黃酒生物胺的研究進(jìn)展

劉慕妝，任 紅，孫 哲，黃芷珊，鐘先鋒，黃桂東*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；3.廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；4.佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231；5.佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山 528231）

黃酒是中國傳統(tǒng)釀造酒[1]，以稻米、黍米、玉米、小米、小麥等為主要原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成[2]。其含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、低聚糖和微量元素等[3]，被譽(yù)為“液體蛋糕”。黃酒營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，但同時(shí)也會存在一些潛在有害物質(zhì)，生物胺就是其中之一。生物胺是堿性的含氮化合物[4]，在食品尤其是發(fā)酵食品中廣泛存在，它是荷爾蒙、核苷酸、蛋白質(zhì)等生理活性物質(zhì)的前體[5]。適量攝入可以促進(jìn)人體生長代謝、提高免疫力、控制血壓水平和清除自由基等[6-7]，過量攝入則會引起人體多種不良反應(yīng)，如皮疹、瘙癢、惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、頭痛和高血壓等[8]。

黃酒中含有多種生物胺，最為常見的是色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將生物胺分為脂肪胺（腐胺、尸胺、亞精胺、精胺等）、芳香胺（苯乙胺、酪胺等）和雜環(huán)胺（色胺、組胺等）；根據(jù)其組成成分又可以分為兩類：單胺和多胺。單胺主要有酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺等，多胺主要包括精胺和亞精胺等。

生物胺隨黃酒攝入人體后，可在胺類氧化酶的作用下氧化為醛、羧酸等活性較低的氧化產(chǎn)物[9]，而酒精會在一定程度上抑制胺類氧化酶的活性[10]，從而增加了生物胺在人體的積累，使得生物胺的潛在危害增加。因此，控制黃酒中生物胺的含量，已成為提高黃酒生物安全性的重要關(guān)注點(diǎn)之一。本文綜述了黃酒生物胺的合成、代謝途徑及含量水平，分析了影響生物胺形成的因素、控制措施，總結(jié)了黃酒生物胺含量的檢測方法，以期為控制黃酒生物胺含量，規(guī)范生產(chǎn)管理，保障安全生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 黃酒中的生物胺合成、代謝途徑及含量水平

1.1 生物胺的合成機(jī)制

氨基酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成相應(yīng)的生物胺，是發(fā)酵食品中生物胺主要的合成途徑，該反應(yīng)需要在微生物分泌的特異性氨基酸脫羧酶的作用下發(fā)生[11-12]。生物胺的合成機(jī)制如圖1所示，游離氨基酸首先通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從微生物細(xì)胞外運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)，然后在特異性氨基酸脫羧酶催化作用下進(jìn)行脫羧反應(yīng)，生成相應(yīng)的生物胺，最后生物胺再次通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送到微生物細(xì)胞外。除需要有前體物質(zhì)氨基酸和含氨基酸脫羧酶的微生物外，生物胺的合成還需要具有適宜微生物生長以及維持氨基酸脫羧酶活性的環(huán)境條件[13]。

圖1 微生物中生物胺的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of biogenic amines in microorganisms

黃酒生產(chǎn)過程中易形成生物胺，這是由于[14]：①其生產(chǎn)選用蛋白質(zhì)含量豐富的谷物為原料，在黃酒生產(chǎn)過程會產(chǎn)生一定量氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等），為生物胺的形成提供了前體物質(zhì)；②傳統(tǒng)黃酒生產(chǎn)多采用開放式的半固態(tài)發(fā)酵，多種微生物參與了黃酒發(fā)酵過程，其中含有乳酸菌等生物胺產(chǎn)生菌；③黃酒的發(fā)酵溫度和pH條件適宜微生物的生長繁殖和維持氨基酸脫羧酶活性（氨基酸脫羧酶的最適溫度及pH：20～37 ℃、4.04～4.33[15]）。

