冰菜總黃酮的提取優(yōu)化及抗氧化活性研究

王敏，王俊斌,b,通信作者，王貞利，楊宗芬，王海鳳

（天津農(nóng)學(xué)院 a. 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，b. 化學(xué)實驗教學(xué)中心，c. 農(nóng)業(yè)分析測試中心，天津 300392）

冰菜（Mesembryanthemum crystallinumL.），也稱冰葉日中花，可生長在高鹽漬土和海灘邊，其葉片和莖表面有發(fā)亮的含鹽泡狀細(xì)胞，鈉含量與海水中鈉含量相當(dāng)，具有極強的耐鹽性[1]。冰菜原產(chǎn)于非洲東部和南部，是當(dāng)?shù)匾环N分布廣泛的耐鹽堿植物，后被世界多地引進(jìn)栽培，因其口感清脆、風(fēng)味獨特并且營養(yǎng)豐富，逐漸被包括我國在內(nèi)很多國家的民眾接受，成為一種綠色健康蔬 菜[2]。冰菜中含有對人體有益的松醇、肌醇、礦物質(zhì)、氨基酸、微量元素等物質(zhì)，具有降血糖、促進(jìn)脂肪代謝、預(yù)防脂肪肝和動脈硬化、防止脫發(fā)、改善濕疹等功效[3-4]。

冰菜作為一種耐鹽植物和新型特色營養(yǎng)保健蔬菜，具有較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和生態(tài)改良價值。冰菜中多酚、黃酮含量豐富，具有良好的抗氧化活性，能有效清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化及保護機體生物大分子[5-7]。目前，關(guān)于冰菜的研究大多集中在栽培方法、C3-CAM轉(zhuǎn)化過程和耐鹽機制等方面[8-10]，但對冰菜中所含抗氧化物質(zhì)的提取及其功能研究還較少。本研究以冰菜為材料，對總黃酮提取方法和工藝進(jìn)行優(yōu)化，測定冰菜總黃酮提取物對自由基的清除能力，以期為冰菜在天津地區(qū)進(jìn)一步推廣和開發(fā)提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮冰菜洗凈后用吸水紙吸干，50 ℃烘干至恒重，粉碎后過篩。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所，其余試劑均為分析純。儀器包括Elma P120H超聲儀、T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計、以及其他常規(guī)分析儀器。

1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照黃瓊等[11]的方法，以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x、吸光度為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），進(jìn)行線性擬合后得到方程：y＝7.025 6x＋0.017，R2＝0.991 9。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 冰菜總黃酮的提取和測定

參照杜麗娟等[12]的方法對冰菜總黃酮進(jìn)行提取，方法有所改動。稱取1.0 g粉末，放入50 mL離心管中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液超聲加熱并提取，將提取液脫色（加入液體體積0.5%的活性炭，60 ℃，保溫40 min），冷卻至常溫，離心（5 000 r/min，5 min）后過濾，取上清液定容至 50 mL，即得提取液。

精密量取提取液10 mL，置于25 mL比色管中，測定方法同1.2，根據(jù)線性方程求得提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，總黃酮提取率按公式（1）計算。

式中：c——總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V——提取液體積，mL；m——樣品質(zhì)量，mg。

1.4 單因素試驗

在超聲功率300 W條件下，分別考察4個因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間）對總黃酮提取率的影響，每個因素設(shè)置5個梯度。

1.5 正交試驗優(yōu)化方案

在單因素試驗基礎(chǔ)上，把總黃酮提取率作為評價指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間為正交試驗因素，設(shè)置3個水平，通過L9（34）正交試驗，優(yōu)化總黃酮提取方法[13]。表1為正交試驗因素與水平設(shè)計表。

表1 正交試驗因素及水平

1.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力測定

參照杜麗娟等[12]的方法，在試管中分別加入不同質(zhì)量濃度梯度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）黃酮提取液1.0 mL，再加2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），避光反應(yīng)30 min后，測定517 nm處吸光度，記為A1。以2.5 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，其吸光度記為A2。以2.5 mL DPPH乙醇溶液和1.0 mL乙醇混合，測其吸光度，記為A0。以同質(zhì)量濃度維生素C作對照，按公式（2）計算清除率。

1.7 羥基自由基清除能力測定

利用水楊酸法測定羥基自由基清除率。取6.0 mmol/L FeSO4溶液、6.0 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，加入試管混勻后，再分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的樣品溶液及6.0 mmol/L過氧化氫溶液各1.0 mL，混勻，于37℃ 反應(yīng)30 min后，用蒸餾水調(diào)零，于510 nm測定不同質(zhì)量濃度樣品管A1，以1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液測定A0，以1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液測定A2[12]。同時，以同質(zhì)量濃度維生素C作陽性對照，按公式（3）計算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對冰菜總黃酮提取率的影響 由圖2可以看出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%～80%范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而快速增加。雖然90%乙醇的提取率最高，但乙醇體積分?jǐn)?shù)從80 %增加到90%時，總黃酮提取率增加幅度很小。作為一種有機化合物，黃酮易溶于有機溶劑，因此冰菜中總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加。但過高體積分?jǐn)?shù)的提取溶劑會導(dǎo)致其他脂溶性物質(zhì)溶出，與總黃酮形成競爭，從而使總黃酮提取率增加幅度變小[14]。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對冰菜總黃酮提取率的影響

