加氏乳桿菌的降脂活性研究

于佳琪，楊婭楠，李轉(zhuǎn)羽，馬艷艷，趙柏聞*，吳崇明*

（1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193 2 北京量化健康科技有限公司 北京 100070）

高脂血癥（hyperlipemia）是指血脂水平過高，主要臨床表現(xiàn)為血液中膽固醇和/或甘油三酯水平異常增高，進(jìn)而能夠引發(fā)一系列代謝性疾病，如動脈粥樣硬化、冠心病和胰腺炎等，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-5]。脂肪攝入過多，脂蛋白合成、代謝過程的異常，以及不良的飲食生活習(xí)慣均可導(dǎo)致血脂水平異常，導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)生[6-8]。近年來隨著人們生活水平的提高，脂肪能量攝入的增加，全世界高脂血癥的發(fā)病率大幅上升[9-10]，已成為重要的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有血脂異?；颊吒哌_(dá)4.3 億，形成龐大的心血管疾病和肝病高危群體[11]。

目前，臨床上已有多種降血脂藥物，雖然降脂療效比較顯著，但是長期使用會產(chǎn)生較明顯的副作用[12-16]。近年來一些腸道細(xì)菌對脂質(zhì)代謝的影響逐漸引起人們的注意[17-20]。加氏乳桿菌是一種在腸道中自然存在的天然益生菌，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理活性，包括抗炎，改善胰島素分泌，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，治療肥胖癥，抗高膽固醇等[21-25]，然而加氏乳桿菌對高脂血癥的作用報道較少。本研究利用油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型以及通過高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂血癥小鼠模型，探討加氏乳桿菌對脂質(zhì)堆積、脂質(zhì)代謝活性的影響，為開發(fā)以腸道菌為功能型產(chǎn)品以及尋找新的高脂血癥防治手段提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、細(xì)胞來源與實驗動物 菌株：各單菌株培養(yǎng)物上清液，由北京量化健康科技有限公司提供，用于體外實驗。加氏乳桿菌活菌（Lactobacillus gasseri-BDUP），由北京量化健康科技有限公司提供，用于動物體內(nèi)實驗。加氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌（Lactobacillus gasseri-ATCC 33323），中國普通微生物菌種保藏管理中心，用于動物體內(nèi)實驗。

細(xì)胞株：人肝癌HepG2 細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

實驗動物：8 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠32 只，北京華阜康生物科技股份有限公司。

飼料：①普通飼料；②高脂飼料（High Fat Diets，H10060），主要成分為：蛋白質(zhì)26.0%，糖類26.0%，脂肪35.0%，北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑、儀器和設(shè)備 高糖DMEM 培養(yǎng)基，康寧公司；胎牛血清FBS、0.25%胰蛋白酶、雙抗、PBS，美國Thermo Fisher 公司；油酸、非諾貝特、DMSO、油紅O 粉末和Bodipy493/503 熒光染料，美國Sigma 公司；多聚甲醛，碧云天公司；BCA蛋白檢測試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；甘油三酯測定試劑盒，南京建成科技有限公司；NP-40，美國Biotopped 公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、槍頭等耗材，美國Thermo Fisher 公司。

動物試驗用總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司。

多規(guī)格移液器，美國eppendorf 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；KC junior 微孔板掃描酶標(biāo)儀，美國BIOTEK 公司；超低溫冰箱，美國Thermo 公司；普通倒置光學(xué)顯微鏡，德國Leica 公司；細(xì)胞超聲破碎儀，美國Thermo 公司；高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf 公司；全自動生化儀，美國Backman公司。

1.2 方法

1.2.1 加氏乳桿菌降低HepG2 細(xì)胞的脂質(zhì)堆積

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS 和1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2，飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每兩天更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至80%時，棄舊培養(yǎng)基，加入0.25%胰蛋白酶消化，并傳代培養(yǎng)。

1.2.1.2 油紅O 染色 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞傳代，以適宜濃度均勻接種至96 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，待細(xì)胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的70 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%菌株培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予30 μL 菌株培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)基，PBS 緩沖液漂洗1 次，每孔加入40μL 的4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min 后去除多聚甲醛固定液，PBS 漂洗1 次；加入35 μL 油紅O 染液室溫避光染色30 min 后，去除油紅O 染液并用PBS 漂洗2 次；每孔加入30 μL DMSO，置于搖床上避光輕搖5 min，用微孔板分光光度計在358 nm 處讀取吸光度。

