短梗五加果實(shí)不同發(fā)育階段特異性代謝特征

邵文達(dá)，吳可心，任艷君，劉昱利，孫菲陽(yáng)，唐中華

（東北林業(yè)大學(xué) a.化學(xué)化工與資源利用學(xué)院；b.林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

短梗五加Eleutherococcus sessiliflorus，又稱無(wú)梗五加，民間俗稱“烏鴉子”，是五加科Araliaceae五加屬Eleutherococcus藥用植物，屬多年生落葉灌木或小喬木，常叢生或散生于針闊葉混交林或闊葉林中。短梗五加主要分布于我國(guó)的東北、內(nèi)蒙古、河北、山西地區(qū)及朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[1]。由短梗五加的根、莖、葉、果等部位提取分離出的活性成分含量及其相關(guān)功能各不相同。短梗五加的根、莖中富含黃酮類、木脂素類活性成分，其根皮俗稱“五加皮”，為民間常見(jiàn)中藥，性溫，味辛、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有抗疲勞、抗癌、保肝護(hù)肝、消炎、安神等功效[2]。短梗五加葉、果中的揮發(fā)油、有機(jī)酸類、色素等活性成分則被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及食品深加工領(lǐng)域[3]。短梗五加果被原國(guó)家衛(wèi)生部列為食品新資源，是一種藥食同源食品，含有黃酮、多糖、維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸、花青素等成分。短梗五加果實(shí)性溫，無(wú)毒，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝[4-5]、改善睡眠、降血脂、預(yù)防心血管疾病[6]、平衡陰陽(yáng)、補(bǔ)腎強(qiáng)腰等多種功效，是新型保健食品的優(yōu)質(zhì)原料[7]。短梗五加的嫩莖俗稱“刺拐棒”或“綠參”，其嫩莖葉常被作為山野菜。

與同科屬其他植物相比，短梗五加的特定部位還含有一些特色功能性成分，這些活性成分的分離、鑒定及藥理分析對(duì)該科屬植物的深入研究具有重要的參考價(jià)值[8-9]。短梗五加果實(shí)中富含的活性物質(zhì)有金絲桃苷、刺五加苷B、刺五加苷E、齊墩果酸、異嗪皮啶等。金絲桃苷是短梗五加等五加屬植物中的重要活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂[10]、鎮(zhèn)靜、抗抑郁[11]等藥用功效，同時(shí)還具有一定的抗癌作用[12]。刺五加苷為五加屬植物中含量較為豐富的特異性成分，主要有刺五加苷B（紫丁香苷）、刺五加苷E 等，具有強(qiáng)效的緩解身心疲勞的作用[13]。相關(guān)研究結(jié)果證明，刺五加苷B具有一定的消炎、鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、抗腫瘤等功效[14-17]，刺五加苷E 具有預(yù)防細(xì)胞脂質(zhì)聚積[18]、促進(jìn)睡眠、鎮(zhèn)靜安神等功效。齊墩果酸具有一定的抗血栓、抗血小板凝集活性[19]，而且其因具有良好的抗氧化性及保肝護(hù)肝功效在食品、醫(yī)療領(lǐng)域日益受到關(guān)注。異嗪皮啶具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤及抗氧化等功效[20-21]。

果實(shí)中糖和有機(jī)酸等代謝組分及其含量水平是果實(shí)品質(zhì)的重要影響因素。在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，糖及其活化形式為果實(shí)多種代謝過(guò)程提供底物、中間反應(yīng)物和能量等，形成果實(shí)風(fēng)味等[22-23]，糖還為果實(shí)細(xì)胞膨大提供滲透推動(dòng)力[24-25]。有機(jī)酸通常在果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中積累，在果實(shí)成熟過(guò)程中作為糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸基質(zhì)（ATP 來(lái)源）以及糖異生作用基質(zhì)而被消耗[26]。了解短梗五加果實(shí)類型，研究短梗五加果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的糖和酸代謝及其變化規(guī)律，對(duì)于研究提高短梗五加的果實(shí)品質(zhì)具有重要意義。

