線(xiàn)紋海馬副溶血弧菌的分離鑒定及藥物篩選

劉文軍，尚東維,，于小涵，崔培，楊燕菁，孫金輝,通信作者

（1. 天津嘉禾田源觀賞魚(yú)養(yǎng)殖有限公司，天津301809；2. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392）

線(xiàn)紋海馬（Hippocampus erectus）是原產(chǎn)于美洲地區(qū)的中型體格海馬，主要分布在大西洋西海岸。2009年該海馬被人工繁育成功并引入中國(guó)，因其生長(zhǎng)速度快、成活率高、抗病能力強(qiáng)而被迅速推廣，成為目前我國(guó)海馬養(yǎng)殖的主要種類(lèi)之 一[1-2]。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，線(xiàn)紋海馬病害發(fā)生情況也越加嚴(yán)重[3]。其中細(xì)菌性疾病是造成線(xiàn)紋海馬死亡的重要原因，例如假單胞菌[4]、海馬分枝桿菌[5]、溶藻弧菌[6]、坎氏弧菌[4]等均可引起海馬不同程度死亡。

2016年5月，天津某養(yǎng)殖場(chǎng)線(xiàn)紋海馬暴發(fā)疾病，患病海馬尾部多表現(xiàn)出潰瘍表征，腹部積水，并伴有腸炎癥狀。此次試驗(yàn)從瀕死線(xiàn)紋海馬肝胰臟中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌種，經(jīng)鑒定為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。副溶血弧菌屬于弧菌科、弧菌屬，是一種嗜鹽性、嗜溫性的革蘭氏陰性短桿菌，主要生活在海洋、鹽湖和魚(yú)蝦貝類(lèi)等海產(chǎn)品中，能夠感染魚(yú)類(lèi)、對(duì)蝦、文蛤、雜色鮑（九孔鮑）等，引起水生動(dòng)物疾病[7-8]，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成危害。盡管副溶血弧菌作為海馬條件致病菌已有報(bào)道[9]，但迄今尚未見(jiàn)有引起線(xiàn)紋海馬感染發(fā)病的報(bào)道。本研究從瀕死線(xiàn)紋海馬肝胰臟分離到副溶血弧菌，用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定結(jié)合16Sr RNA基因序列分析等方法進(jìn)行菌株鑒定，同時(shí)開(kāi)展藥敏試驗(yàn)，旨在豐富該菌在宿主范圍、生物學(xué)性狀及分子生物學(xué)等方面的內(nèi)容，并為海馬疾病防治工作提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

參照楊弘詣等[9]的方法進(jìn)行，用滅菌過(guò)濾海水沖洗體表潰瘍部位，無(wú)菌操作摘取患病海馬肝胰臟組織，碾碎后用0.87%的無(wú)菌型氯化鈉溶液（按1∶1比例）研磨，接種于MA 2216培養(yǎng)基（消化蛋白5.0 g，磷酸高鐵0.1 g，瓊脂15.0 g，陳海水1 000 mL，pH＝7.5～7.6）上，28 ℃恒溫分離培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h，取優(yōu)勢(shì)菌的菌落于MA 2216瓊脂培養(yǎng)基平面（28 ℃培養(yǎng)24 h）進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落用2216液體培養(yǎng)基（消化蛋白5.0 g，磷酸高鐵0.1 g，陳海水1 000 mL，pH＝7.5～7.6）培養(yǎng)，得到純菌株（編號(hào)為Par-1）。待測(cè)菌株P(guān)ar-1于MA 2216瓊脂平面上（29±1）℃培養(yǎng)16～18 h后，制備涂片標(biāo)本進(jìn)行革蘭氏染色，做形態(tài)特征檢查。最終將濃度為20%的甘油與菌液1∶1混勻，配成菌懸液保藏于-80 ℃冰箱。