1.2 黃酒生物胺的代謝途徑

黃酒生物胺的代謝途徑如圖2所示，當(dāng)少量生物胺隨黃酒攝入人體后，可在腸道的胺氧化酶（如單胺氧化酶、二胺氧化酶和多胺氧化酶）的作用下被代謝成醛、羧酸等生理活性較低的產(chǎn)物[16]。然而，當(dāng)生物胺含量過高或胺氧化酶活性受到抑制或干擾時(shí)，生物胺無法被充分代謝，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對人類健康造成嚴(yán)重問題的有毒代謝物[16]。研究發(fā)現(xiàn)，易感體質(zhì)、胃腸道疾病以及藥物和酒精的攝入都會抑制胺氧化酶活性，即使是少量的生物胺也不能有效代謝[17]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)酒精度為12%vol時(shí)，91%的胺類氧化酶活性會受到抑制[18]，這會增強(qiáng)人體對生物胺的易感性。因此，對于酒類中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)比一般食品更加嚴(yán)格。

圖2 生物胺在腸道中的代謝途徑Fig.2 Metabolism pathway of biogenic amines in intestinal tract

1.3 黃酒中生物胺含量水平

食品中生物胺的毒性已被廣泛研究，普遍認(rèn)為，當(dāng)生物胺含量過高時(shí)會引起瘙癢、皮疹，引起惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛，引起頭痛、高血壓等癥狀[8]。色胺、苯乙胺會引起呼吸增加、血壓升高、頭痛等癥狀[19]；酪胺會擴(kuò)張瞳孔、擴(kuò)張臉板組織、引起流淚和唾液分泌等癥狀[20]；組胺會引起胃腸反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉和腹部絞痛等癥狀[21-22]；尸胺、腐胺、亞精胺、精胺可與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)，形成致癌的亞硝基胺，也可作為食品腐敗的指標(biāo)[23]。據(jù)報(bào)道[24]，單次攝入100 mg的酪胺會引發(fā)偏頭痛；單次攝入3 mg 的苯乙胺會引起偏頭痛；單次攝入8～40 mg組胺會導(dǎo)致輕微中毒，單次攝入40 mg 以上組胺會引發(fā)中等中毒癥狀，單次攝入超過100 mg組胺則會導(dǎo)致嚴(yán)重中毒，引發(fā)頭暈、昏厥、口腔灼燒感、無法吞咽和瘙癢等癥狀。

當(dāng)前，國際上針對食品生物胺還沒有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國規(guī)定水產(chǎn)品中組胺含量不得超過50 mg/kg[25]；歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg，酪胺含量不得超過100～800 mg/kg[26]；我國在食品生物胺限量方面的國標(biāo)GB 2733—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動物性水產(chǎn)品》也僅涉及水產(chǎn)品中的組胺，規(guī)定鮐魚、鲹魚等高組胺魚類中的組胺含量≤400 mg/kg，其他魚類中的組胺含量≤200 mg/kg[27]。國外和國內(nèi)對黃酒中生物胺的限量都還未有明確規(guī)定。一些國家規(guī)定了葡萄酒中組胺的含量[28]：澳大利亞和瑞士規(guī)定≤10 mg/L，法國規(guī)定≤8 mg/L，荷蘭規(guī)定≤3.5 mg/L，而德國更加嚴(yán)格，規(guī)定≤2 mg/L。

表1 不同國家或地區(qū)生物胺的限量Table 1 Limited quantity of biogenic amines in different countries or regions

