保存方法對大洋性頭足類多組織穩(wěn)定同位素分析的影響：以莖柔魚為例

沈永富，耿 亮，貢 藝,2,3,4，丁 宇，李云凱,2,3,4，鄧江山，陳浩楠

1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306

2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

3.國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306

4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

由于穩(wěn)定同位素在生物體內(nèi)復(fù)雜的分餾機(jī)制，使得其特征值可用于示蹤物質(zhì)在生態(tài)系統(tǒng)中的流動過程[1]。通常，碳穩(wěn)定同位素比值 (δ13C) 可用于指示食物來源[2]，氮穩(wěn)定同位素比值 (δ15N) 可用于指示營養(yǎng)位置[3-4]。基于此，穩(wěn)定同位素分析已成為海洋生物攝食生態(tài)學(xué)研究的主要技術(shù)手段[5]。

頭足類廣泛分布于全球各大洋，其資源豐富，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[6-7]。由于其世代更新快，生命周期短，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的能量傳遞過程中起著關(guān)鍵作用[8-9]?；诓煌M織穩(wěn)定同位素周轉(zhuǎn)率的差異，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)對頭足類攝食生態(tài)開展了大量研究。肌肉組織用于指示較長時間周期頭足類的攝食和洄游過程[10]；性腺組織用于指示短時間周期的信息[11]；角質(zhì)顎作為一種硬組織，結(jié)合時間序列連續(xù)取樣，可用于示蹤不同生活史階段頭足類的攝食與棲息地變化[12]。然而，不同研究中樣品的保存方法存在差異，且均未考慮保存方式對分析結(jié)果的潛在影響，這增加了樣品分析結(jié)果的不確定性。

保存方式是否會對穩(wěn)定同位素分析造成影響尚存在爭議。冷凍保存是穩(wěn)定同位素樣品最常見的保存方法，由于冷凍不涉及化學(xué)試劑，故通常認(rèn)為冷凍對δ13C 和δ15N 分析無影響[13]。但有研究發(fā)現(xiàn)，冷凍會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而引起氧化反應(yīng)，造成某些生物組織的穩(wěn)定同位素比值發(fā)生變化[14]，例如羅氏沼蝦 (Macrobrachiumrosenbergii) 整蝦在冷凍條件下δ13C 呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢[15]。此外，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為38%的甲醛水溶液是實(shí)驗(yàn)室和博物館保存樣品的兩種常規(guī)試劑，其對穩(wěn)定同位素分析的影響存在較大爭議。Hetherington 等[16]研究發(fā)現(xiàn)甲醛和乙醇保存會降低頭足類肌肉中δ13C 值；而Kaehler 和Pakhomov[17]指出乙醇保存顯著增大真蛸 (Octopusvulgaris)肌肉組織δ13C 值，δ15N 值則無顯著性變化；Carabel 等[18]發(fā)現(xiàn)乙醇和甲醛保存均會增大槽溝?？?(Anemoniasulcate)、帽貝 (Patellvulgate)和紫貽貝 (Mytilusgalloprovincialis) 的δ15N 值，而δ13C 值僅在紫貽貝中表現(xiàn)出顯著下降。因此，各保存方法對不同物種、不同組織可能會產(chǎn)生特異性影響，然而目前針對大洋性頭足類各組織的影響卻鮮有報道，開展相關(guān)保存方法的比較研究有助于準(zhǔn)確認(rèn)識保存方法差異帶來的潛在影響，為進(jìn)一步規(guī)范樣品保存提供理論依據(jù)。

本研究以大洋性頭足類的典型代表—莖柔魚 (Dosidicusgigas) 為研究對象，比較分析了其肌肉、性腺和角質(zhì)顎在冷凍保存 (-20 ℃) 和試劑保存 (體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇與體積分?jǐn)?shù)為38% 的甲醛) 條件下，第0、第30 和第180 天的δ13C、δ15N和碳氮比 (C/N) 變化，進(jìn)而分析得出莖柔魚樣品最優(yōu)保存方法，以期為其他大洋性頭足類穩(wěn)定同位素分析和樣本保存提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