20世紀(jì)90年代，代謝組學(xué)作為一門全新學(xué)科逐漸發(fā)展起來(lái)[27]。近年來(lái)，代謝組學(xué)發(fā)展十分迅速，目前已經(jīng)成為植物生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域[28]。植物代謝組學(xué)主要采用4 種分析技術(shù)：核磁共振譜、毛細(xì)管電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[29]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[30]。目前，代謝組學(xué)分析在果實(shí)生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，例如，在枇杷[31]、藍(lán)莓[32]、蓮霧[33]、臍橙[34]等果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程中代謝過(guò)程及所參與化合物等的變化的研究中得以應(yīng)用。目前，對(duì)短梗五加根、莖、葉的研究報(bào)道頗多，但對(duì)其果實(shí)的生長(zhǎng)形成以及發(fā)育成熟代謝的研究報(bào)道較為鮮見(jiàn)。文中以短梗五加果實(shí)為研究對(duì)象，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同時(shí)期短梗五加果實(shí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，并對(duì)5個(gè)時(shí)期的差異代謝物進(jìn)行了篩選，旨在為提高短梗五加果實(shí)品質(zhì)提供參考，為短梗五加果實(shí)資源的合理利用及相關(guān)產(chǎn)品的高效開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

以東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院（126°37′47.24″E，45°44′1.61″N）栽培的5年生短梗五加（約65 株）為樣株。分別于2020年8月25日、8月31日、9月16日、9月22日、10月19日，在短梗五加樣株的東、西、南、北方向，隨機(jī)采摘無(wú)病蟲(chóng)害且大小基本一致的果實(shí)，混樣，重復(fù)至少3 次，經(jīng)液氮速凍后-80 ℃條件下保存。

1.2 樣品制備

初級(jí)代謝和次級(jí)代謝樣品的制備以及色譜、質(zhì)譜條件參照劉洋[35]的方法，將衍生樣品以液體形式注入Agilent 7890A-5975C GC-MS（gas chromatography-mass spectrometry）系統(tǒng)（美國(guó)安捷倫公司），以高純氦為載氣進(jìn)行分離，恒定流速為1.0 mL/min，注入溫度和離子源溫度分別設(shè)置為260、230 ℃，模型為電子碰撞電離（?70 eV），采用全掃描模式分析初級(jí)代謝產(chǎn)物。采用UPLC-MS（ultra-high liquid chromatograph-mass spectrometer）分析次生代謝產(chǎn)物，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和歸一化處理，用峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定化合物的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent GC-MS 5975 數(shù)據(jù)分析軟件處理數(shù)據(jù)，并使用XCMS 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的特征峰提取和預(yù)處理，將預(yù)處理完畢的數(shù)據(jù)矩陣歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P 13 軟件（Umet-rics，Umea，瑞典）進(jìn)行PCA 和PLS-DA 等多元統(tǒng)計(jì)分析，再以變量對(duì)分組貢獻(xiàn)得分（VIP 值）大于1 和單因素方差分析結(jié)果顯著（P＜0.05）為差異性代謝產(chǎn)物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。將差異代謝物輸入KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)和Metabo Analyst 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行代謝途徑的富集和篩選。GC-MS 代謝組學(xué)和LC-MS 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（采用單因素方差分析法），使用GraphPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的性狀

根據(jù)果實(shí)的縱橫徑和顏色將果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程分為5個(gè)時(shí)期（圖1），分別為幼果期（8月25日）、綠熟期（8月31日）、半轉(zhuǎn)色期（9月16日）、轉(zhuǎn)色期（9月22日）、成熟期（10月19日）。幼果期的果實(shí)小且硬；綠熟期的果實(shí)迅速膨大，顯現(xiàn)出品種特有的形態(tài)，果實(shí)整體較為飽滿；半轉(zhuǎn)色期的果實(shí)開(kāi)始有色素沉著，這個(gè)階段的果實(shí)半青半紫；轉(zhuǎn)色期的果實(shí)整體呈現(xiàn)均勻的色素沉著，果粒完全呈現(xiàn)深紫黑色，果肉開(kāi)始軟化；成熟期的果實(shí)一般用于制成可食用或藥用的干果。

圖1 5個(gè)發(fā)育時(shí)期的短梗五加果實(shí)Fig.1 Fruits of E.sessiliflorus at five developmental stages

2.2 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的活性物質(zhì)含量

短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的活性物質(zhì)（刺五加苷B、刺五加苷E、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸）含量如圖2所示。由圖2 可見(jiàn)：在幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期，5 種活性成分的含量基本穩(wěn)定，刺五加E質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02 ～0.04 μg/g，刺五加苷B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 ～0.03 μg/g，金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03 μg/g，異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.003 ～0.005 μg/g，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為155.85 ～217.65 μg/g；但是在轉(zhuǎn)色期、成熟期2個(gè)階段，5 種活性成分的含量顯著增加，刺五加苷E 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到23.66 μg/g，是前期的1 000 倍，刺五加苷B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到1.63 μg/g，是前期的100 倍，金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到3.12 μg/g，是前期的100 倍，異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到0.008 μg/g，是前期的2 倍，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到347.36 μg/g，是前期的2倍，并且其含量在5 種活性成分中是最高的。