1.2.1.3 Bodipy 熒光染色 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞傳代，以適宜濃度均勻接種至24 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液500 μL，待細(xì)胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的350 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%加氏乳桿菌培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予150 μL 加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原有培養(yǎng)基，PBS 緩沖液漂洗1 次，每孔加入500 μL 的4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min 后去除多聚甲醛固定液，PBS 漂洗1 次；加入提前配制好的Bodipy 染液500 μL，室溫避光孵育30 min 后去除染液，并用PBS 漂洗2 次，使用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.1.4 甘油三酯濃度測定 將對數(shù)生長期內(nèi)生長狀態(tài)良好的HepG2 細(xì)胞傳代，以適宜濃度均勻接種至12 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，待細(xì)胞生長匯合至80%時，棄原培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為100 μmol/L 油酸的700 μL DMEM 培養(yǎng)基，以加30%加氏乳桿菌培養(yǎng)基CK 為陰性對照，以20 μmol/L 非諾貝特為陽性對照，試驗組給予300 μL 加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液，每組設(shè)置4 個復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)基，PBS緩沖液漂洗1 次，每孔加入500 μL PBS 收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管中，離心后去上清液，每管加入300 μL A 液（5% NP-40+95% ddH2O）。根據(jù)甘油三酯測定試劑盒檢測甘油三酯含量，按照BCA蛋白定量試劑盒說明檢測蛋白含量，計算甘油三酯濃度 （甘油三酯濃度=甘油三酯含量/蛋白含量）。

1.2.2 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠的降脂作用

1.2.2.1 實驗動物分組 32 只小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF 級動物房，按照實驗動物飼養(yǎng)規(guī)程飼養(yǎng)，先經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，觀察其體重以及一般情況的變化。隨后將小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組：正常對照組、模型對照組、加氏乳桿菌ATCC 標(biāo)準(zhǔn)菌株組（ATCC）、加氏乳桿菌BDUP 菌株組（BDUP）。每組8 只，正常對照組小鼠喂食普通飼料；模型對照組小鼠喂食高脂飼料，每天灌胃加氏乳桿菌培養(yǎng)基；加氏乳桿菌組喂食高脂飼料，分別每天灌胃109CFU/d 的加氏乳桿菌活菌。持續(xù)4 周，所有組小鼠每周記錄1次體質(zhì)量與飼料攝取質(zhì)量，每天觀察小鼠生長狀態(tài)。試驗結(jié)束后，摘除眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取脂肪組織（腹后壁脂肪、附睪脂肪）和肝臟組織，電子天平稱取脂肪組織質(zhì)量，將肝臟組織均液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中凍存。

1.2.2.2 指標(biāo)檢測 血液經(jīng)2 500 r/min 離心后取上清，通過半自動生化分析儀檢測小鼠血脂相關(guān)指標(biāo)：血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）、甘油三酯（TG）。

肝臟組織經(jīng)勻漿，13 000 r/min 離心5 min 后取上清，根據(jù)試劑盒說明書測定小鼠肝脂相關(guān)指標(biāo)：總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），樣本比較采用方差檢驗，各數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示。*P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選具有降脂活性的加氏乳桿菌

利用油酸誘導(dǎo)建立的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型，對166 株加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液的降脂活性進(jìn)行檢測。3 次及以上油紅O 染色法篩選的結(jié)果顯示：166 株加氏乳桿菌的調(diào)脂能力位于降低34.05%到升高15.66%之間。其中有61 株使脂質(zhì)積累降低10%以上，64 株的降脂能力在（-10%～0）之間，而36 株菌使脂質(zhì)積累略微增加，有5 株反而使脂質(zhì)積累增加超過10%（表1）。整體上，166 株加氏乳桿菌中有61 株顯示出顯著的降脂效果，比例達(dá)36.75%。另外，有5 株具有較強(qiáng)的升脂作用，其余100 株對脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用無明顯作用。其中BDUP 菌株具有最強(qiáng)的降脂活性，藥效穩(wěn)定且培養(yǎng)性最好，對其進(jìn)行大量發(fā)酵并在動物體內(nèi)進(jìn)行降脂功效研究。

