大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚的工藝研究

董心宜，陳慧慧，張宇薇，王英超,通信作者，張桂霞，王瑞璽

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 a. 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，b. 園藝園林學(xué)院，天津 300392；2. 天津市大蒲地家庭農(nóng)場，天津 301600）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）屬薔薇科，原產(chǎn)于北美地區(qū)，歐洲有上百年引種栽培歷史[1]。我國于20世紀(jì)90年代開始引入，在遼寧、吉林、山東、天津和黑龍江均有栽培。黑果腺肋花楸果實富含花青素、黃酮、多酚等活性物質(zhì)[2]，目前已知果實中含量最高的活性物質(zhì)為多酚類物質(zhì)[3]。研究表明，黑果腺肋花楸果實中的多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的清除自由基、降血脂、降血糖和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[4]。

多酚的純化方法有溶劑萃取法、金屬離子沉淀法、凝膠柱層析分離純化法、大孔樹脂吸附法、超臨界萃取法和膜分離法[5]，其中大孔樹脂吸附法是一種應(yīng)用非常廣泛的純化方法。大孔吸附樹脂具有穩(wěn)定性好、富集效果明顯、吸附容量大、選擇性好、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點，廣泛用于活性物質(zhì)的分離純化。國外對于黑果腺肋花楸的研究主要集中在果實加工和功能性產(chǎn)品研發(fā)方面[6-7]。國內(nèi)對于黑果腺肋花楸的研究正處于起步階段，對于多酚純化的研究報道較少，如李斌等[4]、張卉等[8]、高凝軒[9]采用XAD-7大孔樹脂純化黑果腺肋花楸中的多酚，純度達(dá)到64.37%～74.26%。但XAD-7樹脂價格昂貴，在實際工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)成本偏高，因此篩選一種高性價比的樹脂尤為重要。

筆者以黑果腺肋花楸凍果的多酚提取液為原料，采用AB-8、ADS-17、HPD-100和NKA-Ⅱ 4種大孔樹脂對多酚進(jìn)行純化，并確定最佳純化工藝，以期篩選出高性價比樹脂，旨在為黑果腺肋花楸多酚類物質(zhì)的研究利用提供方法和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸采自天津市靜海區(qū)。挑選成熟度一致、無病蟲害和損傷的果實，清洗干凈，控干果實表面水分，-20 ℃保存。

AB-8大孔樹脂、NKA-II大孔樹脂、HPD-100和ADS-17大孔樹脂購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇購自天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；福林酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。無水碳酸鈉、NaOH、HCl均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YS-08小型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；Alpha-1500紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；HL-2B數(shù)顯恒流泵，上海嘉鵬科技有限公司；BS-100A自動部份收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐若儀器儀表有限公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI公司；FD5-3真空冷凍干燥儀，SIM（USA）International Group CO.。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸多酚的提取

稱取黑果腺肋花楸凍果解凍后按料液比1∶5（g：mL）加入50%乙醇溶液，混勻后置于三角瓶中。在40 ℃、超聲功率200 W的條件下提取40 min，4 000 r/min離心10 min，旋蒸除去濾液中的乙醇，冷凍干燥后得到粗提物凍干粉，測定多酚含量，使用時按照試驗需要配制溶液備用。

1.3.2 多酚含量測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.3.2.1 樣品含量測定

移取0.1 mL待測樣品溶液于25 mL刻度試管中，依次加入2 mL蒸餾水、0.5 mL福林酚，靜置3 min后加入2 mL 10% Na2CO3，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫避光放置2 h，在760 nm波長下測定吸光度值。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取1 mg/mL沒食子酸對照品溶液0、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 mL于25 mL刻度試管中，依次加入2 mL蒸餾水、0.5 mL福林酚試劑，靜置3 min后加入2 mL 10%Na2CO3，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫避光放置2 h，在760 nm波長下測定吸光度。

以吸光度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到線性回歸方程：y＝89.185x- 0.050 5（R2＝0.991 5）。樣品中多酚含量根據(jù)公式（1）計算。

式中：C——黑果腺肋花楸多酚含量，mg/mL；A——吸光度；N——提取液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 大孔樹脂預(yù)處理

稱取適量4種大孔樹脂置于無水乙醇中密封浸泡，于30 ℃、120 r/min條件下振蕩24 h，振蕩結(jié)束后，用無水乙醇沖洗至流出液與蒸餾水體積比1∶3并混合無白色渾濁時，用蒸餾水沖洗至無醇味，然后將樹脂過濾并吸干多余水分，備用。