目前，已有許多學(xué)者對黃酒中的生物胺進(jìn)行了分析測定。張敬等[32]對我國市面上32個(gè)葡萄酒樣品、32個(gè)啤酒樣品、12個(gè)黃酒樣品中的生物胺含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，黃酒中總生物胺平均含量達(dá)78.3 mg/L，遠(yuǎn)高于啤酒和葡萄酒中的總生物胺平均值。LU Y M等[33]對我國14個(gè)來自不同產(chǎn)區(qū)的黃酒樣品中生物胺含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，樣品中總生物胺的平均含量為107 mg/L。ZHONG J J等[34]對39個(gè)來自不同廠家的黃酒樣品中生物胺含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，樣品中總生物胺的平均含量可達(dá)115 mg/L，絕大多數(shù)黃酒中的組胺含量低于澳大利亞和瑞士標(biāo)準(zhǔn)（10mg/L），而94.84%的樣品中組胺含量超過德國設(shè)定的在葡萄酒中的最大推薦限值（2 mg/L）。綜上所述，黃酒中的生物胺含量仍需進(jìn)一步的關(guān)注。

2 影響黃酒中生物胺形成的因素

影響黃酒中生物胺形成的主要因素為微生物、氨基酸種類及含量、pH和溫度、生產(chǎn)工藝、貯藏條件等，如圖3所示。

圖3 影響生物胺形成的因素Fig.3 Influencing factors of biogenic amine formation

2.1 釀造過程中微生物對黃酒生物胺形成的影響

乳酸菌是黃酒釀造過程中影響生物胺形成的重要因素，它大部分來源于麥曲和酒母，也有少部分來源于環(huán)境以及生產(chǎn)時(shí)所用的器具設(shè)備[15]。研究表明，乳酸菌是黃酒中生物胺的主要產(chǎn)生菌之一，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）等[35-36]。張無疾等[37]分析了黃酒前酵生產(chǎn)過程中主要微生物對生物胺形成的影響，結(jié)果表明，乳酸菌總數(shù)與生物胺含量呈正相關(guān)，說明乳酸菌是黃酒前酵過程中影響生物胺形成的重要微生物。

黃酒中的組胺通常被認(rèn)為是由乳酸菌產(chǎn)生，其他細(xì)菌產(chǎn)生很少或尚未引起相關(guān)重視。ZHANG J等[38]研究結(jié)果表明，黃酒曲中的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）是中國黃酒中組胺形成的重要原因。因此，在發(fā)酵早期抑制腸桿菌科（Enterobacteriaceae）生長，是防止中國黃酒中組胺過量形成的途徑之一。

2.2 氨基酸種類及含量對黃酒生物胺形成的影響

生物胺形成的前體物質(zhì)是氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等），其含量對生物胺的形成有一定影響。許祿[39]分析黃酒不同釀造時(shí)期氨基酸總量和生物胺總量，發(fā)現(xiàn)前酵期間氨基酸總量與生物胺總量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。黃酒中氨基酸主要來源是米飯和麥曲中所含蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶分解后產(chǎn)生以及酵母等微生物自溶后內(nèi)容物釋放產(chǎn)生。蛋白質(zhì)水解得到前體氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、鳥氨酸、谷氨酸、精氨酸等）含量增加，生物胺形成隨之增加[15]。因此，可通過控制蛋白酶水解，達(dá)到控制前體氨基酸含量，進(jìn)而達(dá)到控制黃酒中生物胺含量的目的。

2.3 黃酒生產(chǎn)及貯藏過程中的pH和溫度對黃酒生物胺形成的影響

黃酒生產(chǎn)過程中的環(huán)境因素會對生物胺的生成會造成一定影響，這是由于它們會影響微生物生長以及氨基酸脫羧酶活性，其中影響較大的兩個(gè)因素是pH和溫度。

pH是影響生物胺形成的關(guān)鍵因素之一。pH對生物胺的形成有兩方面的影響，一方面，酸性會刺激乳酸菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生堿性的生物胺保護(hù)自身生長繁殖[40-41]；另一方面，酸性也會導(dǎo)致微生物生長繁殖及氨基酸脫酸酶的活性受到抑制，影響氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺的脫羧反應(yīng)，生物胺的形成受到抑制[42]。生物胺的最終含量是由二者平衡決定。