圖2 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的活性物質(zhì)含量Fig.2 Active substances in five stages of E.sessiliflorus fruit

2.3 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的差異代謝物

2.3.1 差異代謝物的PCA 和PLS-DA 模型分析結(jié)果

對(duì)短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期代謝物累積的差異進(jìn)行PCA 分析，得分情況如圖3所示。在第1 主成分中，短梗五加果實(shí)的幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期與成熟期明顯分開(kāi)，在第2 主成分中，幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、成熟期與轉(zhuǎn)色期明顯分開(kāi)。即幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期與轉(zhuǎn)色期、成熟期明顯分開(kāi)，說(shuō)明短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期代謝物的累積有明顯差異。

圖3 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期差異代謝物的PCA 得分Fig.3 PCA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

但PCA 分析是一種無(wú)監(jiān)督的分析方法，不能忽略組內(nèi)誤差并消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差。為更加準(zhǔn)確地顯示短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期代謝物累積的差異，使用有監(jiān)督的PLS-DA 模型進(jìn)一步進(jìn)行分析，得分情況如圖4所示。經(jīng)PLS-DA 模型分析可知，擬合優(yōu)度系數(shù)R2和Q2分別為0.775、0.920，說(shuō)明PLS-DA 模型的擬合結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

圖4 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的PLS-DA 得分Fig.4 PLS-DA score of E.sessiliflorus fruit in five stages

2.3.2 差異代謝物的名稱

基于PLS-DA 分析結(jié)果，得到VIP 值大于1的化合物，再經(jīng)過(guò)單因素方差分析篩選P值小于0.05 的化合物，最終得到49 種差異代謝物（表1）。由表1 可知：篩選出的差異化合物中有7 種糖，分別是D-阿拉伯糖、D-半乳糖、吡喃半乳糖、乳糖、D-核糖、葡萄糖、纖維二糖；有23 種酸，分別是蘋(píng)果酸、奎寧酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、沒(méi)食子酸、哌可酸、葡萄糖酸、戊酸、L-去甲纈氨酸、2-酮-1-葡萄糖酸、丙二酸、2-丙酸、4-羥基苯甲酸、丙炔酸、亞硫酸、3-羥基苯甲酸、戊二酸、醋酸、4-乙基苯甲酸、莽草酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸；有4 種醇，分別是1-環(huán)戊烷硫醇、1,2-乙二醇、肌醇、甘油；其他15 種。

表1 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期的差異代謝物（P ＜0.05）Table 1 Different metabolites of E.sessiliflorus fruit in five stages(P ＜0.05)

2.3.3 差異代謝物相對(duì)含量的聚類分析

短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期差異代謝物相對(duì)含量的聚類分析結(jié)果如圖5所示。由圖5 可見(jiàn)，幼果期積累最多的糖有D-阿拉伯糖、吡喃半乳糖，綠熟期積累最多的糖有葡萄糖，半轉(zhuǎn)色期積累最多的糖有D-核糖、D-半乳糖，成熟期積累最多的糖有吡喃半乳糖、纖維二糖、半乳糖。

圖5 短梗五加果實(shí)5個(gè)時(shí)期差異代謝物相對(duì)含量的聚類分析結(jié)果Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites in five stages of E.sessiliflorus fruit

由圖5 可見(jiàn)，在短梗五加果實(shí)的青果期，即果實(shí)尚未完全變紫黑前，幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期聚類的化合物主要是有機(jī)酸。在轉(zhuǎn)色期和成熟期有機(jī)酸含量下降，在幼果期積累較多的酸有檸檬酸、沒(méi)食子酸、莽草酸、奎寧酸、葡萄糖酸、2-丁烯二酸等，在綠熟期積累較多的酸有琥珀酸、葡萄糖酸等，在半轉(zhuǎn)色期積累較多的酸有奎寧酸、蘋(píng)果酸、2-丁烯二酸等，在轉(zhuǎn)色期積累較多的酸有戊酸、哌可酸等，在成熟期積累較多的酸有苯甲酸、2-丁烯二酸等。