1.2 生理生化特征檢查

采用弧菌科細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，包含項(xiàng)目如下：1% NaCl葡萄糖、1% NaCl葡磷胨水（VP）、1% NaCl蛋白胨水（靛基質(zhì)）、1% NaCl蔗糖、1% NaCl甘露糖、1% NaCl阿拉伯糖、1% NaCl肌醇、1% NaCl賴(lài)氨酸脫羧酶、1% NaCl精氨酸雙水解酶、無(wú)鹽胨水、3% NaCl胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水、10% NaCl胨水、硝酸鹽還原、半固體（動(dòng)力）、氧化酶試紙、接觸酶試驗(yàn)，弧菌生化管接種細(xì)菌后（29±1）℃培養(yǎng)24 h觀察，其中氨基酸測(cè)定項(xiàng)目觀察時(shí)間延長(zhǎng)至7 d。參照相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。

1.3 16S rRNA序列測(cè)定分析

挑取純化菌株于MA 2216 液體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩培養(yǎng)12～18 h至菌液渾濁。取2 mL菌液于離心管中，用臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（冷卻至4 ℃）12 000 r/min離心2 min。棄去上清液，利用水煮法[12]提取DNA，向離心管中加入500 μL無(wú)菌雙蒸水，渦旋30 s，然后用電熱恒溫水溫箱95 ℃水浴5 min，再12 000 r/min離心2 min，以上清液為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ眉?xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，27F：5′-AGAGTTTGA CCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-GGTTACCTTGTA CGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20 μL）：無(wú)菌雙蒸水7 μL，Mix體系10 μL，模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 S，55 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物交由北京金維智生物科技有限公司測(cè)序。將16S rRNA序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，再用MEGA 5.1軟件進(jìn)行多序列匹配分析，最后采用鄰位相連法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 人工感染試驗(yàn)

參照楊求華等[13]的方法將菌株P(guān)ar-1接種于MA 2216液體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，采用麥?zhǔn)媳葷醿x法將分離純化的細(xì)菌用無(wú)菌生理鹽水配置成密度為3.59×108CFU/mL的菌懸液。將菌懸液經(jīng)2 000 r/min，4 ℃離心10 min，除去上清液，加0.87% NaCl 進(jìn)行稀釋。選取56條線(xiàn)紋海馬隨機(jī)分為7組，每組8條。其中6組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組。試驗(yàn)組分設(shè)6個(gè)梯度，菌液濃度分別為3.59×1011、3.59×1010、3.59×109、3.59×108、3.59×107、3.59×106CFU/mL，用50 μL尖頭微量進(jìn)樣器從每尾海馬胸鰭基部向胸腹腔內(nèi)注射菌懸液20 μL，對(duì)照組注射濃度為0.87%的同等劑量的生理鹽水。試驗(yàn)期間控制水溫在（25±1）℃、鹽度22，連續(xù)充氣14 d，觀察記錄線(xiàn)紋海馬發(fā)病和死亡情況，并選取病死線(xiàn)紋海馬進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，觀察分離菌株在形態(tài)及生理生化特性上是否與原分離菌株一致。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用常規(guī)Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選用30種抗生素對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，在無(wú)菌條件下操作，將Par-1菌懸液涂布于2216E平板上，用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，按編號(hào)分別貼上不同的藥敏紙片，然后置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)確定該菌對(duì)不同藥物的敏感程度。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值，以判定菌株對(duì)抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Par-1菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

患病海馬皮膚表面多出現(xiàn)潰瘍表征，腹部積水，并伴有腸炎癥狀。從患有潰瘍的海馬表皮中分離獲得1株細(xì)菌，命名為Par-1，該菌株在MA 2216培養(yǎng)基上的菌落為白色近圓形、邊緣不規(guī)則、不透明、表面濕潤(rùn)。細(xì)菌染色鏡檢為革蘭氏陰性短棒狀菌，兩端著色深。生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，Par-1細(xì)菌具運(yùn)動(dòng)性，氧化酶、觸酶、硝酸鹽還原試驗(yàn)均呈陽(yáng)性；精氨酸雙水解酶陰性；賴(lài)氨酸脫羧酶陽(yáng)性；利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、利用蔗糖、甘露醇，不利用阿拉伯糖、肌醇；無(wú)鹽胨水不生長(zhǎng)，3% NaCl胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水、10% NaCl胨水均生長(zhǎng)（表1），初步判定細(xì)菌為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。