表1 加氏乳桿菌調(diào)脂作用篩選結(jié)果Table 1 Screening results for the lipid-modulatory efficiency of L.gasseri srains

2.2 加氏乳桿菌降低油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞中脂質(zhì)堆積和甘油三酯含量

利用油酸誘導(dǎo)建立的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型，對上述最優(yōu)的加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液的降脂活性進(jìn)行檢測。通過Bodipy 熒光染色觀察，結(jié)果表明，與模型組NC 相比，加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液組的熒光信號所有下降，與陽性藥非諾貝特處理相似（圖1a），在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性（圖1b）。這說明加氏乳桿菌能夠顯著抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積。

圖1 通過Bodipy493/503 熒光染色觀察加氏乳桿菌對HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響（n=8）Fig.1 Effect of L.gasseri on intracellular lipid accumulation in HepG2 cells with Bodipy493/503 （n=8）

為了進(jìn)一步確認(rèn)加氏乳桿菌對HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響，進(jìn)行油紅O 染色定量分析，結(jié)果顯示，與模型組NC 相比，陽性藥和加氏乳桿菌培養(yǎng)物上清液都能抑制油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積，結(jié)果具有顯著差異（圖2a）。定量試劑盒檢測HepG2 細(xì)胞中甘油三酯含量（圖2b），與模型組NC 相比，加氏乳桿菌組細(xì)胞中甘油三酯含量明顯下降（P＜0.01），且加氏乳桿菌的作用效果優(yōu)于陽性藥非諾貝特的作用效果。

圖2 加氏乳桿菌對HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積及甘油三酯含量的影響（n=4）量分析結(jié)果Fig.2 Effect of L.gasseri on intracellular lipid accumulation and intracellular content of triglycerides in HepG2 cells （n=4）

2.3 加氏乳桿菌改善高脂血癥小鼠的脂質(zhì)異常

為了確定加氏乳桿菌在體內(nèi)是否具有改善脂質(zhì)活性作用，對C57BL/6J 小鼠喂食高脂飼料來建立高脂血癥小鼠模型，并灌胃加氏乳桿菌4 周。由圖3a 可知，試驗前4 組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，4周后模型對照組小鼠體質(zhì)量與空白對照組相比顯著增加，加氏乳桿菌能夠顯著降低高脂血癥小鼠的體質(zhì)量，無論是商品化標(biāo)準(zhǔn)加氏乳桿菌還是本試驗前期在細(xì)胞體外發(fā)現(xiàn)具有顯著降脂活性的加氏乳桿菌樣品，均使小鼠體重恢復(fù)到正常對照組的水平（圖3a）。4 組小鼠的體質(zhì)量增加量趨勢一致（圖3b）。此外，通過比較加氏乳桿菌組和模型對照組小鼠各部位脂肪質(zhì)量的變化，發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌明顯降低了高脂血癥小鼠的腹后壁脂肪和附睪脂肪質(zhì)量（圖3c）。

圖3 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠體重和脂肪質(zhì)量的影響（n=8）Fig.3 Effects of L.gasseri on body weight and fat weight in hyperlipidemic mice （n=8）

針對高脂血癥會導(dǎo)致的血脂水平變化，檢測了小鼠的血脂水平。與空白對照組相比，模型組小鼠血清的總膽固醇 （TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）和甘油三酯（TG）水平均有顯著的升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明高脂飲食導(dǎo)致小鼠血脂水平異常。灌胃加氏乳桿菌4 周后，小鼠血清中TC、LDL-c 和TG 水平顯著降低，而高密度脂蛋白膽固醇水平無明顯變化 （圖4a）。值得注意的是，加氏乳桿菌活菌（L.gasseri-BDUP）的降血脂作用優(yōu)于商品化標(biāo)準(zhǔn)加氏乳桿菌 （L.gasseri-ATCC 33323）的作用。

最后對高脂血癥小鼠肝臟脂質(zhì)水平進(jìn)行檢測。如圖4b 所示，高脂飼料喂養(yǎng)后小鼠的肝脂水平明顯升高，尤其是甘油三酯（TG）水平，而L.gasseri-BDUP 能夠顯著降低肝臟組織中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4b）。然而，L.gasseri-ATCC 33323 僅能降低高脂血癥小鼠肝臟組織中甘油三酯水平，對總膽固醇無顯著影響。與血脂水平數(shù)據(jù)一致，與L.gasseri-ATCC 33323 相比，L.gasseri-BDUP 降低肝臟脂質(zhì)水平的能力更強(qiáng)。這些結(jié)果說明加氏乳桿菌L.gasseri-BDUP 能夠降低高脂血癥小鼠的肝臟脂質(zhì)水平，改善脂質(zhì)異常，具有良好的體內(nèi)抗高脂血癥的功效。

