(jīng)濟(jì)作物病害與防控研究室進(jìn)行。

1.2 材料

煙草青枯病菌和煙草黑脛病菌均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所經(jīng)濟(jì)作物病害與防控研究室保存。供試土樣是從云南省保山市昌寧縣臘邑村試驗(yàn)地采集的土壤樣品，隨機(jī)采取發(fā)病煙株根際土壤，共5份土樣，搗碎倒入自封袋后放入冰盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于4℃冰箱備用。供試作物為‘K326’煙草幼苗。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1000 mL，pH自然。NA培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1000 mL，pH自然。NB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1000 mL，pH自然。

1.3 拮抗菌的分離、篩選及抑菌活性評價(jià)

1.3.1 拮抗菌分離 采用稀釋涂布法從供試土樣中分離拮抗菌。稱取10 g土樣倒入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，于30℃、180 r/min條件下振蕩30 min后靜置5 min，得到原液。取原液1 mL并逐級以10倍梯度稀釋，分別配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的懸浮液，各吸取60 μL加入到NA固體平板上，涂布后于30℃條件下倒置黑暗培養(yǎng)5天。采用平板劃線法分離純化菌株，挑取不同的單菌落于NA培養(yǎng)基上劃線純化，保存4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 煙草青枯病菌與黑脛病菌拮抗菌篩選

（1）采用平板對峙法篩選對煙草黑脛病有抑制作用的拮抗菌株。將直徑0.5 cm的煙草黑脛病菌菌餅接種至PDA平板中央，以此為中心，按照十字形的布局將待篩選拮抗菌點(diǎn)接在距離菌餅2.5 cm處，以只接種煙草黑脛病菌的PDA平板為對照，每株拮抗菌株3次重復(fù)，于恒溫培養(yǎng)箱(25℃)黑暗培養(yǎng)5天，觀察煙草黑脛病菌和拮抗菌的生長情況、是否有抑菌圈產(chǎn)生，得到對煙草黑脛病菌具有拮抗作用的拮抗菌，十字交叉法測量其抑菌直徑。

（2）采用濾紙片法篩選對煙草青枯病具有抑制作用的拮抗菌株。將煙草青枯病菌接種至NB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，取50 mL冷卻至40～50℃的NA培養(yǎng)基與5 mL病原菌液混勻制成含病原菌的NA固體平板。將拮抗菌分別接種至NB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)結(jié)束后用0.22 μm無菌濾膜濾除菌體獲得拮抗菌株發(fā)酵原液。將直徑0.5 cm的滅菌濾紙片用拮抗菌株發(fā)酵原液潤濕至飽和狀態(tài)，無菌條件下轉(zhuǎn)移至含病原菌的NA固體平板培養(yǎng)基中央，30℃條件下培養(yǎng)，觀察記錄是否有抑菌圈的產(chǎn)生，保存有良好抑菌作用的菌株。

選取對煙草青枯病和黑脛病均有拮抗作用的菌株，培養(yǎng)結(jié)束后測量抑制圈直徑計(jì)算平均值及抑制率[式(1)][16]。通過抑制率結(jié)果，選取2株活性較高的拮抗菌株，分別編號為LF-1、LF-2。

1.4 拮抗菌株的鑒定

1.4.1 生理生化鑒定 拮抗菌株生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]進(jìn)行。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將復(fù)篩獲得的拮抗菌株LF-1、LF-2接種至NB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床中180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，無菌條件下取樣于紫外分光光度計(jì)下讀取培養(yǎng)菌液OD600值，當(dāng)OD600值近似于1.00（約1×109cfu/mL）時(shí)停止培養(yǎng)。采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取拮抗菌的基因組DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物 27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s；53℃退火60 s；72℃延伸2 min；35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST搜索 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后 與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的基因序列進(jìn)行比較分析，選用同源性較高的模式菌株序列作為參比對象，用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行多序列比對，計(jì)算供試菌株與參比菌株序列的相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)排除堿基缺失位點(diǎn)，采用鄰接法(neighbor-joining analysis)用MEGA 7.0構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，bootstrap值設(shè)定為1000，其余均為默認(rèn)值。

1.5 拮抗菌株基因組DNA中相關(guān)抗生素合成基因的PCR檢測

取斜面保藏的純化菌株LF-1和LF-2，平板劃線法接種于NA培養(yǎng)基上，37℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落分別接種于NB培養(yǎng)基中，37℃180 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后取1.5 mL菌液，10000 r/min離心處理5 min，去除上清液，用200 μL dd H2O重懸，95℃沸水處理10 min，冰浴處理5 min，10000 r/min離心處理5 min，取上清液為菌株DNA模板。將材料中的9對引物分別對菌株LF-1和LF-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL，具體包括10×buffer 2.0 μL、dNTPs 1.6 μL、DNA 模板1.0 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、前引物1.0 μL、后引物1.0 μL、ddH2O補(bǔ)滿體系。擴(kuò)增條件：98℃ 2 min，98℃ 10 s，52℃ 15 s(ituC)或 54℃ 15 s(yndJ、fenD、bamC)或55℃ 15 s(ysnE)或56℃ 15 s(bioA)或58℃ 15 s(SrfAB、dhbC、sboA)，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)，72℃5 min，4℃條件下保存?zhèn)溆?。使?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測結(jié)果。本研究中用于相關(guān)抗生素合成基因PCR檢測的9對特異性引物均由由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

