基于HPLC指紋圖譜研究60Co-γ輻射滅菌對(duì)燒傷靈酊有效成分的影響

吳 妹，林觀昊，黃 妹

（?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，海南 ?？?570100）

中藥成分復(fù)雜多樣，微生物含量高，滅菌操作是中藥及其制劑生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年，中藥輻照滅菌技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。60Co-γ輻射滅菌具有可常溫滅菌、可對(duì)完整包裝滅菌、可靈活調(diào)整滅菌劑量進(jìn)行連續(xù)滅菌等優(yōu)勢(shì)[1-2]，在中藥滅菌中應(yīng)用廣泛。

燒傷靈酊是由虎杖、黃柏、冰片三味中藥材原粉經(jīng)加工而成的臨床常用外用酊劑，具有清熱燥濕、解毒消腫、收斂止痛之功效，臨床主要用于I、II度燒傷[3]。方中以具有清熱利濕、活血通絡(luò)功效的虎杖為君藥，其主要物質(zhì)基礎(chǔ)為二苯乙烯類(lèi)（白藜蘆醇和虎杖苷）、蒽醌類(lèi)（大黃素、大黃素甲醚）及黃酮類(lèi)等[4-5]。臣藥黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，鹽酸小檗堿為其抗菌的有效成分[6-7]，2020年版《中國(guó)藥典》將其作為含量測(cè)定指標(biāo)成分。2015年11月國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布了《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》，規(guī)定中藥采用輻照滅菌需遵守“安全、有效、穩(wěn)定”的原則。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道60Co-γ輻射滅菌對(duì)燒傷靈酊中化學(xué)成分穩(wěn)定性有影響。中藥指紋圖譜技術(shù)具有整體性、特征性等特點(diǎn)，能較全面地反映中藥復(fù)方制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，可更全面客觀地評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑的輻照滅菌技術(shù)[8-9]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了燒傷靈酊的指紋圖譜，確定了共有指紋峰，并對(duì)虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿5個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定。通過(guò)比較不同60Co-γ輻照劑量對(duì)燒傷靈酊有效成分穩(wěn)定性的影響，確定合適的60Co-γ輻射滅菌輻照劑量，以期為該藥物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），包括在線脫氣機(jī)，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，VWD-G1314C檢測(cè)器，Agilent-ChemStation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；60Co-γ射線輻照設(shè)備（咸陽(yáng)華科輻照技術(shù)有限公司）；AUW-220D型電子天平（d=0.01 mg，日本島津公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率500 W，頻率50 kHz）。

1.2 試藥與試劑

虎杖苷（批號(hào)：111575-201603，含量：87.3 %），大黃素（批號(hào)：110756-201913，含量：96.0 %），白藜蘆醇（批號(hào)：111535-201703，含量：99.4 %），大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817，含量：99.2 %），鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201814，含量：86.7 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)：190914），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)：190328），pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)：191026，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司）；甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

燒傷靈酊（河北奧星集團(tuán)藥業(yè)有限公司，規(guī)格：50 ml/瓶，編號(hào)：S1～S11，批號(hào)：20190111，20190216，20190309，20190426，20190524，20190611，20190906，20190923，20191015，20191118，20191210）。

2 方法與結(jié)果

2.1 輻照滅菌

《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》（2015年版）規(guī)定中藥60Co-γ射線輻射滅菌劑量應(yīng)不大于10 kGy，故本研究分別以 0，3，6，9 kGy劑量輻照處理樣品。

2.2 滅菌效果檢查

參照《中國(guó)藥典》2 0 2 0年版四部通則1105“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”進(jìn)行不同輻照劑量前后樣品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)考察。取11批輻照前后燒傷靈酊，制成1:10，1:100，1:1000的待測(cè)液，依法測(cè)定。需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。說(shuō)明60Co-γ射線輻射滅菌處理后，需氧菌及霉菌和酵母菌總數(shù)均大幅度減少，且符合中國(guó)藥典[10]規(guī)定：皮膚給藥制劑中需氧菌總數(shù)不得超過(guò)102cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過(guò)102cfu/g。結(jié)果表明60Co-γ射線輻射對(duì)燒傷靈酊有很好的微生物殺滅作用。