圖4 加氏乳桿菌對高脂血癥小鼠血脂和肝脂水平的影響（n=8）Fig.4 Effects of L.gasseri on blood lipid and liver lipid metabolic activity in hyperlipidemic mice （n=8）

3 討論與結(jié)論

近年來，越來越多的研究表明，腸道菌群作為宿主體內(nèi)的一種寄生共存物，在人體健康中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們的組成、活性、產(chǎn)生的代謝物等均會影響人體的生理病理狀態(tài)。腸道菌群可以改善高脂飲食小鼠的葡萄糖和脂質(zhì)代謝[26]，從而在肥胖、高脂血癥[27]、糖尿病、動脈粥樣硬化[28]等疾病中發(fā)揮重要作用。從腸道菌群中篩選具有降脂功效的菌株將促進(jìn)對多種疾病的診斷和治療。

益生菌作為腸道菌群的一部分，具有保護(hù)腸道黏膜屏障，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。而加氏乳桿菌是在腸道中自然存在的一種天然益生菌，研究發(fā)現(xiàn)，加氏乳桿菌可以通過影響長鏈酰CoA 合成酶3（ACSL3）的表達(dá)及脂肪酸感應(yīng)途徑進(jìn)一步調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[24]；還可以通過增強(qiáng)炎性免疫反應(yīng)，抑制食欲來改善大鼠代謝特征[29]。不僅如此，加氏乳桿菌具有改善腸道完整性，減少脂多糖（LPS）等炎癥物質(zhì)的侵襲，降低脂肪組織炎癥的作用[30]，因此對治療肥胖癥有良好的效果[23]。

本試驗基于加氏乳桿菌在降脂方面的良好作用，篩選腸道菌群中具有降脂活性的菌株，結(jié)果顯示，篩選的166 株加氏乳桿菌中，有61 株顯示出顯著的降脂效果，其中BDUP 菌株具有最強(qiáng)的降脂效力。體外試驗結(jié)果表明，加氏乳桿菌BDUP 菌株對油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)堆積有明顯的改善作用，其效果甚至優(yōu)于陽性藥非諾貝特。Bodipy 熒光染色結(jié)果顯示，與模型組相比，加氏乳桿菌BDUP 菌株培養(yǎng)物上清液組的熒光信號有所下降，與陽性藥組接近。另外，與模型組相比，加氏乳桿菌BDUP 菌株組細(xì)胞中甘油三酯含量也明顯下降。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，加氏乳桿菌能夠顯著降低高脂血癥小鼠的體質(zhì)量，無論是加氏乳桿菌標(biāo)菌ATCC 33323 還是本試驗篩選的具有顯著降脂活性的加氏乳桿菌BDUP 樣品，均能使小鼠體質(zhì)量恢復(fù)到正常對照組的水平。此外，通過比較加氏乳桿菌組和模型對照組，發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌明顯降低高脂血癥小鼠的腹后壁脂肪和附睪脂肪質(zhì)量。與模型組相比，小鼠血清中的TC、LDL-c 和TG 水平顯著降低，肝臟組織中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量也顯著降低，且試驗篩選所得加氏乳桿菌BDUP 的作用更優(yōu)于加氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC 33323。

總之，本試驗結(jié)果表明，益生菌加氏乳桿菌在體外和體內(nèi)均有良好的降脂作用，篩選的BDUP菌株比標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33323 在降脂方面具有更明顯的優(yōu)勢。這些菌株可以改善肥胖癥、高脂血癥等疾病中的脂質(zhì)代謝紊亂，在代謝性疾病的預(yù)防和改善中具有重要作用。研究結(jié)果為開發(fā)以加氏乳桿菌BDUP 為主的降脂功能性產(chǎn)品奠定了理論基礎(chǔ)。后續(xù)還需對加氏乳桿菌發(fā)揮降脂功效的作用機(jī)制進(jìn)行探究，通過揭示其機(jī)理，為高脂血癥研究提供新的思路。