2.3.4 差異代謝物的通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)找到所有差異代謝物的KEGG ID，將這些ID 輸入Metabo Analyst 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)代謝富集分析，共標(biāo)注到7個(gè)較為重要的代謝途徑，包括半乳糖代謝、硫代謝、乙醛酸/二羧酸代謝、三羧酸循環(huán)、γ-氨基丁酸（GABA）代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙酮酸代謝，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，7個(gè)代謝途徑中的P值均小于0.05。半乳糖代謝途徑中化合物總數(shù)是27，匹配數(shù)是5，P值小于0.01，參與的化合物有乳糖、D-半乳糖、葡萄糖、肌醇、甘油。三羧酸循環(huán)中化合物總數(shù)是20，匹配數(shù)是4，P值小于0.01，參與的化合物有檸檬酸、2-丁烯二酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸。乙醛酸/二羧酸代謝途徑中化合物總數(shù)是29，匹配數(shù)是4，P值小于0.01，參與的化合物有檸檬酸、琥珀酸、醋酸、蘋(píng)果酸。硫代謝途徑中化合物總數(shù)是15，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有琥珀酸、醋酸、亞硫酸。丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝途徑中化合物總數(shù)是22，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有琥珀酸、2-丁烯二酸、4-氨基丁酸。丙酮酸代謝途徑中化合物總數(shù)是22，匹配數(shù)是3，P值小于0.01，參與的化合物有蘋(píng)果酸、2-丁烯二酸、醋酸。γ-氨基丁酸代謝途徑中化合物總數(shù)是17個(gè)，匹配數(shù)是2，P值是0.05，參與的化合物有琥珀酸、4-氨基丁酸。

表2 短梗五加果實(shí)差異代謝物參與的7個(gè)代謝途徑Table 2 Seven metabolic pathways involved in differential metabolites in the fruit of E.sessiliflorus

3 結(jié)論與討論

本研究中以幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期、成熟期共5個(gè)時(shí)期的短梗五加果實(shí)為材料，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在5個(gè)時(shí)期的短梗五加果實(shí)中鑒定出糖類、氨基酸、有機(jī)酸、醇等49 種差異化合物。研究結(jié)果表明，在果實(shí)發(fā)育前期積累了較多的糖和有機(jī)酸，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，糖分被消耗，有機(jī)酸降解并轉(zhuǎn)換為糖類和氨基酸等物質(zhì)。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，主要參與的代謝途徑有半乳糖代謝、硫代謝、乙醛酸/二羧酸代謝、三羧酸循環(huán)、γ-氨基丁酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙酮酸代謝等。短梗五加果實(shí)中5 種活性成分刺五加苷E、刺五加苷B、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸的含量在轉(zhuǎn)色期、成熟期顯著增加。

果實(shí)發(fā)育時(shí)期的劃分一般是基于物候?qū)W信息，通過(guò)實(shí)地觀測(cè)果實(shí)的大小、顏色以及成熟狀態(tài)等而定。本研究中以楊楠[36]對(duì)藍(lán)靛果實(shí)發(fā)育時(shí)期的劃分為依據(jù)，根據(jù)果實(shí)發(fā)育的外部形態(tài)特點(diǎn)，將短梗五加果實(shí)的發(fā)育時(shí)期分為幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期、轉(zhuǎn)色期、成熟期共5個(gè)時(shí)期。從其藥用活性成分含量的變化和代謝物的差異來(lái)看，短梗五加果實(shí)發(fā)育時(shí)期又可以分成2個(gè)階段：幼果期、綠熟期、半轉(zhuǎn)色期為第1 階段（青果期）；轉(zhuǎn)色期、成熟期為第2 階段。

果實(shí)中糖酸的種類、含量及其動(dòng)態(tài)變化對(duì)果實(shí)風(fēng)味的形成有重要的影響，是近年來(lái)果實(shí)品質(zhì)研究的重要方向，如：葉麗琴等[37]探討了歐李果實(shí)在不同發(fā)育階段的糖酸積累規(guī)律以及不同種類糖酸間的相關(guān)性，結(jié)果表明糖酸比隨果實(shí)發(fā)育呈指數(shù)函數(shù)變化趨勢(shì)；安嬌等[38]對(duì)軟棗獼猴桃果實(shí)中的糖酸進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)發(fā)育成熟，糖酸組分及其含量均發(fā)生了變化；魏國(guó)芹等[39]在測(cè)定甜櫻桃果實(shí)糖酸組分及其含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)發(fā)育，總糖含量整體呈上升趨勢(shì)，總酸含量呈先增加、后下降趨勢(shì)。本研究中，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了短梗五加果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的初級(jí)代謝物，包括糖、有機(jī)酸、氨基酸、醇等，發(fā)現(xiàn)其中以糖酸積累為主。