表1 功能基因檢測引物

1.6 拮抗菌株發(fā)酵液對煙草青枯病和黑脛病的防控效果

以室內(nèi)平板功能篩選獲得的2株拮抗菌株為目標(biāo)菌株，以煙草幼苗（6～7個(gè)葉片）為供試盆栽植物，采用溫室盆栽模式（溫度30℃、濕度85%、光照/黑暗12 h/12 h）分別進(jìn)行煙草青枯病和黑脛病抗病活性效果評價(jià)驗(yàn)證。2株拮抗菌株共設(shè)置19個(gè)處理，每個(gè)處理15次重復(fù)，每個(gè)花盆裝入350 g經(jīng)滅菌處理后的土壤，病原菌（青枯病菌、黑脛病菌）菌液濃度107cfu，拮抗菌發(fā)酵液濃度108cfu，具體方法見表2。

表2 溫室盆栽試驗(yàn)設(shè)置

將盆栽在恒溫條件下培養(yǎng)30天，觀察并記錄植株生長和發(fā)病情況。各處理發(fā)病情況按照煙草行業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23223—2008，調(diào)查其病株率、病情指數(shù)[式(2)]和防效[式(3)]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)各處理間差異顯著性，選擇Excel和SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌分離、篩選結(jié)果

從煙株發(fā)病根際土壤中共分離篩選出37株平板菌落特征不同的菌株，其中有19株具有抑菌效果，經(jīng)初篩和復(fù)篩，菌株LF-1和LF-2抑菌效果最好且較穩(wěn)定（圖1）。經(jīng)培養(yǎng)觀察后，菌株LF-1對煙草青枯病菌和黑脛病菌的抑制率分別為31.16%和64.44%，菌株LF-2對煙草青枯病菌和黑脛病菌的抑制率分別為56.98%和72.44%（表3）。

圖1 LF-1(A、B)和LF-2(C、D)對煙草青枯病菌和黑脛病菌的抑制效果圖

表3 菌株LF-1與LF-2對煙草青枯病菌和黑脛病菌抑制活性結(jié)果

2.2 拮抗菌LF-1和LF-2鑒定結(jié)果

2.2.1 拮抗菌形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征 菌株LF-1菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑不透明（圖2A）；菌株LF-2菌落形態(tài)呈圓形，邊緣整齊，具有較強(qiáng)的粘附性，培養(yǎng)初期菌落乳白色、膿狀，培養(yǎng)后期表面凹陷，表面干燥有褶皺（圖2C）。生理生化試驗(yàn)測定表明（表4），菌株LF-1 V-P反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果為陰性，其余指標(biāo)檢測結(jié)果為陽性；菌株LF-2甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果為陰性，其余指標(biāo)檢測結(jié)果為陽性。根據(jù)形態(tài)觀察并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步確定菌株LF-1為枯草芽孢桿菌，菌株LF-2為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 LF-1和LF-2菌落形態(tài)及電鏡形態(tài)觀察

表4 LF-1和LF-2生理生化特征鑒定結(jié)果

2.2.2 拮抗菌的分子鑒定結(jié)果 對菌株LF-1和LF-2的16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，獲得目的基因片段均為1417 bp，GenBank 登錄號分別為 MW418526、MW418527。采用BLAST搜索與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄序列比對，選擇有詳細(xì)信息菌株作為參比菌株，進(jìn)行Clustal W多重比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3～4）表明，菌株 LF-1(MW418526)與參比菌株Bacillus subtilisSBMP4的相似性達(dá)100%，菌株間具較高同源性，初步鑒定為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis；菌株LF-2(MW418527)與參比標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus amyloliquefaciensBCRC 11601的相似性達(dá)99.79%，菌株間具較高同源性，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

圖3 菌株LF-1基于16SrDNA序列的系統(tǒng)分析發(fā)育樹

圖4 菌株LF-2基于16SrDNA序列的系統(tǒng)分析發(fā)育樹

2.3 拮抗菌株相關(guān)抗生素合成基因的PCR檢測結(jié)果

選取9對引物對拮抗菌株LF-1和LF-2的相關(guān)抗生素合成基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果如表5所示。菌株LF-1和LF-2均能被基因SrfAB、fenD、ituC、bamC和bioA檢測到，由此推斷菌株LF-1和LF-2均具有合成表面活性素(surfactin)、泛革素(fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、芽孢菌霉素(bacillomycine)和生物素(biotin)多種抑菌促生物質(zhì)的潛力。

表5 拮抗菌株LF-1和LF-2相關(guān)抗生素合成基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 拮抗菌株發(fā)酵液對煙草青枯病和黑脛病的防控效果