溫度是影響黃酒生物胺含量的另一關(guān)鍵因素，在發(fā)酵過程中，生物胺形成最適宜的溫度是20～37 ℃，低于5 ℃或高于40 ℃時(shí)，微生物生長及氨基酸脫羧酶活性均受到一定程度的抑制，生物胺的積累變緩[43]。在貯藏過程中，溫度也會影響生物胺含量，貯藏溫度越高越利于生物胺的積累。欒同青[44]探究了4 ℃、20 ℃及37 ℃三種貯藏溫度對黃酒中生物胺含量的影響。結(jié)果表明，在三種溫度下貯藏時(shí)，生物胺含量增加，其中在37 ℃時(shí)，生物胺含量增幅最大，20 ℃次之、4 ℃生物胺含量最小。因次，將溫度控制在適宜范圍，是控制黃酒生物胺含量的重要措施之一。

3 黃酒生物胺的控制措施

3.1 改良相關(guān)菌株

3.1.1 篩選低產(chǎn)生物胺的乳酸菌

乳酸菌是黃酒中產(chǎn)生生物胺的重要微生物，對其進(jìn)行改良可以控制生物胺的產(chǎn)生。在黃酒生產(chǎn)過程中，選用具有降生物胺或低產(chǎn)（不產(chǎn)）生物胺的乳酸菌來發(fā)酵黃酒可以控制黃酒中生物胺的產(chǎn)生。LIU S P等[45]從某地黃酒發(fā)酵液中篩選出不產(chǎn)生物胺的三株乳酸桿菌，分別是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JN01、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）JN02、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）JN013。其中，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JN01接種于發(fā)酵醪時(shí)，生物胺濃度顯著降低24%。XIONG Z Q等[46]從黃酒樣品中分離出不產(chǎn)生物胺的杜蘭腸球菌（Enterococcus durans）AR315，結(jié)果表明，在浸米階段和發(fā)酵階段添加杜蘭腸球菌（Enterococcus durans）AR315，總生物胺水平分別較對照顯著降低45.1%和27.6%（P＜0.05）。因此，采用不產(chǎn)生物胺的乳酸菌作為發(fā)酵劑是一種顯著減少生物胺形成的有效策略，具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。

3.1.2 篩選能分泌胺類氧化酶的乳酸菌

利用低產(chǎn)或不產(chǎn)生物胺，且對生物胺具有降解作用的菌株來發(fā)酵黃酒，目前已報(bào)道多種能分泌胺類氧化酶的乳酸菌，如沙克乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[47]。魏曉璐等[48-53]研究均表明，從黃酒發(fā)酵過程中篩選出的某些植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），可產(chǎn)生胺氧化酶，對發(fā)酵醪中的生物胺具有降解作用，這些菌可以作為降低發(fā)酵食品中生物胺的備選功能菌，以提高發(fā)酵食品的安全性。

3.1.3 添加能抑制產(chǎn)生物胺菌株生長的外源功能性微生物

在發(fā)酵系統(tǒng)中，使用外源功能性微生物來調(diào)節(jié)生物胺含量是一種常見的方法。外源功能性微生物對生物胺生成的相關(guān)菌株有抑制作用，可以起到控制生物胺生成的作用。XIA X L等[54-55]研究表明，植物乳桿菌和木糖葡萄球菌以1∶2的比例添加到黃酒發(fā)酵醪時(shí)，乳酸菌和葡萄球菌屬會抑制生物胺產(chǎn)生菌的生長，達(dá)到抑制生物胺形成的作用。邢旋等[56]從麥曲中篩選分離出不產(chǎn)生物胺的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），這種菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素，細(xì)菌素是一類蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，它們由某些細(xì)菌產(chǎn)生，具有一定的抗菌活性，能抑制多種產(chǎn)生物胺菌的生長繁殖，能減少黃酒生物胺的形成。郝淑月等[57]從黃酒麥曲中分離篩選Pontibacter beigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25。Pontibacter beigonshangensis能夠誘導(dǎo)戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）M25產(chǎn)生細(xì)菌素，對黃酒中某些產(chǎn)生物胺菌有抑制作用。Pontibacterbeigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25自身不產(chǎn)生物胺。Pontibacter beigonshangensis和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）M25制備強(qiáng)化功能曲來釀造黃酒，可使黃酒中的生物胺含量降低29.8%。