表1 病原菌Par-1生理生化特征

2.2 基因序列分析結(jié)果及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

以分離菌株P(guān)ar-1基因組DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增其16S rDNA 序列產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳顯示目的條帶大小約為1 450 bp（圖1），測(cè)序獲得 16S rRNA 序列片段為1 418 bp。通過(guò) NCBI-Blast 同源性分析發(fā)現(xiàn)病原菌的16S rRNA 基因與副溶血弧菌（KR347251.1和KR347253.1）的同源性達(dá)100%。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)序列并且進(jìn)行校正，采用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示病原菌與副溶血弧菌聚為一支（圖2），最終鑒定分離菌株P(guān)ar-1為副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）。

圖1 Par-1菌株16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 Par-1 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

2.3 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

回接感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，3.59×1011、3.59×1010、3.59×109、3.59×108CFU/mL 4個(gè)梯度的線(xiàn)紋海馬在48 h內(nèi)死亡率達(dá)到100%，3.59×106CFU/mL組在感染進(jìn)行7 d內(nèi)的死亡率為75%。人工感染后線(xiàn)紋海馬死亡率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Par-1人工再感染試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組在試驗(yàn)期間無(wú)病理變化和死亡現(xiàn)象。感染后的線(xiàn)紋海馬臨床表現(xiàn)與自然發(fā)病海馬癥狀相同，都主要表現(xiàn)為魚(yú)體表面有潰瘍病征，腸道內(nèi)有腹水，并且從已死亡的線(xiàn)紋海馬皮膚及肝臟再次分離得到與Par-1菌落形態(tài)、生理生化特征相同的菌株。對(duì)照組線(xiàn)紋海馬無(wú)死亡現(xiàn)象。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用30種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、頭孢噻肟、阿齊霉素、諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、依諾沙星、阿米卡星、恩諾沙星、左氟沙星、呋喃妥因、氯霉素、氟苯尼考、萬(wàn)古霉素、甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明等22種藥物敏感，對(duì)頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢氨芐、阿莫西林、氨芐西林、利福平、克林霉素等7種藥物耐藥，對(duì)紅霉素中度敏感（表3）。

表3 副溶血弧菌Par-1菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

副溶血弧菌是一種廣泛分布于近海岸及海產(chǎn)品中的嗜鹽性菌，是一種人與水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物共染的病原菌[14-15]。已有研究報(bào)告表明，其致病性有兩個(gè)明顯的特征：一是廣泛致病性，即在魚(yú)、蝦、蟹、貝類(lèi)等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中均存在廣泛的致病作用。高磊等[16]從發(fā)病石斑魚(yú)中分離得到副溶血弧菌，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行形態(tài)特征、PCR鑒定、毒力鑒定檢測(cè)試驗(yàn)，證實(shí)副溶血弧菌可引起健康石斑魚(yú)發(fā)病；趙吉臣等[17]通過(guò)人工注射感染試驗(yàn)證明副溶血弧菌可作為病原菌侵入墨吉明對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)；閻斌倫等[18]從養(yǎng)殖病死三疣梭子蟹肝胰臟及心臟血淋巴液中分離到大量?jī)?yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的副溶血弧菌，人工感染試驗(yàn)證明分離菌對(duì)三疣梭子蟹有較強(qiáng)的致病性。鄧先余等[19]經(jīng)形態(tài)、生理、生化、回歸感染試驗(yàn)等多項(xiàng)指標(biāo)鑒定出工廠(chǎng)化養(yǎng)殖雜色鮑的致病菌為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），并經(jīng)ATB微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)證實(shí)鑒定結(jié)果。本研究從患病線(xiàn)紋海馬體內(nèi)分離得到1株菌株P(guān)ar-1，通過(guò)對(duì)分離菌進(jìn)行了主要理化特性方面較系統(tǒng)地檢驗(yàn)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，表明所檢出的病原菌為副溶血弧菌；此外，Par-1純培養(yǎng)物可在短時(shí)間內(nèi)使健康線(xiàn)紋海馬患病甚至死亡，其癥狀與自然發(fā)病海馬病灶部位表現(xiàn)一致，半數(shù)致死濃度為5.01×106CFU/mL，進(jìn)一步揭示了該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的廣泛致病作用。二是條件致病性，即水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在受到脅迫時(shí)，易被感染并引發(fā)疾病或死亡，脅迫可能來(lái)自于水溫等環(huán)境因子、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生理狀態(tài)、細(xì)菌數(shù)量、其他致病菌入侵等。從已有的研究資料中不難發(fā)現(xiàn)，溫度是決定養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌能否產(chǎn)生致病性的主要因素之一，如在閻斌倫等[18]研究中的三疣梭子蟹及樊景鳳等[20]研究中的凡納濱對(duì)蝦發(fā)病在7月，而本研究中線(xiàn)紋海馬發(fā)病在5月，表明該菌多在5～10月，尤其是6～9月大量繁殖，主要原因是該季節(jié)水溫較高，水質(zhì)易惡化，易滋生致病菌。因此，高溫季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)管理，保持良好的水質(zhì)是降低副溶血弧菌致病性的主要途徑。

