二陳湯治療腺樣體肥大的作用機(jī)制探討*

趙婷，宋穎，張喜蓮

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心 天津 300193

腺樣體（adenoidal）位于鼻咽頂后壁中線處，是Waldeyer淋巴環(huán)中四大扁桃腺群之一，又稱為咽扁桃體或增殖體，屬于人體的外周免疫器官，是呼吸道第一道防線，腺樣體在正常兒童2～6歲時(shí)會(huì)出現(xiàn)生理性肥大，經(jīng)多種因素刺激導(dǎo)致腺樣體病理性增生稱為腺樣體肥大（adenoid hypertrophy，AH）[1]。AH是一種兒童常見病，發(fā)病率為9.9%～29.9%[2]，AH會(huì)造成氣道阻塞，并繼發(fā)多種并發(fā)癥。臨床常采用腺樣體切除手術(shù)治療AH，但手術(shù)治療可能會(huì)導(dǎo)致上呼吸道功能缺失，損傷人體免疫功能[3]，且存在全麻、復(fù)發(fā)等風(fēng)險(xiǎn)。因此，臨床上越來越多的家長愿意接受非手術(shù)的保守治療。

西醫(yī)的非手術(shù)治療主要為外用鼻類固醇激素、內(nèi)服抗組胺藥、白三烯受體拮抗劑等，缺乏療效好、不良反應(yīng)小的藥物[4-5]。中醫(yī)藥在治療 AH 取得了很好的療效，為臨床醫(yī)生提供了重要的參考依據(jù)，二陳湯作為基礎(chǔ)方被臨床醫(yī)生廣泛應(yīng)用于AH治療中，但藥物治療 AH 的作用機(jī)制并不明確，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找藥物多成分和多靶點(diǎn)的相互聯(lián)系，目前已被多方面應(yīng)用于中藥研究當(dāng)中，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探究二陳湯治療AH的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以期為二陳湯治療AH的臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)，并挖掘潛在治療目標(biāo)。

資料與方法

1 AH的基因靶點(diǎn)收集

在GeneCard疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）及OMIM疾病數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）輸入疾病名稱“adenoidal hypertrophy”，搜索AH的疾病靶點(diǎn)，并運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲得靶點(diǎn)的Uniprot ID，進(jìn)行Uniprot ID轉(zhuǎn)化。

2 中藥成分的收集和篩選

在TCMSP數(shù) 據(jù) 庫（https://tcmsp-e.com/）中 搜索半夏、橘紅、茯苓、烏梅、生姜及甘草的主要化學(xué)成分，并根據(jù)生物口服利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18篩選候選化合物。運(yùn)用Excel表格和網(wǎng)絡(luò)文本整理化合物-靶點(diǎn)信息，運(yùn)用R語言得到疾病和藥物交集基因的網(wǎng)絡(luò)文本和Venn圖。

3 化合物-靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集基因的Excel文本導(dǎo)入Cytoscape3.8.0構(gòu)建二陳湯-AH疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖由節(jié)點(diǎn)（node）表示的化合物和靶點(diǎn)以及邊（edge）表示的相互作用所構(gòu)成。網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性通過Cytoscape插件Analyz Network的拓?fù)鋮?shù)自由度（Degree）和介數(shù)（Betweenness）和中心性（Closeness）進(jìn)行評(píng)估，節(jié)點(diǎn)的自由度、介數(shù)和中心性越大，表明該節(jié)點(diǎn)越重要。

4 蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn) 用STRING數(shù) 據(jù) 庫（https://string-db.org/）整理交集靶點(diǎn)信息，生物物種選擇人類，篩選條件設(shè)置為較高置信度（0.7），構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（Proteinprotein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。并將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，計(jì)算度（degree）值，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)自由度、介數(shù)和中心性篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

5 GO基因富集分析和KEGG通路富集分析

運(yùn) 用Metascape平 臺(tái)（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對(duì)得到的基因進(jìn)行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，生物物種選擇人類，設(shè)定閾值為P<0.01，將排名前20的通路進(jìn)行可視化分析。

網(wǎng)絡(luò)藥理信息的結(jié)果

1 二陳湯活性化合物及靶點(diǎn)篩選

對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索所得成分進(jìn)行篩選，得到活性化合物半夏12個(gè)，茯苓6個(gè)，橘紅7個(gè)，烏梅8個(gè)，生姜4個(gè)，甘草81個(gè)，去重后共有105個(gè)潛在活性化合物，見表1?；钚曰衔锕灿?42節(jié)點(diǎn)，2076條邊，菱形為靶點(diǎn)，圓形為活性化合物，六邊形為藥物，見圖1。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值和介數(shù)、中心性排序，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治銮?0的活性化合物為黃芩素（baicalein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、柚皮素（Naringenin）、山奈酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、苜蓿素（Medicarpin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、刺芒柄花素（formononetin）、維斯體素（Vestitol）。