煙草幼苗經(jīng)過接種處理30天，菌株LF-1和LF-2能有效抑制煙草青枯病害和黑脛病害的發(fā)生。隨著拮抗菌菌液稀釋倍數(shù)的增大，對病原菌的防效逐漸減弱。只接病原菌的對照處理發(fā)病較為嚴(yán)重，病情指數(shù)分別高達(dá)79.20和77.76。菌株LF-1菌原液處理的煙草幼苗病情指數(shù)分別為24.12和26.82，防治效果為69.54%和65.49%；菌株LF-2菌原液處理的病情指數(shù)分別為21.78和24.66，防治效果為72.49%和68.32%（表6）。對照組煙草幼苗的病情指數(shù)顯著高于處理組，表明2株拮抗菌對煙草青枯病和黑脛病均有顯著的抑制作用，其中以LF-2防治效果更好。

表6 菌株LF-1和LF-2發(fā)酵液對煙草青枯病菌和黑脛病菌的防控效果

3 結(jié)論

研究表明，從云南省保山市發(fā)病煙株根際土篩選得到的拮抗菌株LF-1枯草芽孢桿菌和LF-2解淀粉芽孢桿菌能有效抑制煙草青枯病和黑脛病的發(fā)生，LF-1防效為69.54%和65.49%，LF-2防效為72.49%和68.32%，防治效果較好，對防控?zé)煵莞o類病害生防菌的開發(fā)應(yīng)用等方面具有實(shí)踐意義。

4 討論

正常種植條件下，作物根際的微生態(tài)維持著一個(gè)動態(tài)平衡，當(dāng)外來病原菌入侵且適應(yīng)生長環(huán)境后，便開始大量繁殖，不斷吞噬淘汰其他微生物，其中有益微生物的數(shù)量及比例下降[20-21]。但單一作物長期種植并爆發(fā)嚴(yán)重的植物病害后會形成對某一特定病原菌具有拮抗作用的土壤微生物，同時(shí)植株還會產(chǎn)生根系分泌物招募有益微生物菌來抵御病原菌，進(jìn)而促使抗病微生物種類增加[22-23]。王亞嬌等[24]從西瓜枯萎病病株根際土篩選得到一株解淀粉芽孢桿菌，對西瓜枯萎病田間防效達(dá)78%。Huang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病植株分離得到的拮抗菌對茄科雷爾氏菌的防效顯著高于從健康植株分離得到的拮抗菌。綜上，本試驗(yàn)從發(fā)病嚴(yán)重的煙株根際土壤中篩選拮抗菌菌方法可行。

芽孢桿菌(Bacillus)屬革蘭氏陽性菌，在自然界中廣泛存在，易于從土壤和植株中分離獲得[26]。目前,研究較多的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等。芽孢桿菌通過誘發(fā)植物抗病潛能，抑制病原菌的生長，甚至殺死病原菌來達(dá)到抑病防控效果，此外，芽孢桿菌還能提高土壤中磷的利用率，改良土壤結(jié)構(gòu)和促進(jìn)植物生長[27-31]。張美君[32]從蚯蚓糞中篩選得到一株解淀粉芽孢桿菌，除了對尖鐮孢黃瓜?；涂菸【休^好的拮抗作用外，對黃瓜還具有明顯的促生長作用。本研究篩選出的2株拮抗菌對煙草青枯病和黑脛病均有良好的防治效果，但拮抗菌是否還具有其他功能還有待探索。眾所周知，芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)在生物防治中起著關(guān)鍵性作用，其中脂肽類抗生素最具代表性[33]。據(jù)此，本研究通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)菌株LF-1和LF-2全基因組中存在SrfAB、fenD、ituC、bamC和bioA等合成脂肽類物質(zhì)相關(guān)的基因，說明菌株具有合成多種脂肽類抗生素的潛能，從分子水平上驗(yàn)證了相關(guān)研究結(jié)果的可靠性。此外，有研究表明生防菌株不僅能通過廣譜的抗菌作用直接抑制病原真菌菌絲生長，還能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生畸變，抑制病害的發(fā)生[34-35]。本研究在拮抗菌對煙草黑脛病活性測定的試驗(yàn)結(jié)果顯示，2株拮抗菌均能不同程度抑制煙草黑脛病菌菌絲生長，但是通過顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，未發(fā)現(xiàn)黑脛病菌菌絲形態(tài)異常，拮抗菌仍對病原菌產(chǎn)生抑菌作用，可能是其搶占了病原菌的空間位點(diǎn)或者分泌了某種代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長，可在后續(xù)試驗(yàn)中對拮抗菌抑菌機(jī)理進(jìn)一步深入研究。

本試驗(yàn)僅在室內(nèi)對拮抗菌進(jìn)行了防效驗(yàn)證，未直接應(yīng)用于田間，拮抗菌的田間應(yīng)用受諸多因素的影響，其防效結(jié)果易受外界環(huán)境的影響，與室內(nèi)防效結(jié)果產(chǎn)生較大差異。后期可進(jìn)一步優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，確定其營養(yǎng)載體、配施藥劑、田間控病效果、最佳施用次數(shù)和時(shí)期等。菌株LF-1和LF-2在煙草土傳病害防控中的應(yīng)用潛力還需要通過研發(fā)微生物制劑并開展大田防效試驗(yàn)加以驗(yàn)證。