在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，糖分可提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。藍(lán)公毅等[40]的研究結(jié)果表明，山蒼子果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中內(nèi)含物含量下降，是由于果實(shí)發(fā)育膨大過(guò)程中需要充分的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，養(yǎng)分被消耗。在對(duì)油茶果實(shí)的研究報(bào)道中，湯佳[41]提到果實(shí)也含有葉綠素，可進(jìn)行光合作用，積累糖分。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實(shí)的糖分在前期積累，在轉(zhuǎn)色期含量降低，在成熟期又增加。這可能是因?yàn)榍捌诙坦Ｎ寮尤~片和果實(shí)通過(guò)同化作用產(chǎn)生的糖分積累在果實(shí)中，為果實(shí)生長(zhǎng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，果實(shí)在發(fā)育過(guò)程消耗養(yǎng)分，糖分含量降低，成熟后期，植物枝梢或根部繼續(xù)向果實(shí)運(yùn)輸糖分，淀粉和有機(jī)酸也會(huì)轉(zhuǎn)化為糖，而糖分的消耗相對(duì)較少，糖分積累下來(lái)。

果實(shí)中有機(jī)酸的組分及其含量是決定果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)。在果實(shí)發(fā)育期間，不同類型果實(shí)酸度的變化不同。大多數(shù)果實(shí)（如梨[42-43]、甜櫻桃[39]和柚[44]等）的有機(jī)酸含量在發(fā)育前期逐步增高，隨著果實(shí)成熟，有機(jī)酸含量下降。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實(shí)中的有機(jī)酸主要為蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、奎寧酸、沒(méi)食子酸等。在前期，果實(shí)中積累了較多有機(jī)酸；隨著果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育有機(jī)酸含量降低；果實(shí)成熟時(shí)有機(jī)酸含量略有回升。其原因可能是果實(shí)發(fā)育初期有機(jī)酸大量合成積累，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，有機(jī)酸開(kāi)始轉(zhuǎn)化為糖類、氨基酸等物質(zhì)，其降解大于合成，與前人的研究結(jié)果基本一致。

植物的代謝途徑具有多樣性，常見(jiàn)的代謝途徑有糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)途徑、磷酸戊糖途徑、γ-氨基丁酸途徑等。其中，γ-氨基丁酸在植物中具有多種功效，可調(diào)節(jié)植物機(jī)體pH，促進(jìn)代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，抵御逆境等，由于功能多樣，相關(guān)代謝途徑的研究報(bào)道也較多[45-46]。當(dāng)植物體受到逆境脅迫或植物激素作用時(shí)，植物體內(nèi)GAD 酶被激活導(dǎo)致γ-氨基丁酸富集[47]。本研究結(jié)果表明，短梗五加果實(shí)在幼果期、綠熟期、成熟期大量積累琥珀酸和4-氨基丁酸，因此γ-氨基丁酸代謝也是此3個(gè)時(shí)期的重要代謝途徑。γ-氨基丁酸代謝在這3個(gè)時(shí)期活躍，可能是因?yàn)樵诠麑?shí)成熟過(guò)程中γ-氨基丁酸代謝促進(jìn)果實(shí)成熟，而且與硫代謝共同防御外界環(huán)境的不良影響。

采收時(shí)果實(shí)發(fā)育程度對(duì)其藥用成分組成及其含量具有顯著影響。壽旦等[48]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸果實(shí)由青變紅直至成熟，其主要成分熊果酸、齊墩果酸含量逐漸降低至穩(wěn)定狀態(tài)，馬錢素含量則逐漸升高，因此傳統(tǒng)的山茱萸采收時(shí)間是合理的。本研究結(jié)果表明，在發(fā)育前期，短梗五加果實(shí)的5 種活性成分（刺五加苷B、刺五加苷E、金絲桃苷、異嗪皮啶、齊墩果酸）的含量基本穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)色期、成熟期含量顯著增加，這種變化規(guī)律可能與短梗五加果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中次生產(chǎn)物的消長(zhǎng)規(guī)律及其發(fā)育變化相關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。