圖1 化合物-靶點(diǎn)藥理網(wǎng)絡(luò)圖

表1 二陳湯主要活性化合物的基本信息（僅顯示排名前10的活性化合物）

2 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果

檢索獲得腺樣體肥大的疾病作用靶點(diǎn)862個(gè)，腺樣體肥大與活性化合物交集靶點(diǎn)共104個(gè)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，經(jīng)篩選共得到23個(gè)核心靶點(diǎn)（見圖2），取排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為血清/三氨酸蛋白激酶1（RAC-alpha serine/threonineprotein kinase，AKT1）、絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 激 酶1 （Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、轉(zhuǎn)錄 因 子AP-1（Transcription factor AP-1，JUN）、白介 素-6（Interleukin-6，IL6）、線 粒 體 激 活 蛋 白 激酶8 （Mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳感器和激活器3 （Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、myc原蛋白（Myc proto-oncogene protein，MYC）、絲裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、熱休克蛋白90α（Heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90AA1）等。

3 潛在靶點(diǎn)的GO基因分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，二陳湯對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、細(xì)胞死亡的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程，對(duì)膜筏、囊腔、線粒體被膜、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體、血清/三氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核膜、等離子膜蛋白等細(xì)胞功能，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)域特定結(jié)合、核受體的活動(dòng)、蛋白激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等分子功能有積極調(diào)控作用，見圖3。

圖3 二陳湯治療AH的GO基因分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，二陳湯治療AH通過多條信號(hào)通路完成，主要與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)的IL-17信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、同種異體移植排斥，病毒感染途徑相關(guān)的麻疹、朊病毒疾病、病毒致癌物信號(hào)通路，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)的血清素突觸、多巴胺能神經(jīng)突觸，以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)的內(nèi)分泌耐藥性、卵巢類固醇激素信號(hào)通路相關(guān)，此外，還有癌癥通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)等其他重要信號(hào)通路，見圖4。

圖4 二陳湯治療AH的KEGG通路富集分析

討 論

腺樣體肥大在中醫(yī)典籍中缺少相關(guān)記載，近年來隨著醫(yī)家對(duì)腺樣體肥大的認(rèn)識(shí)逐漸增多，根據(jù)發(fā)病部位和主要臨床癥狀，將其歸結(jié)為“鼾眠”“痰核”“鼻窒”“頏顙不開”“窠囊”等范疇[6]。如《靈樞集注》中亦提到:“頏顙者，腭之上竅，口鼻之氣及涕唾，從此相通?！薄夺t(yī)碥》中提出：“痰本為津液，但積久聚多遍及全身……甚則結(jié)成牢固的窠囊，表現(xiàn)各異?！毕贅芋w總屬本虛標(biāo)實(shí)，肺開竅于鼻，咽喉為肺之門戶，外邪侵襲，首先犯肺，尤以鼻咽部為重。小兒臟腑嬌嫩、形氣未充，肺脾腎三臟不足，易感六淫邪氣，正氣不能鼓邪外出，外邪留戀，小兒陽常有余之體，易化熱化火，熱毒煉液成痰，病邪互結(jié)于咽喉。二陳湯是治療腺樣體肥大常用方[6]，本方出自于宋·《太平惠民和劑局方》，由半夏、橘紅、茯苓、生姜、烏梅、甘草6味中藥構(gòu)成，標(biāo)本兼顧，散收相合，燥濕祛已形之痰，健脾絕生痰之源，又可行氣散滯，體現(xiàn)治痰先治氣，氣順則痰消之意。

對(duì)二陳湯6味中草藥的105個(gè)活性成分和23個(gè)核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多個(gè)活性成分，體現(xiàn)了活性成分與靶點(diǎn)之間相互協(xié)作的關(guān)系。二陳湯主要的活性化合物大多為黃酮類化合物，具有很好的抗病毒、抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用，如黃芩素可以通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路及阻斷MAPK信號(hào)傳遞等來抑制細(xì)胞增殖，通過抑制NF-κB和JAK2/STAT等途徑，下調(diào)促炎性細(xì)胞因子（TNF-ɑ、IL-6等）水平從而緩解炎癥[7]-[12]。山奈酚、槲皮素均可抑制NF-κB途徑抑制炎癥反應(yīng)，影響環(huán)化酶2、白細(xì)胞介素、MAPKs的表達(dá)，并改變toll樣受體和JAK2/STAT的信號(hào)通路，mTOR、AKT及NF-κB等途徑相關(guān)抑制因子的激活可以下調(diào)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)促炎癥因子（TNF-ɑ、IL-6等）的產(chǎn)生，還通過抑制蛋白激酶B和蛋白激酶磷酸化等達(dá)到抗病毒特性[13]。柚皮素除抑制NF-κB活化、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化外，還可在巨噬細(xì)胞中激活A(yù)kt-Nrf2引起抗氧化反應(yīng)[11]。苜蓿素通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子（如TNF-ɑ、IL-6和IL-17A）水平緩解炎癥[14]。維斯體素通過抑制NF-κB和Erk 1/2通路的激活，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入M2樣極化[15]。