3.2 改進(jìn)浸米工藝

傳統(tǒng)工藝釀造黃酒過程中，首先進(jìn)行浸米。一方面，浸米階段常在露天敞口環(huán)境下進(jìn)行，這會使環(huán)境中的部分的微生物進(jìn)入米漿水中，其中包括產(chǎn)生物胺的菌；另一方面，較長的浸米時(shí)間會使大米中的糊粉層進(jìn)入米漿水并隨之進(jìn)入發(fā)酵醪，糊粉層中含有的蛋白質(zhì)可在相應(yīng)酶的作用下分解為大量氨基酸。兩方面都促使了生物胺的生成。據(jù)報(bào)道[48，50]，浸米階段是黃酒發(fā)酵醪中生物胺的主要來源，發(fā)酵醪中生物胺含量與浸米水和浸泡大米中生物胺含量均呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)R2分別為0.83和0.92），且浸泡大米對發(fā)酵醪中總生物胺含量的方差貢獻(xiàn)率為71.15%，表明控制浸米環(huán)節(jié)生物胺的積累是降低黃酒生物胺含量的一個(gè)有效途徑。

在生產(chǎn)過程中可以通過改良浸米工藝來達(dá)到控制生物胺含量的作用，魏曉璐[48]采用不浸米的淋米蒸飯工藝進(jìn)行蒸飯并添加4%的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）擴(kuò)配液進(jìn)行降低黃酒生物胺含量的研究。結(jié)果表明，淋米且添加乳酸菌釀造工藝有效地降低了生物胺含量，增加了酯類物質(zhì)含量，使得黃酒更加綿柔。該工藝可在一定程度上使米漿水的排放量減少，能耗及環(huán)境污染降低，具有一定的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

劉彩霞[50]開發(fā)了乳酸菌循環(huán)酸化浸米工藝，將植物乳桿菌以7.5%的比例添加至浸米初始階段，浸米過程中形成了以植物乳桿菌為主導(dǎo)的微生物區(qū)系，使得浸米水中的生物胺含量降低了93.84%。將浸泡大米落料發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，相較于傳統(tǒng)浸米，循環(huán)浸米釀制黃酒中生物胺含量降至1/12。該工藝具有一定的參考價(jià)值。

3.3 控制氨基酸含量

氨基酸作為合成生物胺的前體物質(zhì)，對其含量進(jìn)行控制，也可對生物胺含量起到一定的控制作用。黃酒發(fā)酵過程中氨基酸可由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，因此可以通過控制蛋白酶活性來達(dá)到控制氨基酸含量的目的。由PEP4基因編碼的酵母蛋白酶A，是一種天冬氨酸蛋白酶，是酵母菌中重要的蛋白酶[58]，在發(fā)酵后期，可水解蛋白質(zhì)為生物胺的產(chǎn)生提供氨基酸?；谝陨显?，GUO X W等[59]通過敲除黃酒釀造酵母PEP4基因來達(dá)到降生物胺含量的目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，該敲除菌株的蛋白酶A活性和氨基酸濃度顯著降低，生物胺產(chǎn)量從180.1 mg/L下降到134.2 mg/L，降低了25.5%，其中酪胺、尸胺和組胺質(zhì)量濃度也分別下降了57.5%、24.6%和54.3%。研究結(jié)果為降低黃酒發(fā)酵過程中生物胺的產(chǎn)生提供了新策略。