使用抗菌藥物依然是治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性感染最主要的手段。根據(jù)來(lái)源不同，可將抗菌藥物分為抗生素和人工合成抗菌藥。在副溶血弧菌對(duì)抗菌類(lèi)藥物敏感性的研究方面，閻斌倫等[18]報(bào)道引起江蘇地區(qū)河蟹暴發(fā)性流行病的副溶血弧菌對(duì)新霉素等42種藥物高度敏感，對(duì)林可霉素敏感，對(duì)青霉素G等6種耐藥；劉葒等[21]發(fā)現(xiàn)氟哌酸、紅霉素、青霉素和強(qiáng)力霉素等4種藥物對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的副溶血弧菌有顯著抑制作用；張朝霞等[22]報(bào)道分離于九孔鮑的副溶血弧菌對(duì)鏈霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、慶大霉素、壯觀霉素、妥布霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、磺胺甲基異噁唑等藥物高度敏感，對(duì)四環(huán)素、新霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星等中度敏感，對(duì)紅霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、氟哌酸、呋喃唑酮、氨芐青霉素、呋喃妥因等耐藥。本研究通過(guò)對(duì)30種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Par-1菌株對(duì)四環(huán)素、氟苯尼考、新霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、甲氧芐啶、慶大霉素、諾氟沙星等22種藥物敏感，對(duì)頭孢哌酮、頭孢克肟、頭孢氨芐、阿莫西林、氨芐西林、利福平、克林霉素等7種藥物耐藥。從上述結(jié)果可以看出，分離于不同水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的副溶血弧菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性存在一定差異，這可能與養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關(guān)，具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物國(guó)標(biāo)獸藥抗菌藥物有14個(gè)品種，包括本研究中線(xiàn)紋海馬副溶血弧菌菌株對(duì)之敏感的氟苯尼考粉（水產(chǎn)用）、硫酸新霉素粉（新霉素，水產(chǎn)用）、復(fù)方磺胺甲噁唑粉（復(fù)方新諾明，水產(chǎn)用）、恩諾沙星和復(fù)方磺胺嘧啶粉（甲氧芐啶，水產(chǎn)用）。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、新霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和甲氧芐啶等抗菌藥物控制天津地區(qū)線(xiàn)紋海馬的副溶血弧菌病。但需要注意的是，目前對(duì)副溶血弧菌所引起的養(yǎng)殖線(xiàn)紋海馬疾病的診斷仍是根據(jù)常規(guī)的臨診觀察和細(xì)菌學(xué)檢查，在確定病原種類(lèi)的過(guò)程中缺乏及時(shí)性和準(zhǔn)確性，無(wú)法滿(mǎn)足疾病防治的要求[23]，因此未來(lái)尋找該病原的快速檢測(cè)方法將成為疾病防治的重點(diǎn)工作之一。