莖柔魚樣品取自2020 年6 月秘魯海域中國遠(yuǎn)洋魷釣船漁獲物，采樣區(qū)域?yàn)?4°W—95°W、3°S—7°S，共采集20 尾胴長范圍為22.7～26.9 cm 的莖柔魚，帶回實(shí)驗(yàn)室后，于漏斗鎖軟骨處取一塊約4 cm×4 cm 的肌肉，解剖取出性腺組織，并用鑷子取出角質(zhì)顎，洗凈黏液及雜質(zhì)后，裝入自封袋中待進(jìn)一步處理。

將各組織樣品用超純水洗凈，等分為7 份：1 份作為對照組即刻處理，其余6 份分別采用-20 ℃冷凍、體積分?jǐn)?shù)75% 的乙醇和體積分?jǐn)?shù)為38% 的甲醛溶液保存30 和180 d。待到達(dá)保存時間后，使用超純水洗凈組織上殘余保存液，隨后裝入5 mL 離心管在冷凍干燥機(jī) (Christ Alpha 1-4 LD plus，德國) 于-55 ℃內(nèi)冷凍干燥32 h。由于性腺組織含脂量較高，脂質(zhì)在合成過程中會產(chǎn)生δ13C 分餾，導(dǎo)致脂類與其他成分 (如蛋白質(zhì)和碳水化合物) δ13C 值存在差異，因此現(xiàn)有的研究中常進(jìn)行脂類抽提。正常C/N 值小于3.5 時，認(rèn)為脂質(zhì)抽提完。本研究在測樣前對性腺樣品進(jìn)行脫脂處理，即樣品放于15 mL 離心管中，加入體積比為2∶1 的二氯甲烷甲醇溶液，浸泡20 h 后在離心機(jī)內(nèi)以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，重復(fù)3 次。剩余沉積物在60 ℃烤箱中烘干去除殘留溶劑。

1.2 穩(wěn)定同位素分析

將干燥后的肌肉、角質(zhì)顎和性腺樣本使用球磨儀(Mixer Mill MM 400，德國) 研磨成粉，并用電子天平稱取約1.50 mg 包裝于錫箔紙中，隨后送入穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(IsoPrime 100，英國) 和元素分析儀 (vario ISOTOPE cube，德國) 測定碳、氮穩(wěn)定同位素比值及元素含量百分比(C/N)。δ13C 和δ15N 的計算公式如下：

式中：X為δ13C 或δ15N (‰)；Rsample和Rstandard分別為所測得的同位素比值和標(biāo)準(zhǔn)品同位素比值。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果精度和準(zhǔn)確度，每隔20 個樣品采用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[蛋白質(zhì)，-26.98‰ vs.維也納國際原子能中心制作的美洲擬箭石(PDB) 和5.94‰ vs.大氣中的氮?dú)?(N2)] 校正，δ13C 和δ15N 的分析精度分別為0.05‰和0.06‰。C/N 值由原子質(zhì)量計算得出。穩(wěn)定同位素測定在上海海洋大學(xué)穩(wěn)定同位素分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用配對t檢驗(yàn)分析δ13C、δ15N 和C/N 值在各保存方式下的變異性，并分析各處理方式對穩(wěn)定同位素比值影響的時間變化規(guī)律。使用SPSS 22.0 和Origin 2023 pro 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

莖柔魚肌肉、角質(zhì)顎和性腺3 種組織δ13C、δ15N 和C/N 值在不同保存方式下的結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，3 種保存方法對莖柔魚不同組織的穩(wěn)定同位素比值造成了不同程度的偏移。

在冷凍保存第30 天時，肌肉和性腺組織中的δ13C 值與對照組相比，分別顯著下降了 (-0.89±0.30)‰ 和 (-0.70±0.57)‰ (P＜0.05)，保存至第180 天則無顯著性變化 (P＞0.05，圖1)；在角質(zhì)顎組織中冷凍保存則始終對其δ13C 值無顯著性影響 (P＞0.05)；冷凍保存的3 種組織的δ15N 值始終表現(xiàn)為無顯著性變化 (P＞0.05，圖1)；C/N 值變化結(jié)果顯示，僅肌肉和性腺組織30 d 內(nèi)有上升趨勢 (P＜0.05)，之后保持穩(wěn)定，角質(zhì)顎則始終無顯著性變化 (P＞0.05，圖1)。