表1 燒傷靈酊輻照前后含菌量測(cè)定結(jié)果

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑配制成虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿濃度分別為204.38，351.07，189.85，233.69，92.16 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 取燒傷靈酊3瓶，混勻，精密量取5 ml，置100 ml棕色量瓶中，加甲醇-稀鹽酸（99:1）溶液80 ml，20 ℃超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）40 min，取出，再用甲醇-稀鹽酸（99:1）溶液定容至100 ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)[11-13]

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，15 %A；20～25 min，15 %→30 %A；25～35 min，30 %→55 %A；35～50 min，55 %→85 %A；50～60 min，85 %→15 %A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm（20～25 min，鹽酸小檗堿），287 nm（0～20 min，虎杖苷；25～60 min，大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚）；流速1.0 ml/min；柱溫28 ℃，進(jìn)樣量10 μl。按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果各色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5500，系統(tǒng)適用性良好。

2.5 燒傷靈酊HPLC指紋圖譜研究

2.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取燒傷靈酊（批號(hào)：20190611，輻照劑量：0 kGy），按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012A版）軟件處理，計(jì)算7次采集的指紋圖譜（以0 h進(jìn)樣的色譜圖為參照?qǐng)D譜）相似度，結(jié)果各指紋圖譜間相似度均大于0.96，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取燒傷靈酊（批號(hào)：20190611，輻照劑量：0 kGy）6份，按2.3.2項(xiàng)下方法處理，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012A版）軟件處理，計(jì)算6次采集的指紋圖譜（以第1次進(jìn)樣的色譜圖為參照?qǐng)D譜）相似度，結(jié)果各指紋圖譜間相似度均大于0.95，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 燒傷靈酊指紋圖譜的建立 取11批經(jīng)0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊供試品適量，按2.3.2項(xiàng)下方法處理，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。分別將不同劑量處理的11批燒傷靈酊色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012A版）軟件，建立指紋圖譜，設(shè)置時(shí)間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點(diǎn)校正，全譜段峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜。指紋圖譜及共有模式見(jiàn)圖1。

圖1 不同劑量輻照后燒傷靈酊HPLC指紋圖譜和混合對(duì)照品圖譜

2.5.4 指紋圖譜共有峰指認(rèn)及相似度評(píng)價(jià) 取供試品指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012A版）軟件，以未輻照（0 kGy）樣品圖譜為參照，經(jīng)多點(diǎn)校正，全譜段峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，分別計(jì)算11批次樣品經(jīng)不同劑量輻照后指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 相似度計(jì)算結(jié)果

經(jīng)0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊指紋圖譜，均可確定22個(gè)共有色譜峰，且共有峰總面積占色譜圖總峰面積的95 %以上，因此確定這22個(gè)色譜峰為燒傷靈酊指紋圖譜共有峰，與2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)3號(hào)峰為虎杖苷、7號(hào)峰為鹽酸小檗堿、9號(hào)峰為白藜蘆醇、14號(hào)峰為大黃素、16號(hào)峰為大黃素甲醚。

2.6 燒傷靈酊中5個(gè)成分定量分析

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，12 ml，分別置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。取上述系列混合對(duì)照品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/ml），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，繪制各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果表明：虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度與峰面積在試驗(yàn)范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系；取混合對(duì)照溶液，用甲醇倍比稀釋?zhuān)?.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別取峰面積信噪比為10倍（S/N=10）或3倍（S/N=3）時(shí)相應(yīng)對(duì)照品濃度為定量限（LOQ）和檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 5個(gè)成分線性回歸方程