值得注意的是，氨基酸同時(shí)也賦予黃酒豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，降低氨基酸含量的同時(shí)可能會影響黃酒的營養(yǎng)價(jià)值，因此，在發(fā)酵過程中，需以高質(zhì)量黃酒生產(chǎn)為前提，平衡氨基酸和生物胺兩者之間的關(guān)系。

4 生物胺的檢測方法

4.1 高效液相色譜法

目前黃酒生物胺含量分析檢測的主要手段是高效液相色譜法，它具有分析速度快、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確等特點(diǎn)[61]，是我國食品生物胺含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[62]。由于黃酒成分復(fù)雜，直接檢測會造成干擾，需對黃酒樣品進(jìn)行前處理。黃酒樣品的前處理主要是提取、凈化、衍生。常用的提取試劑有高氯酸[63]、鹽酸[64]、三氯乙酸等[65]。凈化是指清除提取液中不需要或有害的雜質(zhì)，使生物胺得到純化，其方法主要有液-液萃取、液-液微萃取、固相萃取[66]。由于高效液相色譜大多連接紫外或熒光檢測器，而大部分生物胺沒有熒光或紫外發(fā)色基團(tuán)，因此常需要對樣品中的生物胺進(jìn)行衍生化處理后才能對其進(jìn)行檢測。丹磺酰氯是目前生物胺定性和定量分析中最為常用的一種衍生試劑，此外，還有苯甲酰氯、鄰苯二甲醛、異硫氰酸苯酯等[67-69]。

HUANG K J等[69]采用超聲輔助分散液-液微萃取結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測技術(shù)，對黃酒樣品中章魚胺、酪胺和苯乙胺三種生物胺進(jìn)行了提取和測定。此方法有效提高了提取效率，并減少了有機(jī)溶劑消耗量。YE W等[70]采用鹽析輔助液-液萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，測定了酒精飲料中生物胺的含量。傳統(tǒng)液-液萃取的萃取劑為水和乙腈，該方法在水和乙腈的基礎(chǔ)上加入了硫酸銨進(jìn)行鹽析反應(yīng)，降低了萃取劑的浪費(fèi)并且使樣品中的雜質(zhì)得到有效去除，方法回收率可達(dá)94.5%，能夠較準(zhǔn)確的檢測生物胺含量。ZHANG Y等[71]采用固相萃取結(jié)合高效液相色譜技術(shù)，測定了黃酒中的生物胺的含量。使用綠洲MCX濾筒的固相萃取程序?qū)λ猩锇凤@示出卓越的凈化效率，并有效地消除了干擾。所得方法經(jīng)過充分驗(yàn)證，顯示出良好的檢測限、準(zhǔn)確度和精密度。綜上所述，高效液相色譜法較為準(zhǔn)確、穩(wěn)定，能夠達(dá)到生物胺定性和定量分析的要求。

4.2 薄層色譜法

薄層色譜法是一種微量、簡便的檢測方法，不需昂貴設(shè)備，可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，它兼?zhèn)淞思埳V和柱色譜的優(yōu)點(diǎn)，適合小量樣品的分離[72]。李燕君[72]優(yōu)化并建立了一種薄層層析法，測定了黃酒中9種生物胺的含量，該方法的檢出限0.125～5.000 μg/mL，定量限5～20 μg/mL，平均加標(biāo)回收率88.4%～114.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.1%～9.8%。能達(dá)到與高效液相色譜相似的效果。生物胺定性、定量分析的薄層色譜方法學(xué)研究，對于后續(xù)開發(fā)和建立簡便、快速、高通量的生物胺檢測方法有一定價(jià)值。