在乙醇保存條件下，肌肉組織的δ13C 值表現(xiàn)為下降后逐漸穩(wěn)定，保存第30 天的偏移量為 (-0.41±0.50)‰，而δ15N 值則相反，呈先升高后逐漸平穩(wěn)，保存第30 天的偏移量為 (0.76 ±0.79)‰，C/N 值則表現(xiàn)為隨時間變化始終增大(P＜0.05，圖1)，第30 和第180 天的偏移量分別為 0.34±0.05 和 0.36±0.23；而乙醇保存對角質(zhì)顎始終未造成顯著性影響 (P＞0.05，圖1)；在性腺組織中，其δ13C 值在第30 天時顯著低于對照組 (P＜0.05)，且在第180 天時持續(xù)降低，第30 和第180 天總偏移量分別為 (-0.36±0.44)‰ 和 (-0.83±0.64)‰，δ15N 值則始終無顯著性變化 (P＞0.05)，經(jīng)保存后的C/N 值顯著高于對照組，第30 和第180 天總偏移量分別為0.21±0.14 和0.70±0.82。

甲醛保存對3 種組織造成的影響最為顯著。相比于對照組，3 種組織在保存第30 天時表現(xiàn)出類似的變化，即δ13C 和δ15N 值顯著降低，C/N 值顯著上升 (圖1)，總偏移量分別為δ13C：(-3.03±1.87)‰，δ15N：(-0.48±0.72)‰，C/N：0.86±0.73，而保存第180 天的肌肉組織與第30 天時相比無顯著性差異 (P＞0.05)，但角質(zhì)顎的δ15N 值在第180 天出現(xiàn)上升趨勢(P＜0.05)，但與對照組無顯著性差異(P＞0.05)，角質(zhì)顎和性腺的C/N 值在保存至第180 天時表現(xiàn)出持續(xù)升高，偏移量分別為0.31±1.07 和0.21±0.79。

3 討論

穩(wěn)定同位素技術(shù)的應(yīng)用推動了海洋食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和物質(zhì)循環(huán)的深入研究，但對于測定結(jié)果是否受保存方法影響的研究仍欠缺，特別是對大洋性生物難以進(jìn)行新鮮樣本的檢測，而保存對其不同組織的潛在影響尚不清楚。現(xiàn)有研究在測定分析前對不同組織的保存方法尚未達(dá)成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這可能會影響各研究數(shù)據(jù)的可靠性與可比性，對物種營養(yǎng)級評估及生態(tài)位劃分的準(zhǔn)確性造成不利影響。本研究以大洋性頭足類的代表性物種——莖柔魚的肌肉、角質(zhì)顎和性腺組織開展比較研究，分析了-20 ℃冷凍、75%乙醇與38% 甲醛溶液對各組織穩(wěn)定同位素比值的影響及其差異。

本研究顯示，冷凍保存會在短期內(nèi)導(dǎo)致肌肉和性腺組織的δ13C 值下降、C/N 值上升，這與浮游動物[14]、帽貝(Patellavulgata)[18]以及羅氏沼蝦[15]冷凍保存的研究結(jié)果相似。冷凍保存是目前穩(wěn)定同位素研究中最常用的保存方法，一般認(rèn)為冷凍保存只會使其樣品組織內(nèi)凝結(jié)形成冰晶，使得細(xì)胞體積增大，機(jī)械性破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不會影響樣品本身的化學(xué)組成，因此在實(shí)際應(yīng)用中通常會忽略冷凍保存的潛在影響[13]。然而，F(xiàn)euchtmayr 和Grey[14]指出，冷凍保存對穩(wěn)定同位素測定結(jié)果的影響可能與細(xì)胞質(zhì)浸出有關(guān)，由于組織細(xì)胞破裂使細(xì)胞液流出，會間接導(dǎo)致脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化變性[19]，此類化學(xué)反應(yīng)過程最終可能導(dǎo)致穩(wěn)定同位素比值發(fā)生變化，但該化學(xué)過程還有待進(jìn)一步確認(rèn)。因此，未來需進(jìn)一步探究冷凍保存的影響并獲取合適的校正因子，但鑒于冷凍保存的影響程度有限，目前仍是最理想的方法。