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取2.3.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖并計(jì)算5個(gè)成分峰面積RSD值。結(jié)果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿峰面積RSD（n=5）分別為0.16 %，0.37 %，0.42 %，0.29 %，0.51 %，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.3.2項(xiàng)下燒傷靈酊供試品（批號(hào)：20190611，輻照劑量：0 kGy）溶液，分別放置0，3，6，9，15，20，24 h，按2.4項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖并計(jì)算5個(gè)成分峰面積RSD值。結(jié)果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿峰面積的RSD（n=7）分別為0.78 %，0.69 %，0.75 %，0.89 %和1.01 %，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取燒傷靈酊供試品（批號(hào)：20190611，輻照劑量：0 kGy）6份，按2.3.2項(xiàng)下方法處理，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并計(jì)算5個(gè)成分含量及相應(yīng)RSD值。結(jié)果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿的含量平均值分別為0.4537，0.5451，0.4115，0.5023，0.2042 mg/ml，RSD（n=6）分別為0.89 %，0.78 %，0.91 %，0.97 %，1.03 %，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取燒傷靈酊供試品（批號(hào)：20190611，輻照劑量：0 kGy）9份，每份2.50 ml，分為3組，每組3份，每組按虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿含量的80 %、100 %和120 %精密加入混合對(duì)照品，按2.3.2項(xiàng)下方法處理，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并計(jì)算各有效成分回收率。結(jié)果虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.58 %，100.03 %，99.73 %，99.56 %，99.09 %，RSD分別為0.57 %，0.88 %，0.98 %，0.99 %，0.86 %（n=9），表明本方法回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 燒傷靈酊中5個(gè)成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.6.6 樣品測(cè)定 分別取11批經(jīng)0，3，6，9 kGy劑量輻照處理的燒傷靈酊供試品，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算5個(gè)成分含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 燒傷靈酊5個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究采用DAD檢測(cè)器在190～400 nm掃描燒傷靈酊光譜，結(jié)果鹽酸小檗堿在265 nm處，虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇及大黃素甲醚在287 nm處有最大吸收，因此采用287 nm（0～20 min）、265 nm（20～25 min）、287 nm（25～60 min）作為燒傷靈酊指紋圖譜分析及5個(gè)成分含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。在流動(dòng)相選擇時(shí)，先后考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1 %磷酸、甲醇-0.5 %磷酸、乙腈-0.1 %磷酸和乙腈-0.5 %磷酸6種流動(dòng)相系統(tǒng)，最后選擇乙腈-0.5 %磷酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相，得到的指紋圖譜色譜峰數(shù)量最多；還對(duì)色譜柱Waters XTERRA C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）進(jìn)行了考察，結(jié)果以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離色譜峰基線平穩(wěn)，分離效果好。

3.2 結(jié)果分析

60Co-γ輻照滅菌是利用γ射線直接或間接作用于生物分子，通過(guò)破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，從而抑制或殺滅微生物[14]。本文按《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定，中藥最大輻照滅菌劑量不超過(guò)10 kGy的原則，選定3，6，9 kGy 3個(gè)輻照劑量對(duì)燒傷靈酊進(jìn)行輻照處理，考察60Co-γ輻照滅菌對(duì)其指紋圖譜及化學(xué)成分含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)不同劑量輻照處理后的樣品指紋圖譜共有峰數(shù)量沒(méi)有變化；經(jīng)3，6 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均大于0.975，而經(jīng)9 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度平均值僅為0.8223。采用SPSS 22.0軟件對(duì)5個(gè)化學(xué)成分的含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)，分析5個(gè)化學(xué)成分經(jīng)3，6，9 kGy輻照滅菌后與的含量變化。結(jié)果顯示輻照劑量為6 kGy及以下時(shí)，虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)輻照劑量達(dá)9 kGy時(shí)，白藜蘆醇和大黃素甲醚的含量較未輻照時(shí)分別降低63.36 %和79.65 %，含量變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇含多個(gè)羥基和烯鍵，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在γ射線作用下發(fā)生異構(gòu)化降解，部分轉(zhuǎn)化為虎杖苷，導(dǎo)致虎杖苷的含量較未輻照時(shí)有所增加[15]；而具有苯甲氧基結(jié)構(gòu)的大黃素甲醚，在γ射線輻照下易發(fā)生氫化反應(yīng)，含量降低[16]。

4 結(jié)論

本研究建立的指紋圖譜及含量測(cè)定方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可用于分析經(jīng)不同劑量輻照滅菌后的燒傷靈酊指紋圖譜和虎杖苷、大黃素、白藜蘆醇、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿5個(gè)化學(xué)成分含量測(cè)定。研究結(jié)果顯示燒傷靈酊60Co-γ輻照滅菌劑量不得超過(guò)6 kGy，為燒傷靈酊采用60Co-γ輻照滅菌可行性提供理論參考。