蠶沙中葉黃素和β-胡蘿卜素的含量測(cè)定及提取條件優(yōu)化

鄭倩倩，王小芳，路麗娟，張 淼，宋 莎，趙艷普

（石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050000）

蠶沙，原名“原蠶屎”，為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus的干燥糞便[1]?！侗静菥V目》曰：“蠶沙用曬干，淘凈再曬，可久收不壞”，可治腸鳴，熱中消渴，風(fēng)癮疹，頭風(fēng)，風(fēng)赤眼等癥，并可用于去風(fēng)除濕、跌撲傷損[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蠶沙具有抗菌消炎、止血、和胃化濕、抗腫瘤、降血糖的作用，并可用于小兒急性蕁麻疹、糖尿病、缺鐵性貧血的治療[3-8]。

蠶沙化學(xué)成分豐富多樣，包括葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素、果膠、黃酮、粗蛋白及微量元素等有效成分[9-10]。葉黃素為一種天然色素，屬四萜類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果、某些藻類生物內(nèi)，具有保護(hù)視覺(jué)、預(yù)防白內(nèi)障、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防動(dòng)脈硬化等功效[11-13]。β-胡蘿卜素屬類胡蘿卜素，可預(yù)防白內(nèi)障、清除自由基、保護(hù)心血管系統(tǒng)，還有抗衰老，提高免疫力等功效[14-16]，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

本研究建立蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素2種成分含量測(cè)定的方法，并采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取條件，為蠶沙的質(zhì)量控制提供參考，并為其開發(fā)利用提供支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Mettler XS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；超聲清洗機(jī)（德國(guó)Elma公司）。

1.2 試藥與試劑

葉黃素對(duì)照品（美國(guó)ChromaDex公司，批號(hào)：00012453-0646）；β-胡蘿卜素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100445-201802）；甲醇，乙腈，二氯甲烷（色譜純，美國(guó)Merck公司）；丙酮，無(wú)水乙醇（分析純，天津科密歐試劑公司）；抗壞血酸（分析純，天津科密歐試劑公司）；水（一級(jí)水，電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

1.3 藥材

20批蠶沙藥材，產(chǎn)地分別為浙江（5批）、四川（8批）、江蘇（5批）、廣東（2批），經(jīng)石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心畢飛霞（副主任藥師）鑒定為蠶沙。見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 避光操作。分別精密稱取葉黃素對(duì)照品19.7 mg、β-胡蘿卜素21.6 mg，置同一10 ml棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成葉黃素濃度為1.97 mg/ml、β-胡蘿卜素濃度為2.16 mg/ml的混合溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。-20 ℃下密封保存。將上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液稀釋10倍，作為混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 避光操作。取CS-8樣品，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置25 ml棕色量瓶中，加1 %抗壞血酸水溶液5 ml，加丙酮適量，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用丙酮補(bǔ)足至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

全程避光操作。色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇（A）-乙腈（B）-二氯甲烷（C）-水（D）為流動(dòng)相，梯度洗脫，變換檢測(cè)波長(zhǎng)（442，450 nm），柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μl。梯度洗脫程序見(jiàn)表2。葉黃素、β-胡蘿卜素混合對(duì)照品、蠶沙樣品和空白溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖譜

表2 梯度洗脫程序

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇適量，分別制成含葉黃素0.0197，0.0985，0.197，0.394，1.97 mg/ml，含β-胡蘿卜素0.0216，0.108，0.216，0.432，2.16 mg/ml的混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程：葉黃素：y=792 170x+9859，r=0.9999；β-胡蘿卜素：y=281 450x-10.036，r=0.9998。表明葉黃素在0.197～19.7 μg范圍內(nèi)、β胡蘿卜素在0.216～21.6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度考察 取CS-8樣品1份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素含量的RSD，結(jié)果分別為0.5 %，0.6 %，表明本方法精密度良好。

2.3.3 取CS-8樣品6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素含量的RSD，結(jié)果為0.6 %，0.5 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取CS-8樣品1份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別于0，3，6，9，15，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積值，計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素含量的RSD，分別為1.4 %，1.6 %。表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.3.5 準(zhǔn)確度考察 采用加樣回收法，取已知含量的蠶沙粉末樣品9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入50 %，100 %，150 %濃度混合對(duì)照品溶液，再按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。葉黃素平均回收率為98.79 %，RSD為1.9 %，β-胡蘿卜素平均回收率為100.39 %，RSD為1.9 %，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 葉黃素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 β-胡蘿卜素回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素提取方法研究

3.1 單因素考察

3.1.1 提取溶劑篩選 避光操作。取CS-8樣品4份，粉碎（過(guò)三號(hào)篩），混勻，取約0.5 g，精密稱定，分別置25 ml棕色量瓶中，加入1 %抗壞血酸水溶液5 ml，再分別加入甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃適量，搖勻，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，分別用甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃定容至刻度。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算4份樣品中葉黃素、β-胡蘿卜素的提取率，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知應(yīng)用丙酮作溶劑，葉黃素、β-胡蘿卜素的提取率最高，分別為98.21 %，96.46 %。因此選擇丙酮作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑對(duì)蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素提取率的影響