2.1.2 料液比對冰菜總黃酮提取率的影響

比較不同料液比下的總黃酮提取率可知，料液比在1∶10時總黃酮的提取效果最好，隨著料液比進(jìn)一步增加，提取率不斷下降（圖3）。這可能是由于料液比較低時，溶質(zhì)和溶劑接觸不充分，導(dǎo)致細(xì)胞中的黃酮不易溶出；而過大的料液比會降低超聲波的超聲效果，使冰菜細(xì)胞壁不易破壞，黃酮難以溶出，而提取體系中有更多雜質(zhì)溶出，提取率隨之下降[15]。

圖3 料液比對冰菜總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對冰菜總黃酮提取率的影響

圖4表明，40～60 ℃時，冰菜總黃酮提取率與提取溫度呈正比，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，黃酮的提取效果最好，達(dá)4.74%。當(dāng)溫度大于60 ℃時，總黃酮提取率略有降低。適當(dāng)提高溫度會加快分子運動，有利于冰菜中黃酮的擴散和浸出，但溫度過高時，因化學(xué)和酶促降解使不穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)受熱分解，從而影響總黃酮提取率[16]。

圖4 提取溫度對冰菜總黃酮提取率的影響

2.1.4 提取時間對冰菜總黃酮得率的影響

由圖5可以看出，當(dāng)提取時間在60～120 min時，總黃酮提取率隨時間的增加而上升，當(dāng)提取時間為120 min時，總黃酮提取率最高，為3.23%，當(dāng)提取時間大于120 min時，總黃酮提取率下降?？赡苁翘崛r間過長導(dǎo)致部分黃酮遭到破壞，且乙醇積體分?jǐn)?shù)隨浸提時間的延長而降低，導(dǎo)致冰菜總黃酮提取率下降[17]。

2.2 正交試驗結(jié)果

通過正交試驗確定了最佳提取條件。由表2可知，根據(jù)正交試驗結(jié)果，冰菜總黃酮最佳提取工藝條件為A1B2C1D3，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶15（g∶mL）、提取溫度50 ℃、提取時間120 min，該工藝條件下冰菜總黃酮提取率為4.91%。由表2還可知，各因素對試驗指標(biāo)的影響順序為：提取時間（D）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞ 料液比（B）＞提取溫度（C）。其中提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對冰菜總黃酮提取率的影響較大，料液比、提取溫度對試驗指標(biāo)均未達(dá)到顯著影響。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 冰菜總黃酮提取物的抗氧化能力

2.3.1 冰菜總黃酮對DPPH自由基的清除能力

黃酮類物質(zhì)具有清除自由基的能力。本試驗中采用DPPH自由基和羥基自由基清除率來評價冰菜總黃酮提取物的抗氧化活性。由圖6可以看出，隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力也隨之增強，但清除能力相比對照維生素C較弱。DPPH自由基清除率在提取物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時最高，達(dá)到76.32%。本試驗結(jié)果表明，DPPH清除率隨著提取物質(zhì)量濃度的增加而增加，說明冰菜提取物具有一定的清除DPPH自由基能力，這與單科開等[15]的研究結(jié)果相似。

圖6 冰菜提取物對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 冰菜總黃酮對羥基自由基的清除能力

由圖7可以看出，冰菜提取物清除羥基自由基的能力隨提取物質(zhì)量濃度增加呈上升趨勢。在質(zhì)量濃度為0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，提取物羥基自由基清除能力與同質(zhì)量濃度維生素C持平。質(zhì)量濃度大于0.06 mg/mL時，提取物表現(xiàn)出更強的羥基自由基清除能力，清除率高達(dá)78.45 %，說明冰菜提取物有較強的清除羥基自由基能力。

圖7 冰菜提取物對羥基自由基的清除能力

3 結(jié)論

本研究以冰菜為材料，采用超聲波輔助法提取冰菜總黃酮，摸索和優(yōu)化了提取方法，并對提取物進(jìn)行抗氧化作用研究。通過試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比1∶15（g∶mL）、提取溫度50 ℃、提取時間為120 min時，為冰菜總黃酮的最佳提取工藝條件。冰菜總黃酮提取液的質(zhì)量濃度越大，對DPPH自由基以及羥基自由基的清除能力越強。當(dāng)冰菜提取物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達(dá)到最大，為76.32 %，稍低于同質(zhì)量濃度的維生素C；羥基自由基清除率最大為78.45%，略高于同質(zhì)量濃度的維生素C。說明冰菜具有較強的抗氧化能力，適宜開發(fā)為具有抗氧化作用的保健食品。