4.3 液質(zhì)聯(lián)用法

高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法不需要衍生化，靈敏度高，檢測限低，分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[73]，但檢測成本高。王可利等[74]建立了測定黃酒中6種生物胺的液質(zhì)聯(lián)用法，提高了大批量樣品檢測前處理效率，同時(shí)解決了檢測中出現(xiàn)的假陽性問題。在食品安全質(zhì)量控制和研究要求方面，需要高靈敏度的檢測方法，以檢測出生物胺的細(xì)微變化。因此，液質(zhì)聯(lián)用法是檢測低濃度生物胺最合適的方法[75]。

4.4 離子色譜法

離子色譜法是利用各離子之間對離子交換樹脂親和力具有差異的原理進(jìn)行分離，可用于分析陰離子、陽離子、極性及部分弱極性的有機(jī)化合物。生物胺具有陽離子特性，因此，比較適合使用離子色譜法進(jìn)行分離。史亞利[76]用親水性很強(qiáng)的新型陽離子交換柱IonPac CS18+CG18柱作為分離柱，電導(dǎo)檢測器對黃酒中七種生物胺進(jìn)行了檢測，該方法檢測限低，適用于黃酒生物胺的檢測。與柱前衍生的高效液相色譜法相比，離子色譜法不需要對樣品中的生物胺進(jìn)行衍生處理，避免了衍生反應(yīng)造成的副產(chǎn)物干擾，縮短了分析時(shí)間，提高了檢測分析的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。然而，離子色譜法需要使用較為大型、昂貴的離子色譜儀，成本較高，且攜帶不便，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

4.5 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是一種以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，是測定食品中生物胺的較好方法。該技術(shù)快速、高效、試劑消耗低，且遷移時(shí)間低于液相色譜，但與其他檢測方法相比靈敏度較低[77]。KOVáCS A等[78]采用膠束電動毛細(xì)管電泳分離，紫外檢測器檢測葡萄酒等食品中的7 種生物胺，結(jié)果顯示該方法靈敏度高、分離時(shí)間短。CORTACERO R S等[79]建立了毛細(xì)管電泳法測定啤酒中10 種生物胺含量的檢測方法，該方法酒類生物胺的檢測中具有良好的效果，而且操作簡單，已在啤酒中生物胺的檢測中得到廣泛應(yīng)用。

4.6 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種準(zhǔn)確、靈敏、具有良好標(biāo)準(zhǔn)化潛力的檢測方法[80]。免疫識別原理是將生物胺作為抗原，利用生物識別元素與抗原結(jié)合后進(jìn)行含量檢測。常用的生物識別元素有抗體、核酸適配體、肽、分子印跡聚合物等[81]。袁利鵬等[82]將組胺衍生化，制備出可特異性識別組胺衍生物的抗體，然后利用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法測定魚、蝦和貝類中組胺含量。結(jié)果表明，該方法的檢出限為0.1 ng/mL，回收率為98.9%～130.1%。該方法可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

表2 生物胺常用檢測方法Table 2 Common detection methods of biogenic amines

5 小結(jié)與展望

黃酒作為我國的傳統(tǒng)發(fā)酵酒，其市場前景廣闊。生物胺作為其中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)性物質(zhì)，仍有許多問題值得探討：①目前我國還沒有關(guān)于黃酒中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，需在這方面開展系統(tǒng)研究。通過對大批量黃酒樣品的檢測分析，并結(jié)合生物胺毒性閾值等相關(guān)研究，評估生物胺的可能攝入風(fēng)險(xiǎn)性，建立相關(guān)的法律法規(guī)；②目前對黃酒中生物胺的形成機(jī)理研究尚未深入，對生物胺產(chǎn)生菌還未有效了解，需加大該方面的研究，為控制黃酒生物胺含量提供更多思路；③黃酒生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)重視黃酒生產(chǎn)管理，提高質(zhì)量和安全性；④高校及研究機(jī)構(gòu)應(yīng)加大對黃酒檢測方法的研究，對現(xiàn)有的檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，建立準(zhǔn)確、快速、高通量的生物胺檢測方法，保障黃酒食用品質(zhì)和安全性。