乙醇保存常用于野外采樣，也是頭足類硬組織最常見的保存方法。本研究發(fā)現(xiàn)，乙醇保存對兩種軟組織 (肌肉和性腺) 的δ13C 值造成了顯著性影響，而硬組織角質(zhì)顎卻未受影響；Bourg 等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)乙醇保存會顯著改變海星的δ13C 值；von Endt[19]指出乙醇可能會提取多種非極性脂類，如甘油三脂；Post 等[21]證實(shí)δ13C 與生物機(jī)體的含脂量呈正相關(guān)關(guān)系。因此，用乙醇提取含有大量C 元素脂質(zhì)的軟組織 (如性腺) 后會導(dǎo)致其δ13C 值降低。本研究中乙醇未完全提取凈脂質(zhì)，這可能是導(dǎo)致其δ13C 值在180 d 后仍下降的原因。與之相反，角質(zhì)顎的主要成分為幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)[22]，因此未觀察到乙醇保存對其產(chǎn)生了影響。此外，乙醇保存對肌肉組織的δ15N 值也造成了顯著性影響，這可能是由于乙醇除了提取脂質(zhì)外，還可能會引起肌肉組織水解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)裂解而提取了部分含氮成分[23-24]，最終使δ15N 值發(fā)生變化。這也可能會間接引起軟組織中C/N 值變化?？偟膩碚f，乙醇保存可能會導(dǎo)致穩(wěn)定同位素值的偏移，因而可能會高估頭足類的營養(yǎng)級，但不同組織可能存在差異，今后應(yīng)謹(jǐn)慎使用此保存方法或在獲得合理的校正因子后使用。

甲醛作為傳統(tǒng)的樣品防腐保存試劑，常在野外采樣和博物館中應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，甲醛會顯著改變3 種組織的穩(wěn)定同位素比值和C/N 值，且偏移量高于另兩種方法，易造成其營養(yǎng)級和碳源的嚴(yán)重低估，這一現(xiàn)象在無脊椎動物[25]、底棲動物[26]的研究中也有類似報道。Bicknell 等[27]指出甲醛會促使富含δ13C 的化合物浸出，這一過程會在達(dá)到一定水平后停止而不再變化，因此，浸泡于甲醛中的組織的δ13C 值會在一定時間內(nèi)降低。Umbricht 等[26]研究發(fā)現(xiàn)甲醛導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性會造成氨基酸損失，并產(chǎn)生新的含氮物質(zhì)，這可能造成δ15N 變化。上述反應(yīng)中對C、N 元素的影響最終也會體現(xiàn)在C/N 值的變化上。值得注意的是，盡管甲醛會在30 d 內(nèi)對角質(zhì)顎的δ15N 造成顯著性影響，但在第180 天時角質(zhì)顎的δ15N 值恢復(fù)至初始值，這一現(xiàn)象可能與組織特異性有關(guān)[18,28]，具體原因仍需進(jìn)一步探究。因此，在今后采樣保存時應(yīng)盡量避免使用甲醛試劑。

本研究中3 種保存方法均會對軟組織的穩(wěn)定同位素比值造成不同程度影響，從而引起營養(yǎng)級和生態(tài)位估算的偏差。但相比于乙醇和甲醛溶液保存，冷凍保存對肌肉和性腺組織穩(wěn)定同位素測定結(jié)果的影響較小，冷凍保存作為目前最常見、便捷的保存方法，今后需進(jìn)一步探究不同保存溫度及時間對細(xì)胞物質(zhì)流出、化學(xué)組分的影響，以優(yōu)化樣品保存過程。此外，冷凍保存和乙醇保存對硬組織角質(zhì)顎均無顯著性影響，表明目前硬組織最常用的保存方法可直接用于穩(wěn)定同位素研究。綜上所述，未來仍需加強(qiáng)保存方法對不同組織穩(wěn)定同位素分析結(jié)果影響的研究，以進(jìn)一步確定適合特定物種及其組織的保存方法，或建立公式對δ13C 和δ15N 的分析結(jié)果進(jìn)行校正。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，甲醛和乙醇保存易對穩(wěn)定同位素比值造成較大的偏移量，因此在頭足類穩(wěn)定同位素研究中應(yīng)慎重選擇這兩種溶液保存樣品。鑒于3 種方法均會對軟組織 (肌肉和性腺) 穩(wěn)定同位素分析造成顯著性影響，建議對于頭足類軟組織樣品盡可能及時處理并進(jìn)行穩(wěn)定同位素比值測定，而硬組織 (角質(zhì)顎) 可采用冷凍或乙醇保存。