1.3.4 吸附與解吸試驗篩選最佳樹脂

稱取預(yù)處理后的4種大孔樹脂各2.0 g于250 mL錐形瓶中，分別加入黑果腺肋花楸多酚提取液50 mL，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩24 h后，取適量上清液測定多酚質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（2）計算樹脂吸附量。

式中：C0——吸附前提取液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1——吸附平衡時上清液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V——供試液體積，mL；M——樹脂質(zhì)量，g。

將避光振蕩24 h后的4種樹脂過濾并用蒸餾水沖洗至表面無多酚提取液殘留物，然后過濾樹脂并吸干多余水分，加入50 mL 60%乙醇溶液，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩24 h后，取適量上清液測定多酚質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（3）計算解吸率。

式中：C0——吸附前提取液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C1——吸附平衡時上清液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；C2——解吸液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.5 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

1.3.5.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

稱量2 g預(yù)處理后的AB-8樹脂，加入30 mL黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩，每隔1 h取適量上清液測定多酚含量，計算樹脂吸附量。以取樣時間（h）為橫坐標(biāo)、樹脂吸附量（mg/g）為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.3.5.2 上樣液pH值對靜態(tài)吸附量的影響

用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)黑果腺肋花楸多酚提取液的pH分別為2、4、6、8、10。稱量5份預(yù)處理后的AB-8樹脂，分別加入30 mL不同pH的黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩24 h，取適量上清液測定多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

1.3.5.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對靜態(tài)解吸率的影響

稱量6份預(yù)處理后的AB-8樹脂，分別加入30 mL 黑果腺肋花楸多酚提取液，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩24 h。取上清液測定多酚質(zhì)量濃度，計算樹脂吸附量。然后將樹脂過濾后洗去殘留的多酚并吸干多余水分，分別加入40 mL 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在30 ℃、120 r/min條件下避光振蕩24 h，取上清液測定多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

1.3.6 AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸試驗

1.3.6.1 上樣流速對吸附效果的影響

準(zhǔn)確稱量預(yù)處理后的AB-8樹脂16.0 g，濕法裝柱，待樹脂平衡后，分別以1.0、2.0、3.0 mL/min的流速對黑果腺肋花楸多酚提取液進(jìn)行上樣，每管收集5 mL流出液，測定每管流出液多酚質(zhì)量濃度。

1.3.6.2 洗脫流速對洗脫效果的影響

準(zhǔn)確稱量預(yù)處理后的AB-8樹脂16.0 g，濕法裝柱，待樹脂平衡后，以1.0 mL/min的流速對黑果腺肋花楸多酚提取液進(jìn)行上樣直至樹脂達(dá)到吸附飽和，測定流出液中多酚質(zhì)量濃度，計算樹脂吸附量。然后用70%乙醇溶液洗脫，洗脫速度分別為0.5、1.0、1.5 mL/min，每管收集5 mL流出液，測定每管流出液多酚質(zhì)量濃度。

1.3.7 AB-8大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸多酚的純化效果

根據(jù)公式（4）和公式（5）計算多酚的收率和純度。

式中：C0——吸附前提取液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V0——吸附前提取液的體積，mL；C2—— 解吸液中多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V2——解吸液體積，mL；C——多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V——溶液體積，mL；M——凍干粉質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

以樹脂吸附量和解吸率為標(biāo)準(zhǔn)，對AB-8、ADS-17、HPD-100、NKA-II 4種大孔樹脂進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種大孔樹脂中，吸附量最高的是HPD-100樹脂，為0.082 2 mg/g；其次是AB-8樹脂，為0.070 2 mg/g；NKA-II樹脂的吸附量最低，只有0.048 5 mg/g。解吸率最高的是AB-8樹脂，為70.22%；其次是ADS-17樹脂，為61.93%；HPD-100的解吸率最低，為39.76%。綜合考慮，選擇吸附量和解吸率都相對較好的AB-8大孔樹脂作為最佳純化樹脂。

圖1 4種大孔樹脂對黑果腺肋花楸多酚的靜態(tài)吸附量和解吸率

2.2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

2.2.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

由圖2可知，隨著時間的延長，AB-8大孔樹脂吸附量逐漸增加。3 h后吸附量明顯放緩。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于3 h后大孔樹脂吸附趨于飽和。因此，選用AB-8大孔樹脂純化黑果腺肋花楸多酚時，靜態(tài)吸附時間選擇3 h最佳。