3.1.2 1 %抗壞血酸加入量考察 避光操作。取CS-8樣品4份，粉碎（過(guò)三號(hào)篩），混勻，取約0.5 g，精密稱定，每份0.5 g，置于25 ml棕色量瓶中，分別加入1 %抗壞血酸水溶液0，2，5，8 ml，再以丙酮定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素的提取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。可知1 %抗壞血酸加入量為5 ml時(shí)，葉黃素、β-胡蘿卜素提取率達(dá)最高，分別為98.09 %，96.32 %，因此選擇加入1 %抗壞血酸水溶液5 ml。

圖3 1 %抗壞血酸溶液加入量對(duì)葉黃素、β-胡蘿卜素提取率的影響

3.1.3 料液比考察 避光操作，取CS-8樣品4份，每份0.5 g，分別置于10，20，25，50 ml棕色量瓶中，所有樣品均先加入1 %抗壞血酸的水溶液5 ml，以丙酮為提取溶劑，定容至刻度，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，考察料液比1:20，1:40，1:50，1:100 4種比例對(duì)蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4?？芍弦罕葹?:50葉黃素、β-胡蘿卜素提取率最大，分別為99.09 %，97.21 %。

圖4 不同料液比對(duì)葉黃素、β-胡蘿卜素提取率的影響

3.1.4 提取溫度的考察 避光操作。取CS-8樣品，每份0.5 g，分別置25 ml棕色量瓶中，加入1 %抗壞血酸水溶液5 ml，再加入丙酮至刻度，搖勻，分別在20，30，40，50 ℃超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算葉黃素、β-胡蘿卜素提取率，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨溫度升高，葉黃素、β-胡蘿卜素提取率升高，40 ℃時(shí)達(dá)最大，分別為98.18 %，95.07 %。

圖5 不同提取溫度對(duì)葉黃素、β-胡蘿卜素提取率的影響

3.2 正交試驗(yàn)

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，取CS-8樣品，以料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，以葉黃素、β-胡蘿卜素提取率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交表，以優(yōu)化蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素的提取方式。因素與水平見(jiàn)表5，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 因素與水平

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)比較極差（R）值大小，得出各因素影響大小順序?yàn)椋篈＞B＞C，即料液比影響最大，提取溫度次之，提取時(shí)間影響最小，分別以葉黃素含量、β-胡蘿卜素含量為變量，對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7、表8。

表7 方差分析結(jié)果（以葉黃素提取率為變量）

表8 方差分析結(jié)果（以β-胡蘿卜素提取率為變量）

由表7、表8可知，料液比對(duì)葉黃素、β-胡蘿卜素的含量影響顯著（P＜0.05），而提取溫度和提取時(shí)間對(duì)二者含量影響不顯著（P＞0.05）。依據(jù)表6，綜合分析，選定最優(yōu)化的提取條件為A2B2C3，即料液比為1:50（g/ml），提取溫度為40 ℃，超聲時(shí)間為30 min。

3.3 20批蠶沙樣品葉黃素、β-胡蘿卜素含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地采集的蠶沙樣品20批，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量，結(jié)果見(jiàn)表9。各批次葉黃素和β-胡蘿卜素含量差異較大，20批蠶沙葉黃素含量在0.12 %～0.95 %之間，β-胡蘿卜素含量在0.04 %～0.37 %之間。含量高的外觀相對(duì)偏草綠色，含量低的外觀偏灰黑色。分析原因可能與產(chǎn)地、采收時(shí)間不同有關(guān)。

表9 蠶沙含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 色譜條件的選擇

取葉黃素、β-胡蘿卜素對(duì)照品溶液，用DAD檢測(cè)器在200～500 nm進(jìn)行掃描。結(jié)果表明葉黃素在442 nm、β-胡蘿卜素在450 nm處有最大吸收。流動(dòng)相考察了甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-二氯甲烷系統(tǒng)、甲醇-乙腈-二氯甲烷系統(tǒng)、甲醇-乙腈-二氯甲烷-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈-二氯甲烷-水系統(tǒng)梯度洗脫可較好地分離葉黃素和β-胡蘿卜素成分，因此采用四相混合梯度洗脫，結(jié)合波長(zhǎng)切換，建立了同時(shí)測(cè)定蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素含量的HPLC色譜條件。

4.2 樣品處理方法

由于葉黃素和β-胡蘿卜素對(duì)光、對(duì)熱不穩(wěn)定，因此試驗(yàn)需全程避光，溶液配制用棕色量瓶，對(duì)照溶液需冷凍保存，樣品提取過(guò)程中，不可加熱回流，故采用超聲提取方法。

5 結(jié)論

建立了HPLC同時(shí)測(cè)定蠶沙中葉黃素、β-胡蘿卜素含量的方法，葉黃素、β-胡蘿卜素分別在0.197～19.7 μg、0.216～21.6 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.9990，平均回收率分別為96.84 %～101.71 %、98.01 %～103.29 %。優(yōu)化了葉黃素、β-胡蘿卜素的提取條件，考察了提取溶劑、1 %抗壞血酸溶液加入量、料液比、提取溫度對(duì)提取率的影響。最佳提取條件為：丙酮為溶劑，料液比1:50（g/ml），40 ℃下超聲提取時(shí)間30 min。該方法專屬性好，準(zhǔn)確度高，精密度好，優(yōu)化的提取條件穩(wěn)定、可行，可為蠶沙的質(zhì)量控制及有效成分提取提供參考。