豆甾醇是植物主要甾醇之一，可抑制細(xì)胞中的AKT/mTOR通路同時(shí)誘導(dǎo)凋亡和保護(hù)性自噬[16]。刺芒柄花素是一種植物激素，具有雌激素狀結(jié)構(gòu)，可以通過激活膜雌激素受體GPER顯著提高表皮和真皮層的A20蛋白及其mRNA的表達(dá)，同時(shí)抑制親炎因子TSLP蛋白及其mRNA在體內(nèi)的表達(dá)，A20不僅抑制了NF-κB的活性，而且進(jìn)一步阻止了NF-κB調(diào)節(jié)的各種炎癥因素的釋放，A20也被認(rèn)為是過敏性疾病的潛在治療目標(biāo)[17]。β-谷甾醇是一種天然多酚羥基化合物，是甾醇的主要成分之一，作用于脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以及抑制NF-κB通路，提高抗炎因子IL-10活性的同時(shí)，增強(qiáng)酪氨酸磷酸酶（SHP-1）活性、減小促炎因子和趨化因子活性，還可通過較強(qiáng)的抗氧化活性，下調(diào)人體產(chǎn)生的ROS，經(jīng)嗜酸粒細(xì)胞滲濾等緩和炎癥[18]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫降亩悳委烝H的關(guān)鍵靶點(diǎn)，AKT1是3種密切相關(guān)的血清/三氨酸蛋白激酶（AKT1、AKT2和 AKT3）之一，稱為AKT激酶，能調(diào)節(jié)新陳代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等多種生物過程。MAKP1是NF-κB通路的中央蛋白激酶，MAPK1和MAPK3在 MAPK/ERK 級(jí)聯(lián)中起著重要作用，MAPK級(jí)聯(lián)下游的轉(zhuǎn)錄因子，包括cMyc和SMAD4，并促進(jìn)激活 STAT 家庭成員 STAT1、STAT3、STAT5A 和 STAT5B，MAPK8參與T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化過程，MAPK1、MAPK3和MAPK8均參與細(xì)胞繁殖、分化、生存，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫等過程[19]。JUN參與多種轉(zhuǎn)錄過程和蛋白質(zhì)結(jié)合。IL-6參與多種生物功能，具有免疫力、組織再生和新陳代謝作用。EGFR積極參與MAP激酶活動(dòng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等過程。HSP90AA1參與細(xì)胞周期控制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，如結(jié)合細(xì)菌脂質(zhì)糖（LPS）和調(diào)解 LPS 引起的炎癥反應(yīng)，包括單核細(xì)胞的 TNF 分泌，在線粒體外膜中調(diào)和 TOMM70 與 IRF3 或 TBK1 的關(guān)聯(lián)，促進(jìn)宿主抗病毒反應(yīng)等。

本研究對(duì)二陳湯作用的靶基因進(jìn)行了GO和KEGG富集通路分析，GO分析結(jié)果顯示二陳湯對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、細(xì)胞死亡的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞群增殖的負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)域特定結(jié)合、核受體的活動(dòng)、蛋白激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等分子功能有積極調(diào)控作用，KEGG分析顯示二陳湯主要通過IL-17信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路等免疫調(diào)節(jié)通路下調(diào)炎癥因子表達(dá)、減小促炎因子和趨化因子活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、干擾病毒復(fù)制以及抗氧化來下調(diào)ROS緩解炎癥等多途徑治療腺樣體肥大，此外，還可以抑制蛋白激酶B和蛋白激酶磷酸化等途徑達(dá)到抗病毒特性等。

綜上所述，二陳湯治療AH是通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)控過程，其機(jī)制可能是下調(diào)炎癥因子表達(dá)、減少促炎因子和趨化因子活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、干擾病毒復(fù)制以及抗氧化改善機(jī)體免疫狀態(tài)和抗病毒能力等?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果可以進(jìn)一步進(jìn)行藥理學(xué)驗(yàn)證，挖掘潛在治療目標(biāo)，為臨床應(yīng)用二陳湯治療AH提供一定的理論依據(jù)。