圖2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

2.2.2 上樣液pH對靜態(tài)吸附量的影響

上樣液pH對AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附量的影響見圖3。由圖3可知，吸附量隨樣液pH的增大呈先增加后減小的趨勢，在pH為4 時，吸附量達(dá)到最大值。這是由于上樣液pH的變化，可以改變目標(biāo)成分在溶液中的存在形式，改變?nèi)芤簶O性，影響目標(biāo)成分與大孔吸附樹脂分子間作用力?；ㄩ倍喾又泻写罅糠恿u基，呈酸性，在酸性條件下比較穩(wěn)定，從而利于大孔樹脂對多酚的吸附[8，10]。綜上所述，使用AB-8樹脂純化黑果腺肋花楸多酚時不需要調(diào)節(jié)樣液pH。

圖3 上樣液pH對AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附量的影響

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對靜態(tài)解吸率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響見圖4。如圖4所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，解吸率呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時，解析效果最好，解吸率為82.36%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時，增加了其他醇溶性物質(zhì)與多酚的競爭性溶出[11]，從而使多酚的解吸率下降。因此，選擇70%乙醇作為AB-8大孔樹脂的洗脫劑。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對AB-8大孔樹脂靜態(tài)解吸率的影響

2.3 AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸試驗

2.3.1 上樣流速對吸附效果的影響

不同上樣液流速對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響見圖5。以1.0、2.0、3.0 mL/min的流速對樣液進(jìn)行上樣，流速為1.0 mL/min和2.0 mL/min時泄漏點出現(xiàn)較遲，在流出液體積為15 mL時，流速為3.0 mL/min時泄露出現(xiàn)最早，在流出液體積為10 mL時，隨著流出液體積的增加，不同流速下流出液中多酚質(zhì)量濃度也在增加，流速為3.0 mL/min時，流出液中多酚質(zhì)量濃度增加速度最快，流速為2.0 mL/min時次之，流速為1.0 mL/min時最慢。這是因為上樣流速過快會導(dǎo)致黑果腺肋花楸多酚與大孔樹脂接觸時間過短而使得吸附效果降低，但流速過慢會使得試驗周期過長，在2.0 mL/min流速下，流出液達(dá)到80 mL后，流出液多酚質(zhì)量濃度增長速度較快，說明大孔樹脂對多酚的吸附效果降低，逐漸接近飽和。因此，將2.0 mL/min作為較佳上樣流速，最佳上樣量為80 mL。

圖5 上樣流速對吸附效果的影響

2.3.2 洗脫流速對洗脫效果的影響

在同一吸附條件下，洗脫流速對洗脫效果的影響見圖6。由圖6可知，洗脫流速為1.5 mL/min時，流出液多酚含量最低，洗脫速度過快使乙醇不能與多酚更好的接觸導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；洗脫流速為1.0 mL/min時，流出液多酚含量居第二，但洗脫效果最好；洗脫流速為0.5 mL/min時，流出液多酚含量最高，但由于洗脫速度過慢從而延長了洗脫時間。綜上所述，選擇洗脫流速為1.0 mL/min，此流速下最佳洗脫體積為60 mL。

圖6 洗脫流速對AB-8大孔樹脂洗脫效果的影響

2.3.3 AB-8大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸多酚的純化效果

利用福林酚比色法，對黑果腺肋花楸多酚提取液和經(jīng)AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸純化后的多酚進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，利用AB-8大孔樹脂純化后，多酚純度從10.80%提高到了52.20%，回收率為80.56%。證明AB-8大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸多酚的純化效果較好。

3 結(jié)論

通過比較AB-8、ADS-17、HPD-100、NKA-II 4種大孔樹脂對黑果腺肋花楸多酚吸附-解吸效果，篩選出AB-8大孔樹脂對黑果腺肋花楸多酚的純化效果最好，其最佳靜態(tài)吸附-解吸工藝參數(shù)為：吸附時間3 h、上樣液pH＝4、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%；其最佳動態(tài)吸附-解吸工藝參數(shù)為：上樣流速2.0 mL/min、最佳上樣量80 mL、洗脫流速1.0 mL/min、最佳洗脫體積60 mL。黑果腺肋花楸多酚純度由10.80%提高到52.20%，表明AB-8大孔樹脂能夠較好地純化黑果腺肋花楸多酚。

AB-8大孔樹脂價格低廉，是XAD-7大孔樹脂價格的1/10，雖然對黑果腺肋花楸多酚的純化效果略低于XAD-7大孔樹脂，但在工業(yè)批量生產(chǎn)中能夠節(jié)約大量生產(chǎn)成本，間接提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。